Спосіб одержання з рослин лікарського препарату з жовчогінною, гепатозахисною, антиоксидантною та антимікробною активністю

1, Способ получения из растений лекарственного препарата с желчегонной, гепатозащитной, антиоксидантной и антимикробной активностью, включающий экстракцию растительного сырья водой при температуре 60-70°С, отстаивание и сушку, о т л и ч а ю щ и й ся тем, что в качестве растительного сырья используют шрот эфиромасличного производства однолетних цветущих растений бархатцев рода Tagetes, семейства Астровые, который предварительно сушат и измельчают, затем экстрагируют в течение 3-5 часов при соотношении сырье-экстрагент 1:5, отстаивают в течение 7-9 часов, фильтруют, осадок подвергают лиофилизации. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что осадок подвергают лиофилизации методом распылительной или сублимационной сушки. Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается лекарственных препаратов растительного происхождения и способов их получения. Известен желчегонный препарат силибрр и способ его получения из семян расторопши пятнистой. Препарат также обладает гепатозащитным действием. Силибор получают экстракцией семян расторопши пятнистой 80% этанолом, упариванием и растворением осадка 50%-ным этанолом. Затем обрабатывают четыреххлористым углеродом, смесью хлороформ - этанол в соотношении 2:1, упаривают, сушат, остаток обрабатывают смесью хлороформ;этанол 2:1, еще раз упаривают, сушат и получают целевой продукт с выходом 4,5-5,0% {в пересчете на воздушно-сухое сырье). [Справочник лекарствен ные средства, применяемые в медицинской практике в СССР /Под ред. Клюева М.А. - М.: Медицина, 1989. - С. 509]. Однако данный препарат обладает относительно узким спектром биологического действия, при его получении используются токсические вещества, что не исключает присутствие их следов в препарате, способ не обеспечивает выхода целевого продукта выше 4,5-5% в пересчете на воздушно-сухое сырье. Признаками аналога, совпадающими с признаками заявляемого изобретения являются, желчегонное действие; гепатозащитное действие; экстракция; сушка. Также известен желчегонный препарат фламин и способ его получения из цветков бессмертника песчаного. Цветки бессмертника песчаного экстрагируют го NJ О 27125 рячей водой (6О70°С), упаривают, обрабатывают 5 объемами этанола, отстаивают, декантируют раствор с осадка, разбавляют водой^ экстрагируют смесью этилацетат-спирт (9:1). Органические раст- 5 ворители удаляют, остаток сушат и получают целевой продукт с выходом 4,0-5,0% (в пересчете на воздушно-сухое сырье) [Справочник лекарственные средства, применяемые в медицинской практике а СССР 10 /Под ред. Клюева М.А. - М.: Медицина, 1989. - 509 с ] . Однако указанный препарат обладает узким спектром биологического действия, при его получении также используются 15 токсические вещества, что не исключает присутствие их следов в конечном продукте, способ получения фламина трудоемок, не обеспечивает достаточно высокого выхода целевого продукта. 20 Признаками прототипа, совпадающими с существенными признаками заявляемого изобретения являются: желчегонное действие; экстракция горячей водой 60-70°С; отстаивание; сушка. 25 Задачей изобретения является получение лекарственного препарата из растений с комплексной биологической активностью с помощью способа, исключающего следы токсических растворите- 30 лей и обеспечивающего высокий коэффициент использования растительного сырья. Техническим результатом изобретения является лекарственный препарат с жел- 35 чегонным, гепатозащитным, антимикробным и антиоксидантным действием без следов токсических растворителей с выходом целевого продукта не ниже 21% от исходной массы растительного сырья. 40 Указанный технический результат достигается тем, что в качестве растительного сырья используют шрот эфиромасличного производства однолетних цветущих растений бархатцев (род Tagetes, сем. Аст- 45 ровые, виды Т. nrnnuta L. - бархатцы мелкие, Т. signata Bartl. - бархатцы отмеченные, Т. patula L. - бархатцы распростертые и др.), сушат, измельчают, экстрагируют горячей водой 60~70°С в течение 3- 50 5 часов при соотношении сырье-экстрагент не менее 1:5, отстаивают в течение 7-9 часов, фильтруют и подвергают лиофилизации, например, методом распылительной или сублимационной сушки. 