Штам бактерій escherichia coli hm-2 для виготовлення бактерійних препаратів

Штам Eschenchia coli для виготовлення бактерійних препаратів, депонований у Депозитарії Інституту мікробіологи і вірусології НАН України під номером 1MB В-7049. Корисна модель належить до мікробіологи, конкретніше до штамів мікроорганізмів, утримування або консервування мікроорганізмів і може бути використаний для виробництва антагоністичних бактерійних препаратів, біологічно активних добавок, призначених для лікування дисбактеріозів та відновлення нормальної мікрофлори. Дисбактерюзи обумовлені порушеннями якісного і кількісного складу мікрофлори людського організму. Причинами виникнення дисбактеріоз їв можуть бути: тривале застосування антибіотиків й антисептиків; зниження місцевого і загального імунітету, викликаного радіотерапією, гормонотерапією; застосування імунодепресантів, інфекційні захворювання; неповноцінне і нераціональне харчування; несприятливі соціально-економічні та екологічні умови тощо. Для проведення активної профілактики та ефективної корекції порушеної мікробіологічної рівноваги одним з найбільш ефективних засобів корекції є пробютики. Серед пробіотиків важливими є непатогенні живі бактерії виду Escherichia coli, а також бактерійні концентрати та більш складні композиції. Відомий штам бактерій Eschenchia coli M17, що є головним компонентом лікувального препарату "Колібактерин сухий" (див. інструкцію для медичного застосування препарату Колібактерин сухий (Colibactennum siccum), затверджену Головним державним санітарним лікарем України 7 лютого 2001р.). Колібактерин сухий призначають для лікування дорослих і дітей, починаючи з 6місячного віку, а також при затяжному і хронічному перебігу дизентерії, післядизентерійному коліті, доліковуванні реконвалесцентів після гострих кишечних інфекцій, при тривалій кишковій дисфункції невизначеної етіології, при неспецифічних і спе цифічних хронічних колітах і ентероколітах, при наявності дисфункцій І дисбактеріозу. Проте, в описі до патенту Російської Федерації №2065875, МПК6 C12N1/20, А61К35/74, 1996 рік, стверджується, що штам Escherichia coli M17 протягом 50-ти років використовується для виробництва колібактерину. Автори цього патенту вважають, що цей штам історично застарів, не адаптований до сучасних умов навколишнього середовища, має недостатню стійкість до дії фізико-хімічних факторів. Відомі штами бактерій Eschrichia coli 57 і Eschenchia coli 103, що депоновані у Всеросійській колекцм мікроорганізмів і мають реєстраційні номери ВКПМ В-7386 і ВКПМ В-7388 (патент Російської Федерації №2140450, МПК6 C12N1/20, С12Р13/06, 1999 рік). Ці штами не мають істотних розходжень у культурально-морфологічних і фізюлого-біохімічних ознаках, одержані шляхом відбору мутантів, здатних до продукції L-лейцину, використовуючи як батьківський штам бактерії роду Escherichia, стійкі до лейцину. Причинами, що перешкоджають одержанню потрібного технічного результату є те, що штами з реєстраційними номерами ВКПМ В-7386 і ВКПМ В7388 призначені для мікробіологічного виробництва L-лейцину і не можуть бути використані як пробіотики. За прототип вибрано штам бактерій Eschenchia coli ЛЭГМ N 18 депонований 8 червня 1992 року у Всесоюзній колекції промислових мікроорганізмів інституту "ВНИИ генетика" під №В6240 (патент Російської Федерації №2065875, МПК6 C12N1/20, A61K35/74//(C12N1/20. C12R1 19), 1996 рік). Штам Escherichia coli ЛЭГМ N 18 має yd властивості, характерні для сімейства CM CM 2492 Enterobactenaceae, роду Eschenchia і є типовим представником виду Eschenchia coll commune Штам ЛЭГМ N 18 був виділений при плановому поглибленому медичному обстеженні здорової людини в бак лабораторп СЕС м Пермі Російської Федерації Це обумовлює властиву цьому штаму природну приживлюваність в організмі людини Вихідний матеріал (випорожнення людини) розводили в пробірці фізіологічним розчином приблизно в 10 разів Після відстоювання брали