Спосіб прогнозування наслідків гострого вірусного гепатиту в

Спосіб прогнозування наслідків гострого вірусного гепатиту В шляхом дослідження показників крові, який відрізняється тим, що в сироватці крові визначають рівень цитокінів ІЛ-1 , ФНП- , 3 (ІЛ-1 ). ІЛ-1 належить роль в активації Тлімфоцитів, які можуть запускати клітинну і гуморальну імунну відповідь. Від збалансованості цих двох основних компонентів і залежить перебіг і результат інфекційного процесу. Відомо, що завершення імунної відповіді при вірусних інфекціях також залежить від формування в остаточному результаті повноцінної антитільної відповіді, яка визначається диференціюванням В-лімфоцитів, прямо активованих ІЛ-6. Незважаючи на те, що більшість патогенетичних механізмів дії ІЛ-1 , ІЛ-6, ФНП- , ІЛ-2 та ІЛ-4 добре вивчені, роль цих прозапальних та протизапальних цитокінів при ГГВ вивчена недостатньо. У ході аналізу отриманих даних динаміки вмісту основних регуляторних цитокінів у хворих ГГВ, були виявлені три типи імунного реагування: І нормореактивний тип (помірне підвищення прозапальних цитокінів та цитокінів ІЛ-2, ІЛ-4), II - дисоціативний (високі показники прозапальних цитокінів на фоні низьких значень цитокінів ІЛ-2, ІЛ-4) та III - гіпореактивний (низькі концентрації як прозапальних, так і протизапальних цитокінів). Нормореактивний тип імунного реагування у хворих на ГГВ дозволяє прогнозувати гострий та гладкий перебіг захворювання з відсутністю затримки одужання, а гіпореактивний та дисоціативний тип імунної відповіді дають підстави прогнозувати затяжний варіант перебігу ГВ. Спосіб, що заявляється, виконують таким чином. Матеріалом для дослідження була сироватка крові хворих на ГВГВ, отримана в період розпалу захворювання (І період) і в період реконвалесценції (ІІ період). Кров для дослідження брали із ліктьової вени натще у спеціальну стерильну пробірку із антикоагулянтом (розчин гепарину 0,1мл) у кількості 10мл. Після інкубації та центрифугування отримували сироватку, яку розливали у пробірки типу "Епендорф" по 1,5мл. Зберігали зразки при 60°С. Допускалося тільки одноразове розмороження сироватки безпосередньо перед використанням. Для дослідження сироваткового рівня ІЛ-1 , ФНП- , ІЛ-6, ІЛ-2, ІЛ-4 використовували тестсистеми ООО "Протеиновый контур" (СанктПетербург, Росія), користуючись інструкцією виробника. В даних тест-системах використовують твердофазний імуноферментний метод із застосуванням пероксидази хрону як індикаторного ферменту. Один тип антитіл імобілізують на внутрішніх поверхнях планшетів для мікротитрування. Інший тип моноклональних антитіл до незалежного епітопу молекули інтерлейкіна знаходяться у наборі у вигляді кон'югата з біотином. Індикаторним компонентом є кон'югат пероксидази хрону зі стрептавідином, що має дуже високу спорідненість з біотином. Після інкубації і промивання в лунки вносять кон'югат пероксидази зі стрептавідином, знову інкубують, промивають, вносять субстрат і вимірюють активність зв'язаної пероксидази з використанням автоматичного фотометра для мікропланшетів. Дослідження проводилось з використанням безпосередньо нерозчинених зразків сироватки 15844 4 крові людини. Нерозбавлені зразки розморожували дуже швидко за допомогою теплової обробки на водяній бані при температурі 37 С, щоб запобігти осадженню фібриногену. До початку роботи всі реагенти необхідно довести до кімнатної температури і приготувати потрібну кількість буферних розчинів. Для цього розчиняють концентрати у відповідному співвідношенні дистильованою водою. Розкривають пакет із планшетом і відбирають необхідну кількість стрипів. Двічі промивають лунки, додаючи по 300мкл буферу для промивання в кожну лунку і