Спосіб індикації salmonella spp. методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі

Реферат: Спосіб індикації Salmonella spp. методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) мікроорганізмів роду Salmonella за допомогою ферментативної реакції і трьох штучно синтезованих олігонуклеотидних ланцюгів, які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки ДНК сальмонел при певних температурних і часових параметрах та кількості циклів. Для проведення полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі використовують оригінальні праймери і флуоресцентний зонд з наступною нуклеотидною послідовністю: 1) SAT FOR (5'-TAATTTCTTCCGTGGCTTCG-3'), 2) SAT REV (5'-CTTTGACTGGGACAGCAACA-3'), 3) SAT PROBE (5'-FAM-TTCCGGATAGATCAGGATGG-BHQ1-3'). UA 115440 U (12) UA 115440 U UA 115440 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології та біотехнології, зокрема до лабораторної діагностики, призначена для виявлення специфічних фрагментів нуклеїнових кислот (ДНК) бактерій Salmonella Spp, може бути використана для індикації та ідентифікації сальмонел в біологічному матеріалі, продуктах харчування, об'єктах довкілля, об'єктах ветеринарно-санітарного нагляду, в науково-дослідних роботах, в навчальних процесах. Рід Сальмонели (лат. Salmonella) - грамонегативні рухомі палички родини Enterobacteriaceae, серед якого виділяють два види: S. enterica і S. Bongori. Найбільш патогенними для людини (>99.5 %) є підвиди S. enterica (Salmonella enterica enteritidis та Salmonella enterica typhimurium). Сальмонели досить стійкі до дії фізичних і хімічних факторів довкілля. Вони можуть зберігати життєздатність у воді до 3 місяців, у м'ясі та яйцях - до 7 міс., у заморожених продуктах, у висушених фекаліях - до 2 років. У молочних і готових м'ясних продуктах сальмонели мають здатність розмножуватись. Найбільш близьким способом виявлення ДНК сальмонел за допомогою ПЛР є спосіб експрес-діагностика сальмонельозу та генотипування Salmonella enterica enteritidis та Salmonella enterica typhimuruim за допомогою мультиплексної плр (Спосіб експрес-діагностики сальмонельозу та генотипування Salmonella enterica enteritidis та Salmonella enterica typhimuruim за допомогою мультиплексної плр. Патент на корисну модель, u201308906 від 25.11.2013). Спосіб включає відбір біоматеріалу, виділення ДНК, виявлення геномної ДНК мікроорганізмів роду Salmonella, розділення продуктів ампліфікації в агарозному гелі. Недоліком найближчого аналога є те, що для візуалізації та аналізу результатів необхідним є проведення електрофорезу продуктів ампліфікації в агарозному гелі, що збільшує ризик контамінації та можливість отримання псевдопозитивних результатів дослідження. Крім того, для візуалізації продуктів ампліфікації в агарозному гелі використовують флуоресцентний інтеркалюючий барвник - бромистий етідій, який має канцерогенні властивості, що становить небезпеку для персоналу, який проводить облік результатів досліджень. У найближчому аналозі наведено можливість генотипування Salmonella enterica enteritidis та Salmonella enterica typhimuruim, однак згідно з чинними вимогами (Виявлення патогенних мікроорганізмів Salmonella - згідно ДСТУ ISO 6579:2006. Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Методика виявлення Salmonella spp. (ISO 6579:2002) та ДСТУ EN 12824:2004; Медико-біологічні вимоги та санітарні норми якості продовольчої сировини та харчових продуктів (з доповненнями в документі Мінохоронздоров'я СРСР N 122-12/805 (v_805400-91) від 19.11.91) - http://zakon2.rada.gov.ua/laws/show/v5061400-89/page; Наказ Державного департаменту ветеринарної медицини № 16 від 03.11.1998 р. Про затвердження Обов'язкового мінімального переліку досліджень сировини, продукції тваринного та рослинного походження, комбікормової сировини, комбікормів, вітамінних препаратів та ін., які слід проводити в державних лабораторіях