бактеріологічною петлею з поверхні краплю рідини і робили лосш штрихом на 2 чашки Петрі з диференційнодіагностичним середовищем Ендо для одержання ізольованих колоній Після доби росту при +37°С вибирали характерну за ЗОВНІШНІМ ВИГЛЯДОМ КОЛО НІЮ (темно-червоний з металевим блиском) і використовували п для одержання чистої культури висівом на скошений м'ясо-пептонний агар Потім визначили видову приналежність виділеного штаму за системою Тімац'а Виділений штам мав такі ознаки Культурально-морфолопчні ознаки Під мікроскопом - це короткі з округлими кінцями рухливі палички з розмірами 0,5 х 1,5ц, розташованими в мазку у вигляді окремих клітин або невеликих скупчень Грамнегативні, спор не утворюють, капсули не мають На повноцінному агаровому середовищі через 18-20 годин росту при температурі +37°С утворюють гладкі, круглі з рівними краями колони діаметром 2,0-2,5мм У рідкому повному середовищі (м'ясо-пептонний бульйон, казеїновий гідролізат) викликають рівномірне помутніння БІОЛОГІЧНІ ознаки Штам не утилізує цитрат і малонат натрію, не утворює ацетон на середовищі Кпарка, розкладає лактозу при +42°С, не продукує оксидазу В органічному середовищі продукує індол, не утворює сірководень, не розкладає сечовину, не продукує фенілаланіндезаміназу Штам не володіє желатиназною активністю, не ферментує лізин, розщеплює глюкозу, лактозу, маніт, сахарозу до кислоти і газу Таким чином, штам ЛЭГМ N 18 є видотиповим за своїми біохімічними властивостями Повна ВІДПОВІДНІСТЬ ознакам, що необхідні для кишкової палички, дала підставу для розгорнутої перевірки виділеного штаму за всіма характеристиками, необхідними для якісного виробничого штаму, а саме вивчення динаміки розвитку на рідкому і щільному живильному середовищах, антагоністична активність відносно супутньої умовно патогенної мікрофлори, наявність певного рівня СТІЙКОСТІ до основних антибіотиків чутливість до КОЛІЦИНІВ, СТІЙКІСТЬ до дії фізиКО-ХІМІЧНИХ факторів (УФ опромінення, активний хлор) нешкідливість, тобто відсутність токсичності й антигенних показників, властивих умовно патогенним мікроорганізмам За твердженням авторів штам Eschenchia colt ЛЭГМ-18 має високі репродуктивні властивості, високу антагоністичну активність у відношенні хвороботворних шигел Флекснера і Зонне, підвищену СТІЙКІСТЬ до 9 типів КОЛІЦИНІВ, абсолютно нечутливий до п'яти І має підвищену резистентність до інших антибіотиків, має підвищену СТІЙКІСТЬ ДО дії активного хлэру й УФ опромінення Причинами що перешкоджають одержанню потрібного технічного результату є істотна геогра фічна віддаленість від України місця створення прототипу і, ВІДПОВІДНО, проблематичність ефективного використання штаму Eschenchia cod ЛЭГМ18 в Україні В основу корисної моделі поставлено задачу віднайти такий штам виду Eschenchia coli, який здатний бути ефективним пробіотиком для регіонів України при лікуванні дисбактеріоз їв і хвороб, обумовлених порушеннями нормального балансу мікрофлори організму Поставлена задачу вирішує штам Eschenchia coli НМ-2 для виготовлення бактерійних препаратів Штам Eschenchia coli НМ-2 ідентифіковано і вивчено авторами в лабораторії науковометодичного центру «Бюкорекція» м Київ, узвіз Протасів Яр Штам Eschenchia cod НМ-2 депонований у ДепозитарГі Інституту мікробіолог» і вірусологи НАН України під номером 1MB В-7049 Дата надходження 27 червня 2002 року Штам ізольовано авторами із мікрофлори травного тракту людини Культурально-морфолопчні та фізюлогобюхімічні особливості штаму Грамнегативні рухливі палички розмірами 1,0-1,5x2,0-6 Омкм (живі клітини, Ендо, МПБ) або 0,6-0,8x1,0-1,2мкм, рідше 1,5мкм (фіксовані клітини, МПА) з грануляцією при фарбуванні по Граму, розміщуються по одному, парами, спор не утворюють Факультативний анаероб Колони добре ростуть на простих живильних середовищах з пептоном та м'ясною водою При вирощуванні на поверхні агаризованого середовища Ендо утворюють типові випуклі червоні гладенькі блискучі колони 3-5мм у