проводячи повну аспірацію рідини. Розбавляють 1:40 необхідну для аналізу кількість кон'югата з розрахунку 3,2мл готового розчину на 1 здвоєний стрип, добре перемішують отриманий розчин, після чого розчиняють вміст ампул зі стандартними препаратами, вносячи по 1мл буферу С для зразків у кожну лунку. В лунки планшету A1-D1 вносили по 200мкл стандартів інтерлейкіну, в осередок Е1 внесли по 200мкл буфера С (стандарт 0), і в лунки мікропланшета, що залишилися, вносили досліджувані зразки в об'ємі 200мкл. Після цього інкубують 1 годину при +37°С. Видаляють рідину з лунок, тричі промивають їх буфером В (300мкл на одну лунку) і двічі - дистильованою водою. Проводять повну аспірацію рідини, що залишилася. Розбавляють 1:40 необхідну для аналізу кількість кон'югата стрептавідину із пероксидазою хрону буфером С і вносять по 200мкл розчину в кожну лунку мікро планшета й інкубують 30хв при кімнатній температурі і безупинному струшуванні. Далі змішують в рівних співвідношеннях розчини з маркіруванням "субстрат" і "реагент", з огляду на, те що на 1 здвоєний стрип потрібно 3,2мл готового розчину. Видаляють рідину з осередків і тричі промивають їх буфером В (300мкл на одну лунку). Проводять повну аспірацію решти рідини і двічі промивають лунки планшету струменем дистильованої води. Висушують планшет шляхом постукування по поверхні лабораторного столу, покритого фільтрувальним папером, і вносять в усі лунки по 200мкл розчину субстрату з барвником. Після цього інкубують стрипи 10-20хв при кімнатній температурі у захищеному від прямих сонячних променів місці на шейкері. Зупиняють реакцію додаванням 50мкл розчину сірчаної кислоти в кожну лунку. Далі роблять облік результатів з використанням автоматичного фотометра для мікропланшетів при довжині хвилі 450нм, встановлюючи нульове поглинання по лунці зі стандартом 0. Будують калібровану криву "оптична щільність/концентрація", користаючись даними по концентраціях, зазначених для розчинів стандартів, і визначають графічно концентрацію інтерлейкіну у зразках. У результаті проведених досліджень контрольної групи були встановлені показники, прийняті для здорових осіб: ІЛ-1 - 35,49±3,1пкг/мл; ФНП- 37,83±2,7пкг/мл; ІЛ-6 - 4,85 1,1пкг/мл; ІЛ-2 38,26±1,3пкг/мл; ІЛ-4 - 18,73±1,5пкг/мл; СРБ 3,19±1,02мг/л; N0 - 2,83±0,25мкмоль/л. 5 15844 Аналізуючи отримані дані динаміки вмісту основних регуляторних цитокінів у хворих ГГВ, були виявлені три типи імунного реагування: І - нормореактивний тип (помірне підвищення прозапальних цитокінів та цитокінів ІЛ-2 і ІЛ-4), II - дисоціативний (високі показники прозапальних цитокінів на фоні низьких значень цитокінів ІЛ-2 і ІЛ-4) та III гіпореактивний (низькі концентрації як прозапальних, так і протизапальних цитокінів). У хворих із встановленим гіпореактивним типом імунного реагування рівні регуляторних цито 6 кінів коливались у межах значень, які відповідали показникам контрольної групи (рівень ІЛ-1 коливався від 28,91 до 40,18пкг/мл; ФНП- - від 26,16 до 39,4пкг/мл; ІЛ-6 - від 4,1 до 5,12пкг/мл; ІЛ-2 від 33,34 до 42,32пкг/мл; ІЛ-4 - від 14,54 до 20,8пкг/мл), що є підставою прогнозувати можливу хронізацію процесу, оскільки 80% пацієнтів даної групи спостерігалася трансформація у хронічний перебіг ВГ. Таблиця 1 Рівні регуляторних цитокінів у хворих із нормореактивним типом імунної відповіді у розпалі ГВГВ Групи Легкий перебіг (n=51) Середньотяжкий перебіг (n=50) Контроль(n=20) ІЛ-1 (пкг/мл) 136,37± 12,4* 202,83± 15,4*1 35,49±3,1 ФНП- (пкг/мл) 59,01± 5,4* 74,4± 6,2*1 37,83±2,7 ІЛ-6 (пкг/мл) 20,08± 2,3* 21,15± 2,3* 4,85±1,1 ІЛ-2(пкг/мл) 131,1± 10,5* 205,7± 13,7*1 38,26±1,5 ІЛ-4(пкг/мл) 83,18± 4,9* 111,8± 7,6*1 18,73±1,5 Примітки: 2. * - р