55 Целевой продукт представляет собой мультидисперсный блестящий порошок с размерами частиц 5-50 микрон, имеющий цвет от светло-зеленого до зеленого, легкий цветочно-пряный запах с бальза мической и фруктовой нотами, свойственный бархатцам. Исходное сырье является побочным продуктом получения эфирного масла бархатцев методом гидродистилляции [Аннотированный каталог видов и сортов эфиромасличных растений коллекции Никитского ботанического сада. - Ялта, 1982. 36 с ] . Как пряные и эфиромасличные растения наиболее перспективны мелкоцветные бархатцы двух видов; отмеченные и мелкие [Машанов В.И., Покровский А.А. Пряно-ароматические растения. - М.: Агропромиздат, 1991. - 286 с ] . Ежегодно эфирпромом перерабатывается около 2 тыс. т бархатцев, содержание эфирного масла в них составляет 0,21-1,8% в пересчете на сухое вещество, что характеризует незначительную степень использования сырья, основная же масса идет в отходы и в настоящее время совершенно не используется [Кустова С.Д. Справочник по эфирным маслам - М.: Пищев. пром., 1978., Машанов В.И., Покровский А.А. Пряно-ароматические растения. - М.: Агропромиздат, 1991. - 286 с ] . Причинно-следственная связь между перечисленными существенными признаками и заявленным техническим результатом поясняется следующим. Влияние соотношения сырье-экстрагент, температуры и времени экстракции представлено в таблицах 1 и 2. Установлено, что оптимальным вариантом является однократная экстракция при температуре 60-70°С в течение 3-х часов и соотношении сырье-зкстрагент 1:5. Увеличение температуры выше 60-70°С не обеспечивает увеличения выхода целевого продукта, также как и увеличение кратности и времени экстракции. Идентификация предлагаемого вещества по заявляемому способу проводилась методом хроматографического анализа и качественными реакциями на доминирующие группы биологически активных веществ. В составе установлены танниды, флаеоноиды, фенолокислоты, полисахариды, аминокислоты и минеральные вещества. Для выбора оптимального варианта препарата проводили избирательную экстракцию нативных растений и промышленных шротов водой и 40%-ным этанолом. Таким образом были получены препараты: 1) водный экстракт из нативного растения бархатцев (1:20); 2) 40%-ный этанольный экстракт из шрота бархатцев (1:20); 3) вещество по заявляемому способу. 27125 В результате физико-химических и биологических испытаний было установлено, что вещество по заявляемому способу при прочих равных условиях обеспечивает экологически чистую технологию производства и низкую себестоимость целевого продукта. Определение острой токсичности по методу Кербера [Современные методы в биохимии / Турков М.И., Климова Г.И., Давыдова Г.А., и др. - М.: 1977. - С. 391] показало, что введение препаратов из бархатцев до 7000 мг/кг не вызвало гибели животных, что указывает на их безвредность. Изучение биологической активности полученных препаратов проводили с помощью общепринятых информативных тестов [Современные методы в биохимии / Турков М.И., Климова Ґ.И., Давыдова Г.А. и др. - М.: 1977. - С. 391; Fernander N.. Valenzuela A., Fernander Vn. // Lipids. 1982. - Vol. 17. № 5-p. 393-395; Ohawa H., Ohnishi N.. lagi K. // Analyt. Biochem. - 1979. - Vol. 95, № 2-p. 351-358]. Гепатозащитную активность препаратов из бархатцев определяли по выживаемости животных при введении им четыреххлористого углерода в смертельной дозе (защитный индекс) и активности индикаторного фермента, характеризующего цитолитический процесс аланинаминотрансферазы (АЛТ) сыворотки крови [Современные методы в биохимии / Турков М.И., Климова Г.И., Давыдова Г.