діаметрі з характерним металічним блиском На МПА виростають білуваті кругле блискучі колон» з рівними краями діаметром 1,0-3,0мм Колон» легко суспендуються у фізіологічному розчині У бульйоні утворюють однорідну каламуть Желатину не розріджують, містять каталазу Утворюють індол, не продукують сірководень, не розщеплюють сечовину, оксидазонегативні Молоко сквашують через 24 години росту, накопичуючи кислотність 60-80 градусів Тернера Позитивна реакція з метиловим червоним Оптимальний ріст при 37-38°С Оптимальні для росту значення рН7,0-7,6, граничні значення рН4 5-9,0 Зброджують глюкозу з утворенням газу Зброджують вуглеводи і спирти глюкозу, лактозу, маніт, сорбіт, рамнозу, Не зброджують целобіозу Галузь використання штаму харчова промисловість та медицина Продукти, що синтезує штам Штам продукує молочну кислоту та коліцини, які лізують патогенні бактерії, особливо лактозонегативні та гемолітичні Е coli Антагоністична активність Зони пригнічення росту при визначенні методом дисків з культурою кишкової палички на газоні тест-культур складають 6-8мм Специфічна активність Рівень адгезн (пстадгезн) клітин кишкових мікробів, зокрема Eschenchia coli НМ-2, характеризує їх колонізаційну активність Рівень адгезн визначали на свіжоекстірпованих кишечниках мишей за методом В П ЖалкоТитаренко ВМ Бондаренко, А В Григор'єва, Л Г 2492 Купчинського. Метод складається з 9 окремих стадій: готування мікробної суспензії; передопераційної підготовки тварини; евтаназія; препарування кишечнику, його канюлізація; введення мікробної суспензії; витримування при зниженій температурі; відмивання; триптична дезінтеграція; посів. Результати розраховували за формулою В.П. Жал ко-Титарен ко: r m a x " m v ' m-V 1-а 6 де: Стах - рівень гістадгезії в кількостях КУО на г мм поверхні слизової, m - концентрація мікробів в дезінтеграті, V - об'єм дезінтеграту, І - довжина екстірпованого відрізка кишки, а - ширина екстірпованого відрізка кишки. Гістадгезійна активність штаму залежить від концентрації Escherichia coli HM-2 в порожнині кишки - К, за співвідношенням: Cmax = U K де: u - коефіцієнт гістадгезїї, що обчислюється за результатами досліду за формулою: м = К Специфічна, колонізаційна (гістадгезійна) активність штаму наведена в таблиці 1. Таблиця 1 Гістадгезійна активність штаму Escherichia coii HM-2 Концентрація бактерій штаму в млн/мл 0,1 1,0 10,0 100,0 Рівень гістадгезії в КУО на кв.см слизової 750±360 1530±765 30400±1520 67900+3380 Для визначення конкурентноздатності штаму за сайти адгезії в кишечнику обчислено показник конкуренції порівняно з вірулентними шигелами Флекснера, що мають 11=0,03. Показник конкуренції: Ц(штаму) _ 0,36 и(шигел) ~ 0,03 Це означає, що за адгезивними властивостями штам Escherichia coli HM-2 перевищує збудника дизентерії у 12 разів. Спосіб, умови та склад середовища для культивування штаму. Штам культивують при 37°С протягом 24-48 годин на поверхні агаризованих середовищ або в рідких середовищах. Використовують середовища Ендо, МПА і МПБ, стерильне знежирене молоко, відновлене 10% знежирене молоко. Культуру пересівають раз на місяць. Спосіб, умови та склад середовища для довгострокового зберігання штаму. Культуру вирощують при оптимальних умовах на МПА, МПБ. Зберігають при кімнатній або +4°С протягом 6 місяців у пробірках з корковими або гумовими пробками. Клітини можна сублімаційне висушувати після заморожування до -35°С і зберігати протягом 3-5 років. Для ліофілізації культуру вирощують протягом 24 годин на агаризованому середовищі і клітини суспендують у захисному середовищі. Захисне середовище: сахароза 10%, желатина 1%, вода дистильована до 100%, рН 7,0-7,2. Культура добре зберігається протягом 1-2 років в МПБ з 10% гліцерину при -80°С. Відомості про патогенність. Щоб підтвердити відсутність патогенної дії Escherichia coli HM-2 на Середнє значення коефіцієнту гістадгезії U 0,36+0,17 теплокровні лабораторні тварини для досліджень брали