Спосіб одержання лікарського засобу з селезінки ссавців

1. Спосіб одержання лікарського засобу з селезінки ссавців, що включає розморожування, подрібнення селезінки, екстракцію, очищення екстракту та консервацію готового продукту, який відрізняє ться тим, що екстракцію селезінки здій 3 36640 зія додатково містить диметилсульфоксид у кількості від 3 до 10% [4]. Відомий спосіб виробництва препарату „Спленін”, який полягає в обробці селезінки великої рогатої худоби шля хом заморожування, подрібнення, екстракції селезінки в умовах псевдозрідженого шару, очищенні та консервуванні екстракту [5]. Відомий спосіб одержання препарату „Спленопід” для лікування важких форм гнійносептичних і аутоімунних захворювань. Спосіб включає мітогенну стимуляцію клітин тканини селезінки в процесі її відмивання, гомогенізацію органу, руйн ування клітин заморожуваннямрозморожуванням і ультразвуковою обробкою, відділення екстракту і його ультрафільтрацію через фільтри 50000Да. До ультрафільтрату додають желатіноль і розчин гентаміцину, розливають у флакони і піддають ліофілізації [6]. Відомий спосіб одержання тканинних препаратів. Спосіб включає витримування тканин селезінки здорових молодих тварин в умовах зниженої температури протягом 6-7 днів, гомогенізацію, екстрагування гомогенізату 0,9% розчином хлориду натрію в співвідношенні 1:10, фільтрацію екстракту і його стерилізацію. На другий, четвертий і шостий день витримування тканини піддають дії іонами, концентрація яких 200-400тис. в 1см 3, протягом 25-40хв [7]. Відомий спосіб одержання препарату з селезінки ембріонів великої рогатої худоби, що володіє імуномодулюючою, антигіпоксичною і репаративною дією. Спосіб включає заморожування і автоліз селезінки, гомогенізацію, двократну екстракцію гомогенату 0,9% розчином хлориду натрію і заморожування. Потім проводять відділення білкової фракції шляхом ультрафільтрації з послідовним застосуванням мембран, що мають величини межі затримання по молекулярній масі 50000 і 5000, і до одержаного діалізату додають консервант етиловий ефір параоксибензойної кислоти [8]. Відомий спосіб одержання імуностимулятора з селезінки, який здійснюють таким чином. Селезінку великої рогатої худоби заморожують, гомогенізують, піддають екстракції розчином 1,0М фосфатного буфера з подальшим центрифугуванням і очищенням методом ультрафільтрації і сорбції на гельфосфаті кальцію. Потім сорбент обробляють розчином 60мМ фосфатного буфера з подальшою рідинною хроматографією і елюцією цільового продукту розчином 0,01М фосфатного буфера. Цільовий продукт піддають стерилізуючій фільтрації і ліофілізують [9]. Відомий спосіб одержання біологічно активного засобу для нормалізації фізіологічного стану. Спосіб здійснюють таким чином. Роздільно подрібнюють тканини печінки і селезінки, гомогенат центрифугують, фільтруванням рідкої фракції виділяють екстракт, а кров сепарують, формені елементи і плазму об’єднують з екстрактом печінки і селезінки, додають мед і змішують при наступному співвідношенні компонентів, мас. ч.: екстракт з печінки 0,04, екстракт з селезінки 0,01, формені елементи крові і плазма 0,05, мед 0,9, потім одержану суміш фільтрують [10]. 4 Відомий спосіб одержання порошку селезінки свині, який здійснюють таким чином. Організм свині-донора стимулюють препаратами ксеноселезінки або введенням протягом 7-8 днів в щоденний раціон свіжої свинячої селезінки три рази на день, або шляхом внутрішньом’язового введення препарату „Спленопід" протягом 3 днів в дозі 6-12мг. Після виділення свіжу свинячу селезінку гомогенізують, проводять заморожування в низькотемпературному холодильнику, сублімаціонне висушування і фасування [11]. Найбільш близьким до заявляемого є спосіб одержання спленіну з селезінки великої рогатої худоби, який здійснюють таким чином. Свіжоморожену селезінку (540кг) розморожують та піддають процесу автолізу на протязі 120-144год при кімнатній температурі, після чого очищують сировину від жиру, подрібнюють. Екстракцію спленіну проводять дихлоретаном при співвідношенні сировина-екстрагент 1:2 на протязі не більше 6 діб при температурі 20°С, залишають для відстоювання. Суміш при відстоюванні поділяється на два шари: верхній - відпрацьована селезінка (мезга), нижній - дихлоретановий екстракт спленіну, який відділяють від мезги за допомогою фільтрації під вакуумом. Одержаний дихлоретановий екстракт у кількості 721л упарюють під вакуумом при перемішуванні та нагріванні до температури 45°С до отримання кінцевого об’єму екстракту 12,3л, який переносять в ділильну лійку, додають 5,88л петролейного ефіру, перемішують 2хв, після чого додають 7,61л 70% спирту етилового. Після відстоювання та розділення фаз нижній шар (водноспиртову фракцію) відокремлюють та повторно оброблюють петролейним ефіром. До ефірної фракції додають 4,0л 70% етилового спирту, перемішують, відстоюють, відділяють водноспиртову фазу та об’єднують з основним очищеним водно-спиртовим екстрактом. Від одного завантаження отримують 12,0л водно-спиртового екстракту спленіну, який упарюють під вакуумом при температурі 45°С до отримання водного екстракту (3,6кг). До водного екстракту