Спосіб виділення ферментного препарату з пектолітичною активністю з рослинної сировини

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, а именно к области выделения ферментов и может быть использовано в промышленности для выделения ферментных препаратов с целью их применения в соответствии с проявляемыми ферментативными активностями. Известен способ выделения пектолитических ферментов. Изобретение заключается в том, что добавление сульфата аммония в раствор, вспенивание и отбор пены осуществляется многократно, при этом для выделения протеолитических ферментов вспенивание и отбор пены осуществляется при изменении степени насыщения с 0,1 до 0,6 с шагом 0,1 и изменении pH раствора с 2,5 до 8,5 или с 8,5 до 2,5 с шагом 0,5 после чего осуществляют выделение пектолитических ферментов многократным вспениванием и отбором пены при изменении степени насыщения с 0,6 до 1,0 с шагом 0,1 и изменением pH с 5,5 до 2,5 с шагом 0,5. Выход пектолитических ферментов увеличен на 46% [1]. Известный способ имеет ряд недостатков: большой энергорасход на многократное вспенивание, расход сульфата аммония до 700кг на одну тонну культуральной жидкости, необходимость контроля pH, а следовательно, расход щелочи или кислоты. Известен способ получения неполитического ферментного препарата при котором применяется штамм вида ASPERGILLUS NIGER VAN TIEGHON, к ультивируемый в ферментной среде. Фермент концентрируется из ферментной среды и сушится при 30 - 38°C. Получаемый препарат обладает более высокой тепловой стабильностью, в 3 раза большей биосинтетической активностью относительно полигалактуроназы и в 5 раз более высоким биосинтезом пектинэстеразы, что увеличивает экономическую эффективность процесса [2]. Известный способ предусматривает культуральную жидкость в качестве источника ферментов, а следовательно ферментный препарат содержит токсины и ограничен в применении, процесс требует большого ресурсорасхода (4 объема органического растворителя на один объем культуральной жидкости, либо до 700кг сульфата аммония на одну тонну культуральной жидкости) и предусматривает значительное энергопотребление. Известен способ получения мацерирующего фермента из культуры Aspergillus, содержащей пектингликозидазы и пектинэстеразы ферментной смеси приводят в контакт с катионообменником, отделяют жидкую фазу, в которой находится основное количество пектинэстераз и пектингликозидаз от катионообменника и из него элюируют мацерирующий ферментный препарат [3]. Данный способ требует расхода катионообменника и органического растворителя для выделения фермента, при этом основное количество фермента остается в культуральной жидкости неиспользованным. Наиболее близким является способ выделения веществ с использованием энзиматического расщепления полисахаридов. Способ предусматривает обработку полисахаридов в жидкой среде или ее предшественник ферментом расщепления полисахаридов с образованием молекул с меньшей молекулярной массой, которые не конкурируют с выделяемыми при адсорбции на сорбенте. Указанная жидкая среда может быть представлена культуральной жидкостью, содержащей антибиотики, белки или ферменты (амилазу), а также кислые полисахариды (например полиуронат). Полиуронат превращают в молекулы с меньшей молекулярной массой при действии пектиназы [4]. Приведенный способ предполагает получение культуральной жидкости микроорганизма, следовательно конечный ферментный препарат содержит токсины, требуется расход сорбента, материалов для питательной среды и фермента расщепления полисахаридов, который требуется внести для деструкции полисахарида и выделения целевого ферментного препарата. В основу настоящего изобретения положена задача путем использования состава растительного сырья и свойств отдельных его компонентов создать способ выделения комплексного ферментного препарата с пектолитической активностью из растительного сырья, который осуществляется на основе аутокаталитических процессов. Техническим результатом данного изобретения является получение препарата с большей ферментной активностью, чем традиционные, более дешевого, чем традиционные, свободного от токсичных веществ, следовательно не имеющего ограничений по применению, который далее может использоваться в пищевой промышленности в соответствии с проявляемыми им активностями. Поставленная задача решается тем, что, в способе выделения ферментного препарата с пектолитической активностью из растительного сырья, приготовление жидкой среды ведут путем разрыва клеточной стенки растений, отделения твердого остатка с последующим концентрированием препарата из жидкой фазы, причем концентрирование осуществляется на основе аутокаталитического процесса разрушения полисахаридов при температуре 35 - 45°C, pH 3 - 8 в течение 20 - 300 минут. Поскольку структурирующим элементом клеточной стенки растений является пектин, а пектолитические ферменты также естественно присутствуют в растениях, то при разрыве клеточной стенки и отделении твердого остатка от жидкой фазы в ней (жидкое фазе) присутствуют и пектолитические