максимальні дози клітин. Визначали вірулентність суспензії активних клітин, а також інвазивність штаму шляхом дослідження взаємодії між макроорганізмом і мікроорганізмом. Перевірку патогенних властивостей штаму виконано з використанням безпородних білих мишей вагою 20±2г шляхом введення суспензій клітин перорально через зонд та внутрішньочеревинно в ін'єкціях. Нагляд за тваринами, які були протягом 15 діб адаптовані до умов утримання, проводили щоденно протягом 15-20 днів після ін'єкцій. Для визначення вірулентності брали суспензії активних клітин, отриманих при культивуванні штаму в аеробних умовах протягом 24 годин на агаризованому живильному середовищі (МПА) при температурі 37±1°С. Суспензію готували на стерильному фізіологічному розчині, концентрацію клітин визначали за допомогою оптичного стандарту мутності та контролювали титруванням. Суспензію клітин вводили перорально через зонд та внутрішньочеревинно в ін'єкціях. Інвазивність штаму визначали з урахуванням можливих природних шляхів надходження мікроорганізмів в макроорганізм, а саме по спроможності клітин проникати всередину тканин органів тварин після зараження per os. Мишам вводили одноразово активну культуру бактерій в максимальних дозах, які не призводять до загибелі тварин. Через 15-20 діб після зараження проводили мікроскопічні дослідження пофарбованих препаратів матеріалу та висіви на живильний агар (МПА, агар Ендо) зразків тканин внутрішніх органів тварин. У період спостереження після перорального уведення суспензії живих клітин бактерій усі тварини були активними, добре поїдали корм, фізіологічні відправлення у них не порушувались, поведінкові 2492 реакції були звичайними, змін з боку хутряного покрову не помічено. Клінічних ознак токсикозу не відмічено. Була відсутня достовірна різниця в масі тіла та температурі дослідних і контрольних тварин, а також в загальному стані та поведінці. Внутрішньочеревинне введення концентрованої суспензії клітин в дозах 0,510 9 , 110 9 та 510 9 клітин на мишу призводило до захворювання та падежу відповідно 20, 70 і 100% тварин на наступний день після ін'єкцій. Результати досліджень наведено у таблиці. За результатами дослідження гострої токсичності було визначено для культури Escherichia coli НМ-2 JVW=0,77x10 9 клітин/мишку. Безслорові мікроорганізми вважаються 6 не вірулентними, якщо ЛДбОа/ч більше 10 клітин/мишку (Методические указания по гигиенической оценке микробных средств защиты растений от насекомых и болезней на основе нестгарообразующих микроорганизмов. Киев, 1982. Методические указания по экспериментальному обоснованию ПДК микроорганизмов-продуцентов и содержащих их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды М., 1991). Мікробіологічні дослідження внутрішніх органів дослідних тварин через 19 діб після внутрішньочеревинного введення суспензії живих клітин культури показали, що даний штам не інвазивний, не дисемінує і не розмножується в організмі тепло 8 кровних при пероральному введенні культури. Результати дослідження наведено у таблиці 2. Отримані результати свідчать про авірулентність Escherichia coli НМ-2 для досліджених теплокровних тварин (ЛД50в/ч=0,77109 клітин/мишу, ЛД5орего5>310 клітин/мишу). Всі миші, що залишились живими після закінчення терміну спостережень, і контрольні в тому числі, були вбиті, проведено їх розтин і дослідження внутрішніх органів. Відсутність інфекційної патології і ознак ураження дослідних тварин було підтверджено при макроскопічному вивченні внутрішніх органів. Результати розтину показали: серце звичайної форми і розміру; легені в об'ємі не збільшені, долі легко відокремлюються одне від одного, поверхні гладенькі, спайок не відмічено; шлунок, петлі тонкого і товстого кишечнику зовні є звичайними, на розрізі малюнок слизової незмінений; печінка темно-червоного кольору, нормальної консистенції, середнього кровонаповнення, не збільшена, поверхня гладенька; нирки звичайних розмірів і форми, поверхні