Спосіб одержання з рослинної сировини речовини з жовчогінною, гепатозахисною, антимікробною та антиоксидантною активністю

1. Способ получения из растительного сырья вещества с желчегонной, гепатозащитной, антимикробной и антиоксидантной активностью, включающий экстракцию растительного сырья водой при температуре 60-70°С, отстаивание и сушку, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве растительного сырья используют шрот эфиромасличного производства цве-* тущих растений мяты перечной (Menta pipertia L), который предварительно сушат и измельчают до размера 3-5 мм, затем экстрагируют в течение 3 часов при соотношении сырье - экстрагент 1:5, отстаивают не менее 5 часов, фильтруют, жидкую фракцию подвергают лиофилизации. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве растительного сырья используют шрот эфиромасличного производства цветущих растений мяты луговой (Menta arvensis L). 3. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что жидкую фракцию подвергают лиофилизации методом распылительной или сублимационной сушки. С > "si Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается лекарственных препаратов растительного происхождения и способов их получения. Известен способ получения желчегонного препарата фламина: цветки бессмертника песчаного экстрагируют горячей водой (60-70 град С), упаривают, обрабатывают 5 объемами этанола, отстаивают, декантируют раствор с осадка, разбавляют водой, экстрагируют смесью этилацетат-спирт (9:1). Органические растворители удаляют, остаток сушат и получают целевой продукт с выходом 4,0-5,0% (в пересчете на воздушно-сухое сырье). [Справочник лекарственные средства, при меняемые в медицинской практике в СССР /Под ред. Клюева М.А. - М.: Медицина, 1989. - 509 с ] . Однако, указанный способ получения фламина трудоемок, не обеспечивает выхода целевого продукта выше 4,0-5,0% в пересчете на воздушно-сухое сырье. Специфическое действие препарата монофункционально. Кроме того, производство использует нативное растительное сырье, ресурсы которого ограничены и токсические органические растворители (этанол, этилацетат), что не исключает присутствия их следов в конечном продукте. Признаки прототипа, сходные с признаками заявляемого способа: желчегон О 27122 ное действие; экстракция горячей водой (60~70°С); отстаивание; растительное сы? рье; сушка. Задачей изобретения является получение фармацевтического средства с желчегонной, гепатозащитной, антимикробной и антиоксиданти ой активностью с помощью способа, исключающего следы токсических растворителей и обеспечивающего высокий коэффициент использования растительного сырья. Техническим результатом изобретения является фармацевтическое средство с желчегонным, гепатозащитным, антимикробным и антиоксидантиым действием без следов токсических растворителей с выходом целевого продукта не ниже 20% от исходной массы растительного сырья. Указанный технический результат достигается тем, что шрот эфиромасличного производства цветущих растений мяты перечной (Menta piperita L) или мяты луговой (Menta arvensis L. var. piperascens, сем. Lamiaceae), сушат, измельчают до размера 3-5 мм, экстрагируют горячей водой 60-70°С в течение 3-х часов при соотношении сырье-экстрагент 1:5, экстракт отстаивают не менее 5 часов, фильтруют, жидкую фракцию подвергают лиофилизации, например, методом распылительной или сублимационной сушки. Целевой продукт представляет собой мультидисперсный блестящий порошок, цвет светло-зеленый, запах присущий мяте. . Исходное сырье является вторичным продуктом после получения эфирного масла мяты способом гидродистилляции [Аннотированный каталог видов и сортов эфиромасличных растений коллекции Никитского ботанического сада. - Ялта, 1982, 36 с , Кустова С.