ветмедицини і за результатами яких видається ветсвідоцтво (зі змінами, внесеними згідно з Наказами Державного департаменту ветеринарної медицини N8 (z0549-04)) від 18.11.2003 та N 107 (z1249-04) від 27.09.2004) http://zakon4.rada.gov.ua/laws/show/z0761-98) діагностика сальмонельозів передбачає виявлення Salmonella spp. В основу корисної моделі поставлено задачу створити новий спосіб виявлення Salmonella spp. в зразках біологічного матеріалу при проведенні прижиттєвої та постмортальної діагностики в продуктах харчування тваринного і рослинного походження, інших об'єктах ветеринарно-санітарного та епідеміологічного нагляду, згідно з запропонованим способом, що в досліджуваних зразках виявляють специфічні фрагменти ДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. Використання полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі зменшує ризик контамінації продуктами ампліфікації та забезпечує швидше отримання результатівдослідження порівняно із ПЛР із детекцією в агарозному гелі. Поставлена задача вирішується тим, що cпосіб індикації Salmonella spp. методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі, що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) мікроорганізмів роду Salmonella за допомогою ферментативної реакції і трьох штучно синтезованих олігонуклеотидних ланцюгів, які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки ДНК сальмонел при певних температурних і часових параметрах та кількості циклів, згідно з корисною моделлю, для проведення полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі використовують оригінальні праймери і флуоресцентний зонд з наступною нуклеотидною послідовністю: 1) SAT FOR (5'-TAATTTCTTCCGTGGCTTCG-3'), 2) SAT REV (5'-CTTTGACTGGGACAGCAACA-3'), 3) SAT PROBE (5'-FAM-TTCCGGATAGATCAGGATGG-BHQ1-3'). 1 UA 115440 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спосіб включає відбір зразків біоматеріалу, попереднє збагачення (підрощення) зразків на поживному середовищі, екстракцію ДНК, проведення полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі з оригінальними праймерами і флуоресцентним зондом, візуалізацію та аналіз результатів. Флуоресцентний зонд для детекції Salmonella spp мічений флуоресцентним барвником FAM. Запропонований спосіб індикації Salmonella spp методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі можна описати наступними прикладами. Приклад 1. Методи відбору матеріалу для проведення досліджень Для прижиттєвої діагностики сальмонельозу у в лабораторію направляють матеріал від хворих тварин, яких не піддавали лікуванню антибактеріальними препаратами, відібраний у стерильні пробірки (флакони) з гумовими пробками: а) фекалії в кількості (2-3) г, відібрані безпосередньо з прямої кишки за допомогою попередньо прокип'яченого гумового катетера або в момент дефекації; 3 б) молоко в кількості (10-15) см , взяте вибірково від (15-20) корів стада після санітарної обробки шкіри і здоювання перших порцій молока, - одна збірна проба. Залежно від поголів'я корів на фермі кількість збірних проб молока може варіювати в межах від 3 до 5. Молоко має бути доставлено в лабораторію для дослідження в день відбирання проби. За відсутності такої 3 можливості молоко консервують кристалічною борною кислотою (0,1 г на 10 см ). Консервоване молоко придатне для дослідження протягом 10 днів. Для посмертної (постмортальної) діагностики в лабораторію направляють матеріал від загиблих або вимушено забитих тварин, бажано, яких не піддавали лікуванню антибактеріальними засобами. Трупи дрібних тварин (поросят, хутрових звірів, птахів та ін.) направляють цілими (2-4 тушки). Від великих тварин відбирають наступний матеріал: серце, перев'язане лігатурою поблизу розрізу судин і аорти; селезінку; частку печінки з жовчним міхуром; нирку; уражені ділянки тонкого або товстого відділу кишечнику з вмістом, перев'язані з двох кінців