А. и др. М.: 1977. - С. 391]. В каждую серию брали 6 крыс-самцов. Исследование данного вида активности в дозе 25 мг/кг показало, что вещество по заявляемому способу обладает высокой гепатозащитной активностью (49,3%), водный экстракт из нативного растения бархатцев - более низкой активностью, однако разница между активностью этих соединений и силибора статистически недостоверна (табл. 3). Обозначения, использованные в таблицах: М - среднее значение; m - ошибка среднего значения; Р - достоверность отличия. Мембраностабилизирующий эффект, обуславливающий гепатозащитное действие, может зависеть от способности соединений ослаблять процессы липопероксидации. Поэтому на модели поражения печени четыреххлористым углеродом, который является активным прооксидантом, также была изучена антиоксидантная активность изучаемых препаратов из бархатцев. Наиболее высокой она была у вещества по заяв 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ляемому способу, меньшей - у 40%-го этанольного экстракта бархатцев. Исследование холеретического действия всех трех препаратов из бархатцев по степени влияния их на скорость желчеотделения у подопытных животных проводили по М.Д. Литвинчуку и З.И. Новосилец [Современные методы в биохимии / Турков М.И., Климова Г.И., Давыдова Г.А. и др. - М.: 1977. - С. 391]. Изучение желчеотделения проводили в острых опытах на крысах массой 210,0±10,0 г под этаминаловым наркозом (100 мг на 100 г массы тела). Об интенсивности желчеотделения судили по заполнению желчьк> полиэтиленового катетера диаметром 2 мм в течение 3 ч наблюдения (в см заполнения капилляра). За 30 мин до опыта различным группам крыс вводили зондом в желудок каждый препарат бархатцев в дозе 2,5 мг/кг массы тела. В этом же режиме вводили водный раствор препарата с холеретическим действием - фламина в дозе 2,5 мг/кг. Контролем служили опыты с введением животным дистиллированной воды в том же количестве. Сравнительные данные приведены 8 табл. 4. Препараты бархатцев оказали выраженный холеретический эффект, превышающий эффект фламина с высоким уровнем статистической достоверности. Антиоксидантную активность препаратов из бархатцев изучали на модели аутоокисления метиловых эфиров ненасыщенных жирных кислот, стимулированных ионами двухвалентного железа. Источником метиловых эфиров жирных кислот служил фармакопейный препарат линетол. Для оценки влияния исследуемых веществ на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) используют методику [Fernander N., Valenzuela A., Fernander Vn. // Lipids. - 1982. - Vol 17. № 5-p. 393395; Ohawa H., Ohnishi N.. lagi K. // Analyt. Biochem. - 1979. - Vol. 95, № 2-p. 351358] в модификации, состоящей в том что к 0,5 г линетола добавляли 0,25 г твина-80 и смесь озвучивали в 4,25 мл фосфатного буфера (0,05 моля, рН 7,4) на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-2Т (СССР) в течение 10 мин при частоте 25 кГц, затем к 0,5 мл полученной дисперсии липидов добавляли 0,05 мл раствора исследуемого препарата известной концентрации так, что соотношение в среде инкубации липиды-вещество составило 500:1. Смесь доводили фосфатным буфером до конечного объема 4.5 мл и стимулировали ПОЛ 0,5 мл 0,14% водным 27125 раствором FeSO4 х х 10Н2О. Конечную смесь инкубируют при 37°С и в динамике (через 15, 30, 45 мин) отбирают аликвоты по 0,5 мл для определения липоперекисей. Результаты опытов обрабатывали статистически с помощью критерия t-Стьюдента (табл. 5). Таким образом у препаратов бархатцев установлена достаточно высокая ингибирующая активность в отношении процессов липидного переокисления, превышающая таковую у витамина Е, что указывает на перспективность создания на их основе новых высокоэффективных натуральных продуктов с антиоксидантным действием. Антимикробную активность исследовали методом серийных разведений препаратов из бархатцев в диапазоне концентраций от 100 до 200 мкг/мл и посевом на плотной питательной среде (агаре), Контролем служили аналогичные питательные среды, не содержащие (Ко) и содержащие (К,) растворитель (дистиллированная вода) 0,9% раствор натрия хлорида, но не влияющие на жизнедеятельность тест-культур. Концентрацию культур определяли по оптическому стандарту мутности N 10, разведение производили стерильным 0,9% раствором натрия хлорида до 10 мкг/мл. Бактериальной петлей наносили испытуемые культуры на поверхность питательного агара гомогенизированного с исследуемыми препаратами. На одной чашке производили радиально посев 8 культур, инкубировали при температуре 37°С в течение 18-20 часов. Учет результатов вели при наличии роста культуры в контрольной чашке, а минимальную ингибирующую концентрацию препарата определяли по последней чашке Петри, где отмечалась полная задержка роста бактерий. 