гладенькі; селезінка не збільшена, консистенція туга, на розрізі пульпа помірно повнокровна і темного кольору. Таблиця 2 Результати дослідження вірулентності штаму Escherichia coli НМ-2* Дослід: Матеріал для введення Суспензія активних 24годинних клітин -"_иКонтроль: Фізіологічний розчин Кількість мишей, штук мл млрд. клітин 10 10 10 10 10 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1,0 5,0 0,5 1,0 в/ч в/ч в/ч per os per os 1 1 1 3 3 10 10 0,5 0,5 0 0 в/ч per os 1 3 КІЛЬКІСТЬ мишей Доза Курс Шлях Захворіло введенвведення ня, діб штук Загинуло Вижило штук штук 2 7 10 0 0 2 7 10 0 0 8 3 0 10 10 0 0 0 0 10 10 Примітка: в/ч - внутрішньочеревний! ін'єкції, per os - введення в шлунок з допомогою зонда. Отже, культура Escherichia coli НМ-2 належить до групи авірулентних мікроорганізмів, не здатних до інвазії у внутрішні органи. Штам непатогенний. Генетичні особливості штаму (ауксотрофність, резистентність до антибіотиків, фапв тощо): Штам не піддавався впливу мутагенних факторів. Резистентний до ампіциліну, офлоксацину, доксицикліну. Далі наведено приклади використання штаму, що заявляється. Приклад 1. Виготовлення бактерійного препарату. Для накопичення біомаси мікроорганізмів виготовляли середовище культивування, основою якого є в\д новлене знежирене молоко, білки якого гідролізовані протосубтиліном, з додаванням лактози, лимоннокислого натрію, сірчанокислого заліза та стимуляторів росту. У підготовлене поживне середовище вносили посівний матеріал. Для виготовлення посівного матеріалу (Інокуляту) бактерій Escherichia coli НМ-2, 5% добової культури, що була вирощена у середовищі Ендо, додавали у виготовлене середовище культивування для накопичення біомаси. Культивування здійснювали протягом 36 годин при температурі 35±1°С. Накопичену біомасу мікроорганізмів відокремлювали від культурального середовища на центрифузі. Одержану біомасу мікроорганізмів суспендували у сте 10 2492 рильному водному розчині захисного середовища, що містить 5% сухого знежиреного молока, 8% сахарози, 4,5% натрію лимоннокислого. Одержану таким чином суспензію заморожували в морозильній шафі при температурі мінус (35±5)°С і висушували в сублімаційній сушарці. Одержаний бактерійний препарат містив 5108КУО/г непатогенних бактерій Eschenchia coli HM-2. Приклад 2. Виготовлення двохкомпонентного бактерійного препарату. Одержану за прикладом 1 біомасу непатогенних бактерій Eschenchia coli HM-2 змішували у співвідношенні 4:1 з біомасою штаму непатогенних бактерій Enterococcus faecium HM-5, що був депонований у Депозитарії Інституту мікробіології І вірусологи НАН України під номером 1MB В7029 26 червня 2002 року. Одержану суміш мікроорганізмів суспендували у стерильному водному розчині захисного середовища, що містить 5% сухого знежиреного молока, 8% сахарози, 4,5% натрію лимоннокислого. Одержану таким чином суспензію заморожували в морозильній шафі при Комп'ютерна верстка Н. Лисенко температурі мінус (35±5)°С висушували в сублімаційній сушарці. Приклад 3. Виготовлення біологічно активної добавки. Ліофілізовану суміш непатогенних бактерій Escherichia coli HM-2 та Enterococcus faecium HM-5, що була одержана за прикладом 2 змішували із стеаратом кальцію, цукром молочним і порошком листя та стебел Silybum mananum у такому співвідношенні, % мас: ліофіпізована суміш мікроорганізмів Escherichia coli HM-2 і Enterococcus faecium HM-5 10,0, стеарат кальцію 1,0, цукор молочний 20,0, порошок листя та стебел Silybum marianum 69,0. Виготовлена біологічно активна добавка - сірувато-зелений порошок, з характерним приємним смаком і запахом. За мікробіологічними показниками біологічно активна добавка відповідає таким вимогам: загальна кількість життєздатних мікроорганізмів становить 1 106-1 108КУО/г. Підписне Тираж 38 прим. Міністерство освгти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м. Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Сім'ї Хохпових, 15, м. Київ, 04119