лігатурою, разом з мезентеріальними лімфатичними вузлами (в окремому посуді або поліетиленовому пакеті); голову; трубчасту кістку; підщелепні лімфатичні вузли; у свиней і поросят ще й зіскрібки з задньої стінки глотки, з поверхні кореня язика і глоткових мигдалин, взяті стерильним скальпелем. Для діагностики сальмонельозу птахів з неблагополучних секцій пташника направляють по (3-5) свіжих трупів або (3-5) птахів з клінічними ознаками діареї. Хвору птицю забивають у лабораторії і піддають патологоанатомічному і бактеріологічному дослідженню. Проби м'ясної сировини, молока і вершків для бактеріологічного дослідження відбирають згідно з правилами і в кількостях, передбачених наступними ДСТУ: - ДСТУ ISO 707-2002 (ISO 707:1997, IDT) Молоко та молочні продукти. Настанови з відбирання проб. - ДСТУ ISO 5538:2004 (ISO 5538:1987, IDT) Молоко та молочні продукти. Відбирання проб. Контроль за якісними ознаками. - ДСТУ ISO 8197:2004 (ISO 8197:1988, IDT) Молоко та молочні продукти. Відбирання проб. Контроль за кількісними ознаками. - ГОСТ 7702.0-74 Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические методы оценки качества (М'ясо птиці. Методи відбору зразків. Органолептичні методи оцінки якості). - ГОСТ 7702.2.0-95 "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям". - ДСТУ EN 12824:2004 Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення Salmonella. - ДСТУ ISO 6887 Мікробіологія. Загальна настанова для готування розведень для мікробіологічної експертизи. - ДСТУ ISO 7218 Мікробіологія продуктів харчування і кормів для тварин. Загальні правила для мікробіологічних експертиз. - ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов (ГОСТ 26668-85 Продукти харчові та смакові. Методи відбору проб для мікробіологічних досліджень). - ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов (ГОСТ 26669-85 Продукти харчові та смакові. Підготовка проб для мікробіологічних досліджень). - ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов (ГОСТ 26670-91 Продукти харчові. Методи культивування мікроорганізмів). 2 UA 115440 U 5 10 15 20 25 Коренеплоди, що зберігаються в овочесховищах або буртах, піддають дослідженню не раніше, ніж через 30 днів після їх закладки. Проби рослинних кормів для дослідження відбирають згідно з такими ДСТУ: - ДСТУ ISO 6497:2005 Корми для тварин. Методи відбирання проб. - ДСТУ 4984:2008 Буряки цукрові. Методи відбирання та готування проб коренеплодів для визначання технологічних показників їхньої якості. - ДСТУ ISO 874-2002 Фрукти та овочі свіжі. Відбирання проб. - ГОСТ 27262-87 Корма растительного происхождения. Методы отбора проб. Приклад 2. Попереднє збагачення (підрощення) зразка на поживному середовищі. Гомогенізувати 25 г зразка в 225 мл поживного середовища та відфільтрувати. Інкубувати на шейкері при 36±1 °C протягом 8 год. Приклад 3. Екстракція ДНК: 1 мл збагаченого (підрощеного) зразку центрифугувати при 13,5 тис. об/хв. протягом 2 хв. і видалити супернатант. Додати по 200 мкл ТЕ-буферу та інкубувати у термостаті при 95 °C протягом 5 хв. Центрифугувати при 5,0 тис. об/хв. протягом 2 хв. і відібрати 180-190 мкл супернатанту. Приклад 4. Проведення полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. Приготувати реакційну суміш для досліджуваних зразків із розрахунку 19,8 мкл ПЛР-суміші та 0,2 мкл ферменту Taq-полімерази на один зразок. 