Д. Справочник по эфирным маслам. - М.: Пищев. пром , 1978]. Ежегодно эфирпромом перерабатывается около 40,0 тыс. т мяты, некоторая часть отходов идет на получение конкрета мяты [Аннотированный каталог видов и сортов эфиромасличных растений коллекции Никитского ботанического сада. - Ялта, 1982. - 36 с , Кустова С.Д- Справочник по эфирным маслам. - М.: Пищев. пром., 1978], основная же масса не используется и выбрасывается [Кустова С.Д. Справочник по эфирным маслам. - М.: Пищез. пром., 1978]. Причинно-следственная связь между перечисленными существенными признаками и заявленным техническим результатом поясняется следующим. Влияние соотношения сырье-экстрагент, температуры и времени экстракции представлено в таблицах 1 и 2. Оптимумом является однократная экстракция при температуре 60 -70°С в течение 3-х часов и соотношении сырье-экстрагент 1:5. 5 Идентификация вещества по заявляемому способу - лиофилизированного экстракта из шрота мяты - проводилась методом хроматографического анализа и качественными реакциями на доминирую10 щие группы биологически активных веществ (БАВ). В составе конечного продукта находятся танниды, флавоноиды, фенолокислоты, тритерпеноиды, аминокислоты, витамины, минеральные вещества, 15 полисахариды. Для выбора оптимального варианта препарата проводили избирательную экстракцию нативныч растений и промышлен• ных шротов водой и 40%-ным этанолом. 20 Таким образом были получены препараты: 1) экстракт водного извлечения из нативного растения мяты; 2) вещество по заявляемому способу; 3) 40% этанольное извлечение из шро25 та мяты. Изучение биологической активности проводили с помощью общепринятых- информативных тестов [Современные методы в биохимии / Турков М.И., Климова ЗО Г.И., Давыдова Г.А. и др. - М.: 1977. - С. 391, Fernander N., Vallenzuela A., Fernander Vn. // Lipids. - 1982 - Vol. 17. № 5-P. 393395, Ohawa H., Ohnishi H., lagi K. // Analyt. Biochem. - 1979. - Vol. 95, № 2-P. 3 5 1 35 358]. Обозначения, использованные в таблицах: п - количество опытов; М - среднее значение; m - ошибка среднего значения; Р - достоверность отличия. 40 Антимикробную активность исследовали методом серийных раззедений препаратов из шрота мяты в диапазоне концентраций от 100 до 2000 мкг/мл и посевом на плотной питательной среде (ага45 ре). Контролем служили аналогичные питательные среды, не содержащие и содержащие растворитель (дистиллированная вода), 0,9% раствор натрия хлорида, но не влияющие на жизнедеятельность 50 тест-культур. Концентрацию культур определяли по оптическому стандарту мутности N 10, разведение производили стерильным 0,9% раствором натрия хлорида до 107 мкг/мл. Бактериальной петлей на55 носили испытуемые культуры на поверхность питательного агара гомогенизированного с исследуемыми препаратами. На одной чашке производили радиально посев 8 культур, инкубировали при температуре 37°С в течение 18-20 часов. Учет 27122 мг/кг показало, что лиофилизированный результатов вели при наличии роста кульэкстракт из шрота мяты обладает достатуры в контрольной чашке, а минимальточно высокой гепатозащитной активностную ингибирующую концентрацию препаью, статистически неотличимой от активрата определяли по последней чашке Петри, где отмечалась полная задержка рос- 5 ности силибора (р>0,05) (таблица 5). Антиоксидантную активность пещестта бактерий. Результаты исследований прива по заявленному способу изучали на ведены в таблице 3. модели аутоокисления метиловых эфиров Вещество по заявляемому способу обненасыщенных жирных кислот, стимулиладает достаточно широким спектром ан10 рованных ионами двухвалентного железа. тимикробной активности в отношении распИсточником метиловых эфиров жирных кисространенных возбудителей инфекционных лот служит фармокопейный препарат лизаболеваний и проявляет более высокую нетол [Современные методы в биохимии антимикробную активность, чем препарат / Турков М.И., Климова Г.И., Давыдова сравнения фламин. Исследование хол еретического дейст- 15 Г.