5 10 15 20 25 30 35 40 Спектр антимикробной активности изв- 45 лечений из бархатцев приведен в таблице 6. Наиболее высокую степень антимикробной активности проявляет вещество по заявляемому способу, в то время как препарат сравнения фламин активен в 50 отношении меньшего числа микроорганизмов. Исследование стабильности предлагаемого средства и установление срока годности в процессе хранения (период 55 1986-1991 гг.) оценивали по количественному содержанию биологически активных веществ исследованию структурно-механических и физико-химических параметров, а также по степени биологической активности в интервале 0,5 года. Препарат хранили в защищенном от света месте при температуре 16-23°С, Установлено, что лиофилизированный водный экстракт из шрота бархатцев сохраняет доброкачественность в течение 3-х лет (срок эксперимента). Способ поясняется следующим примером. 10,0 кг шрота бархатцев сушат до влажности 10~15%, измельчают, экстрагируют в 50,0 литрах (1:5) горячей воды (60-70°С) в емкости объемом 100 литров в течение 3-х часов, отстаивают там же 7,5 часа, фильтруют, осадок подвергают лиофилизации, например, методом распылительной или сублимационной сушки (сублиматор TG-50-4 производства ГДР) и получают примерно 2,15 кг мультидисперсного блестящего порошка (размер частицы 5-20 микрон). Выход целевого продукта по данному способу составляет 21,5%. Таким образом, заявленный способ позволяет получить средство с разносторонним действием, а именно, желчегонным, гепатозащитным, антиоксидантным и антимикробным действием, что обеспечивает его широкое применение при различных патологиях органов пищеварения. При этом повышается специфическая активность препарата в сравнении с фламином, силибором, калефлоном и витамином Е. Выход целевого продукта по заявленному способу в 4-5 раз выше, чем по прототипу. Одновременно обеспечивается упрощение способа, а именно; 1) упрощается число операций; 2) происходит использование доступного, дешевого, нетоксического растворителя (воды); 3) конечный продукт не содержит следы токсических растворителей. Сырьевой базой для получения лекарственного препарата являются отходы эфиромасличной промышленности - шрот бархатцев отмеченных и бархатцев мелких, после гидродистилляции в больших количествах накапливающиеся (в среднем около 2000 т в год) по отрасли. .10 27125 Т а б л и ц а Влияние температуры и времени экстракции на выход целевого продукта из шрота бархатцев Температура, °С Время, ч Выход, % 50 2,0 2,0 2,0 2,0 3,0 1 18,0 18,8 18,8 19,0 19,8 21.0 21,5 21,5 г 60 70 80 50 60 70 3,0 3,0 4,0 70 Т а б л и ц а Влияние соотношения сырье-экстрагент и кратности экстракции на выход целевого продукта из шрота бархатцев (п~6) Соотношение сырье-экстрагент, вес ч. Кратность экстракции Выход, % 1 2 18,5 18,5 18,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21.5 1:4 1:5 t:6 3 1 2 3 1 2 3 Т а б л и ц а 3 Гепатозащитная активность препаратов из бархатцев при токсическом действии четыреххлористого углерода Гепатозащитная активность Препарат в опыте Водный экстракт нативных растений бархатцев 40% этанольный экстракт из шрота бархатцев Препарат по заявляемому способу Силибор Вода АЛТ, ммольДл ч) М±т 2,75*0,1 2,97±0,2 2,64*0,1 2,84*0.1 . 4,10±0,14 % актив- Достовености рность р 47,2 >0,05 43,8 49,3 45,8 >0,05 >0,05 _ 12 27125 11 Т а б л и ц а 4 Холеретический эффект препаратов из бархатцев Выделение желчи (в см заполнения трубки-капилляра за 3 ч) Препарат в опыте М Вода Водный экстракт нативных растений бархатцев 40% этанольный экстракт из шрота бархатцев Препарат по заявляемому способу Фламин 51,7 Достоверность р +50,8 0,05