96-лунковий планшет для ПЛР, або відповідну кількість 8-ми лункових стрипів помістити у спеціальний штатив із охолодженням, у лунки за допомогою автоматичного дозатора послідовно внести по 20,0 мкл ПЛР-суміші та додати по 5,0 мкл екстрагованої ДНК. У лунку, яка призначена для позитивного контролю, внести 5,0 мкл реактиву "позитивний контроль", а у лунку, яка призначена для негативного контролю, внести 5,0 мкл реактиву "негативний контроль". Включити прилад для проведення ПЛР у реальному часі, помістити реакційний планшет у блок для зразків; відкрити програмне забезпечення до приладу, створити планшетний документ. Згідно з настановою до приладу, задати температурний профіль (табл. 1). Табл. 1. Температурний профіль ампліфікації Таблиця 1 Температурний профіль ампліфікації Стадія 1 2 Режим ампліфікації Температура, °C Час, с 94 300 95 20 56 20 72 30 Процес Число циклів активація полімерази денатурація ДНК відпалювання праймерів* елонгація 1 40 Примітка * стадія, на якій здійснюється реєстрація даних флуоресцентного сигналу 30 35 40 45 Приклад 5. Інтерпретація одержаних результатів: основним критерієм оцінки отриманих результатів є визначення граничного циклу (Сt), що характеризує певний цикл полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі, на якому відмічається статистично достовірне збільшення флуоресценції порівняно із фоновим рівнем. Для інтерпретації результатів дослідження проводиться аналіз кривих ампліфікації контролів та невідомих зразків: у позитивному контрольному зразку присутня ампліфікація за барвником FAM (детекція Salmonella spp); у негативному контрольному зразку відсутня ампліфікації за барвником FAM; зразок вважається позитивним, якщо відмічається ампліфікація за барвником FAM при значенні Ct  35; зразок вважається негативним, у якого відсутня ампліфікація за барвником FAM. Результати аналізу не враховуються: при відсутності ампліфікації за барвником FAM у позитивного контролю; при наявності ампліфікації за барвником FAM у негативного контролю; при великій розбіжності значень граничного циклу Ct у повторах (SD>0,5). В цих випадках проводиться повторна екстракція ДНК та постановка полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. Приклад 6. Дослідження специфічності запропонованого методу на основі полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі для виявлення Salmonella spp. Для дослідження використовували різні штами Salmonella та інших збудників харчових токсикоінфекцій. Результати представлені в табл. 2. 3 UA 115440 U Таблиця 2 Результати дослідження специфічності методики ідентифікації Salmonella spp за допомогою ПЛР в реальному часі № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 5 Збудник S. Choleraesuis S. Indica S. Dublin S. Poona S. Typhimuruim S. Enteritidis B. Subtilis P. Multicida Rodococcus Equi E. Coli St. Aureus L. Monocytogenes Результат дослідження ПЛР в реальному часі Значення CtFAM (цільова послідовність) Результат 16,17 Позитивний 20,97 Позитивний 25,76 Позитивний 20,08 Позитивний 28,19 Позитивний 30,25 Позитивний Негативний Негативний Негативний Негативний Негативний Негативний Технічний результат запропонованого способу індикації Salmonella spp. методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі полягає в тому, що цей спосіб визначення Salmonella spp. може бути використаний для індикації та ідентифікації сальмонел в біологічному матеріалі, продуктах харчування, об'єктах довкілля, об'єктах ветеринарно-санітарного нагляду, в науково-дослідних роботах, в навчальних процесах. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 20 Спосіб індикації Salmonella spp. методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі, що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) мікроорганізмів роду Salmonella за допомогою ферментативної реакції і трьох штучно синтезованих олігонуклеотидних ланцюгів, які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки ДНК сальмонел при певних температурних і часових параметрах та кількості циклів, який відрізняється тим, що для проведення полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі використовують оригінальні праймери і флуоресцентний зонд з наступною нуклеотидною послідовністю: 1) SAT FOR (5'-TAATTTCTTCCGTGGCTTCG-3'), 2) SAT REV (5'-CTTTGACTGGGACAGCAACA-3'), 3) SAT PROBE (5'-FAM-TTCCGGATAGATCAGGATGG-BHQ1-3'). Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4