А. и др. - М.: 1977. - С. 391, Fernander N., Vatenzuela A., Fernander Vn. // Lipids. вия вещества по заявляемому способу по 1982. - Vol. 17. № 5-P. 393-395, Ohawa степени влияния его на скорость желH., Ohnishi N., lagi K. // Analyt. Biochem. чеотделения у подопытных животных про- 1979. - Vol. 95, № 2-P. 351-358]. водили по М.Д. Литвинчуку и З.И. НовоДля оценки влияния исследуемых весилец [Современные методы в биохимии 20 ществ на процессы перекисного окисле/ Турков М.И., Климова Г.И., Давыдова ния липидов (ПОЛ) используют методику ГА. и др. - М.: , 1977. - С. 391]. Изучение [Fernander N., Valenzuela A., Fernander Vn. желчеотделения проводили в острых опы// Lipids. - 1982. - Vol. 17. № 5-P. 393тах на крысах массой 210,0+10,0 г под этаминаловым наркозом (100 мг на 100 г 25 395, Ohawa H., Ohnishi N.. lagi K. // Analyt. Biochem. - 1979. - Vol. 95, № 2-P. 3 5 1 массы тела). Об интенсивности желчеот358. Fernander N.. Valenzuela A., Fernander деления судили по заполнению желчью Vn.] в модификации, состоящей в том, что полиэтиленового катетера диаметром 2 мм к 0,5 г линетола добавляли 0,25 г твинав течение 3 ч наблюдения (в см заполнения капилляра). За'ЗО мин до опыта раз- 30 80 И' смесь озвучивали в 4,25 мл, фосфат• ного буфера (0,05 моля, рН 7,4) на ультличным группам крыс вводили зондом в развуковом диспергаторе УЗДН-2Т (СССР) желудок препарат каждого из двух видов в течение 10 мин при частоте 25 кГц, мяты в дозе Q.25 мл на 100 гр массы затем к 0,5 мл полученной дисперсии литела. В этом же режиме вводили водный 35 - пидов добавляли 0,05 мл раствора исслераствор препарата с холеретическим дуемого препарата известной концентрадействием - фламина - в дозе 2,5 мг/кг ции так, что соотношение в среде инку[Современные методы в биохимии / Турбации липиды-вещество составило 500:1. ков М.И., Климова Г.И., Давыдова Г.А. и Смесь доводили фосфатным буфером до др. - М.: , 1977. - С. 391]. Контролем служили опыты с введением животным 40 конечного объема 4,5 мл и стимулировали ПОЛ 0,5 мл 0,14% водным раствором дистиллированной воды (основы, на котоFeSO4-7H2O. Конечную смесь инкубируют рой готовились исследуемые препараты) при 37°С и в динамике (через 15, 30, 45 в том же количестве. Результаты привемин) отбирают апиквоты по 0,5 мл для дены в таблице 4. Сопоставление изучаемого экстракта 45 определения липоперекисей. Антиоксидантную активность препарата с фламином показало отсутствие разлииз шрота мяты оценивают по содержанию чий в их желчеотделительных свойствах. малонового диальдегида (МДА) по метоГепатозащитную активность вещества дике [Ohawa Н., Ohnishi N., lagi К. // Anaiyt. * по заявляемому способу определяли по выживаемости животных при введении им 50 Biochem. - 1979. - Vol. 95, № 2-P. 3 5 1 358]. Результаты опытов обрабатывали четыреххлористого углерода в смертельстатистически с помощью критерия t Стной дозе (защитный индекс) и активности ьюдента (табл. 6). индикаторного фермента, характеризуюИз таблицы 6 следует, что у изучаещего цитолитический процесс аланинаминотрансферазы (АЛТ) сыворотки крови 55 мых препаратов ингибирующая активность в отношении ПОЛ не отличается от актив[Современные методы в биохимии / Турности витамина Е, что дает возможность ков М.И., Климова Г.И., Давыдова Г.