ферменты и их субстрат (пектин). Под действием аутокаталитического процесса, происходящего при температуре 35 - 45°C, pH 3 - 8 в течение 20 300 минут происходит разрушение коллоидной системы жидкой фазы, которую формируют белки, ферменты и полисахариды растения. Наблюдается расслоение жидкой фазы и формирование осадка, который представляет собой комплексный ферментный препарат с пектолитической активностью. Отделение осадка от жидкой фазы осуществляется обычными методами. Препарат представляет собой пасту которая может быть либо высушена, либо смешана с другими веществами, либо очищена дополнительно при необходимости. Заявляемое изобретение позволяет получать ферментные препараты, отказавшись от традиционной дорогостоящей процедуры: культивирование микроорганизмов (30 - 70 часов при температуре 35 - 45°C), отделение культуральной жидкости от биомассы, осаждение фермента из культуральной жидкости (расход органического растворителя 4 : 1 к объему культуральной жидкости или расход, например, сульфата аммония до 700кг на одну тонну культуральной жидкости). Более того, ферменты растительного сырья, в отличие от ферментов микробиологического происхождения свободны от микробиальных токсинов и не имеют ограничений по применению в пищевой промышленности. Заявляемый способ получения комплексного ферментного препарата с пектолитической активностью из растительного сырья включает приготовление жидкой среды путем разрыва клеточной стенки растения, отделение твердого остатка, термостатирование жидкой фазы, ее отстаивание и декантацию с осадка. Осадок представляет собой комплексный ферментный препарат с пектолитической активностью. Найденные экспериментально оптимальные условия выделения комплексного ферментного препарата с пектолитической активностью из растительного сырья соответствуют оптимальным условиям действия пектолитических ферментов: температура 35 - 45°C, pH 3 - 8, в течение 20 - 300 минут. Дальнейшие цели и преимущества настоящего изобретения станут понятны из последующего подробного описания способа выделения комплексного ферментного препарата с пектолитической активностью из растительного сырья и примеров осуществления этого способа. Способ осуществляется следующим образом. Свежее растительное сырье измельчают (либо разрывают клеточные стенки, например, замораживанием), отделяют жидкую фазу от твердого остатка растительной биомассы, жидкую фазу термостатируют при температуре 35 - 45°C, pH 3 - 8 в течение 20 - 300 минут при периодическом перемешивании, затем дают отстояться в течение одного часа. Основную массу жидкости декантируют с образовавшегося осадка, Остаток центрифугир уют. Образовавшаяся пастообразная масса представляет собой комплексный ферментный препарат с пектолитической активностью, выделенный из растительного сырья, который характеризуется следующими показателями: влажность 60 - 80%, содержание полисахаридов 10 - 20%, белка 10 - 20%, ферментные активности проявляются в зависимости от исходного растительного материала. Пример 1. Свежие томаты измельчают до получения частиц размером не более 10-6м и отфильтровывают твердый остаток. Жидкую фазу термостатируют при 35°C, pH 4,7 в течение 40 минут. Дают жидкой фазе отстояться в течение 1 часа. Декантируют основную массу жидкости с образовавшегося осадка. Полученный пастообразный комплексный ферментный препарат с пектолитической активностью имеет следующие характеристики: влажность 80%, содержание полисахаридов 10%, белка 10%. Проявляется активность пектинметилэстеразы 400Ед/г. полигалактуроназы 30Ед/г. Следующие примеры целесообразно свести с таблицу. Параметры, не указанные в таблице, остаются неизмененными и соответствуют приведенным в примере 1. Последовательность операций не изменяется. Таким образом показана возможность выделения эффективного комплексного ферментного препарата с пектолитической активностью из растительного сырья и разработаны параметры процесса его выделения. Процесс выделения проводится по схеме которая значительно проще, дешевле традиционной и позволяет получать препарат более активный, чем традиционный и не имеющий ограничений по применению, в отличие от препаратов микробиологического происхождения. Выделенный из растительного сырья комплексный ферментный препарат с пектолитической активностью может быть использован в пищевой промышленности, например, для осветления яблочного сока либо для получения продуктов лечебно-профилактического назначения и др. Предлагаемый способ выделения комплексного ферментного препарата с пектолитической активностью из растительного сырья позволяет получать активные, дешевые и свободные от токсинов комплексные ферментные препараты с пектолитической активностью неограниченного применения, по технологии, которая может быть реализована на существующем оборудовании. Применение полученных препаратов в промышленности осуществляют в соответствии с проявляемыми ими активностями ферментов, например, для деметоксилирования пектина с целью получения продуктов лечебно-профилактического назначения и др.