А. и создания на их основе новых др. - М.: , 1977. - С. 391]. В каждую высокоэффективных натуральных продуксерию брали б крыс-самцов. Исследоватов с антиоксидантным действием. ние данного вида активности в дозе 25 7 8 27122 Исследование стабильности предлагаемого средства и установление срока годности в процессе хранения (период 1986-1991 гг.) оценивали по количественному содержанию БАВ, исследованию структурно-механических параметров, а также по степени биологической активности с интервалом 0,5 года. Препарат хранили в защищенном от света месте при температуре 16-23°С. Препарат из вещества по заявляемому способу сохраняет доброкачественность в течение 3-х лет (срок эксперимента). Таким образом, заявленный способ позволяет получить средство с разносторонним действием, а именно, желчегонным, гепатозащитным, противовоспалительным и антиоксидантным действием, что обеспечивает его широкое применение при различных патологиях органов пищеварения. При эЧбм препарат неотличим от специфической активности в сравнении с фламином, силибором и витамином Е. Вещество получают без применения органических растворителей и алкалоидов, в результате чего исключены следы этих веществ в конечном продукте, процесс получения вещества опирается на дешевое сырье и имеет низкие трудозатраты. П р и м е р . 20,0 кг шрота мяты сушат, например в потоке теплого воздуха до влажности 15-18%, измельчают до размера 3-5 мм, экстрагируют в 100,0 л -5 горячей воды (60-70°С) в течение 3-х часов, отстаивают 5 часов, фильтруют, подвергают лиофилизации методом распылительной или сублимационной сушки, например, с помощью сублиматора марки 10 TG-50/4 (ГДР), и получают 4,4 кг мультидисперсного блестящего порошка (5-50 микрон), светло-зеленого цвета с мятным запахом. 15 Выход целевого продукта по данному способу составляет 22%, что в 4-5 раз выше, чем' по прототипу. Одновременно обеспечивается упрощение способа, а именно: 1) уменьшается число операций; 20 2) предлагается использование доступного^ дешевого, нетоксического растворителя (воды). Сырьевой базой для получения средства являются отходы эфиромасличнои про25 мышленности - шрот мяты перечной или м. луговой после гидродистилляции в больших количествах накапливающиеся по отрасли и используемые частично. Ежегодный ресурс составляет в среднем около 30 30-35 тыс. т. Т а б л и ц а 1 Влияние температуры и времени экстракции на выход целевого продукта из шрота мяты - Температура, °С Время, ч Выход, % 50 60 2,0 2,0 70 80 50 60 70 70 2,0 16,92 18,73 19,81 20,14 21,72 22,36 22,36 22,36 2,0 3,0 3,0 3,0 3,0 ' ' 10 27122 Т а б л и ц а 2 Влияние соотношения сырье-экстрагент и кратности экстракции иа выход целевого продукта Соотношение Кратность экстракции Выход, % 1 сырье - экстраге нт 19,61 19,61 19,43 22,36 22,36 22,36 22,36 22,36 22,36 г 1:4 • 3 і 2 3 1 2 3 * . V.5 1:6 | * Т а б л и ц а 3 Антимикробная активность, мкг/мл Вещество no заявленному способу Тест-культуры 1. Staph. aureus 209 Р 2. Staph. aureus Wood-46 3. E. coli 0-55 N 27 4. Proteus vulgaris NCTC N 4145 5. Bacillus subtilis 2 6. Str. pneumonia 2 Фламин 1000 1000 2000 2000 500 400 1000 1000 1000 П р и м е ч а н и е . 1. Срок наблюдения посевов 48 часов; 2. (-) - отсутствие эффекта; 3. Культура выращена на универсальной питательной среде. Т а б л и ц а ж Желчеотделение под действием исследуемых препаратов Выделение желчи за 3 ч, см Препарат в опыте среднее Вода Вещество по заявляемому способу Фламин % к контролю Р +39,1 +35,7 >0,05 51,7 71,9 68,1 4 12 27122 11 Т а б л и ц а 5 Гепатозащитная активность исследуемых препаратов Гепатозащитная активность АЛТ, ммоль/л.ч. Препарат в опыте М Введение водного экстракта из нативного растения мяты 1:20 Введение 40%-го этанольного извлечения из шрота мяты Введение вещества по заявляемому способу 1:20 Силибор m % активности 2,68 0,10 48.5 >0,05 2,54 0,12 51,2 >0,05 2,62 2,84 0.11 0,10 49,6 45,8 >0,05 Р Т а б л и ц а 6 Антиоксидантная активность препаратов мяты Препарат в опыте МДА, нмоль/ч М Введение водного экстракта из нативного растения мяты 1:20 Введение 40%-го этанольного извлечения из шрота мяты Введение вещества по заявляемому способу Витамин Е m % активности 203.5 0,6 31,2 >0,05 206,2 199,1 218,2 0,4 0.6 0,2 30,8 31,9 29,1 >0,05 >0,05 Р Упорядник Техред М. Келемеш Коректор М. Самборська Замовлення 553 Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул. Гагаріна; 101