спленіну додають 0,13кг натрію хлориду до отримання 0,9% його вмісту в екстракті, збовтують до повного розчинення натрію хлористого та витримують в холодильній камері на протязі 14год при температурі 6°С. Осад, що утворився після висолювання, відфільтровують. Очи щений водний екстракт спленіну (3,75л), розводять фізіологічним розчином до об’єму 12,35л, додають спирт етиловий при перемішуванні. Отриманий розчин спленіну порційно в кюветах піддають опроміненню ртутно-кварцевою лампою на протязі 15хв. Для формування готового продукту одержаний розчин спленіну витримують в термошафі при температурі (28±2) °С на протязі 5 діб, після чого проводять двократну фільтрацію, отримують 13,5л очищеного розчину спленіну (субстанції), який передають на ампулювання [12]. До недоліків способу-прототипу слід віднести наступне: - низький вихід цільового продукту; - складність, тривалість (більше 430 годин), значні енергоємність та трудомісткість технологічного процесу; 5 36640 - використання у великій кількості шкідливих для організму та оточуючого середовища розчинників: дихлоретану, діетилового ефіру та спирту етилового; - наявність стадії автолізу - стадії розкладання білків тваринної сировини на повітрі, яка тривалий термін (від 5 до 6 діб) забруднює оточуюче середовище; - термічна обробка напівпродуктів на стадіях упарювання екстрактів (дихлоретанового та водно-спиртового), яка призводить до розкладання біологічно-активних речовин. В основу корисної моделі поставлено завдання створення способу одержання з селезінки ссавців лікарського засобу шляхом використання необхідних те хнологічних стадій та операцій в такій послідовності та взаємозв’язку і з такими режимами та параметрами, які б забезпечили спрощення та скорочення технологічного процесу, зменшення його енергоємності та трудомісткості без забруднення екологічного стану оточуючого середовища, а також отримання препарату, який має той самий спектр та рівень специфічної активності без токсичних та алергізуючи х властивостей. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання лікарського засобу з селезінки ссавців включає розморожування, подрібнення селезінки, екстракцію, очищення екстракту та консервацію готового продукту, відповідно до корисної моделі, екстракцію селезінки здійснюють водним розчином натрію хлориду (0,8-1,0) % або водним розчином натрію хлориду (0,8-1,0) % з додаванням ніпагіну 0,1% або 0,05% ніпагіну та 0,02% ніпазолу при співвідношенні екстрагента і сировини (1:(8-10), очищення екстракту здійснюють шляхом відокремлення екстракту від мезги центрифугуванням з подальшою ультрафільтрацією, а консервацію готового продукту здійснюють додаванням аскорбінової кислоти, натрію сульфіту та натрію піросульфіту. Поставлена задача вирішується також тим, що у способі, відповідно до корисної моделі, після ультрафільтрації здійснюють ліофілізацію екстракту до одержання сухого продукту. Технічний результат, якого досягають при здійсненні корисної моделі, полягає в підвищенні виходу цільового продукту, спрощенні та скороченні технологічного процесу, зменшенні його енергоємності та трудомісткості при забезпеченні чистоти екологічного стану оточуючого середовища. Наводимо конкретні приклади здійснення корисної моделі. Приклад 1. Заморожену селезінку великої рогатої худоби (19кг - 8 завантажень) розморожують шляхом витримування сировини при кімнатній температурі на протязі 12год до одержання температури у масі сировини 0°С. Розморожену селезінку очищають від жирової капсули. Селезінку подрібнюють на електром’ясорубці та отримують напівпродукт у вигляді суспензії. Як екстрагент використовують водний розчин з вмістом 0,8% натрію хлориду. Подрібнену селезінку (1,8кг - одне завантаження) завантажують в екстрактор, додають 14,4л екстрагента (співвідношення сировини 6 та екстрагента становить 1:8), перемішують на протязі 5хв. Одержану суспензію витримують в холодильній камері при температурі 4°С на протязі 1год. Загальний час екстракції становить 1,5год. Відокремлення екстракту від мезги здійснюють за допомогою центрифугування при температурі 4°С на протязі 40хв. Подальшу очищення екстракту здійснюють на ультрафільтраційній установці. Отримують 112,0л продукту, який стабілізують, додаючи до ультрафільтрату аскорбінову кислоту, натрію сульфіт та натрію піросульфіт у кількості 0,15%, 0,1% та 0,1% від об’єму ультрафільтрату відповідно. Готовий продукт зливають у збірники, герметизують та передають на ампулювання. Приклад 2. Заморожену селезінку великої рогатої худоби (19кг - 8 завантажень) розморожують шляхом витримування сировини при кімнатній температурі на протязі 13год до одержання температури у масі сировини 1°С. Розморожену селезінку очищають від жирової капсули. Як екстрагент використовують водний розчин з вмістом 1,0% натрію хлориду та 0,1% ніпагіну. Селезінку подрібнюють на електром’ясорубці та отримують напівпродукт у вигляді суспензії. Подрібнену селезінку (1,8кг - одне завантаження) завантажують в екстрактор, додають 16,2л екстрагента (співвідношення сировини та екстрагента становить 1:9), перемішують на протязі 6хв. Одержану суспензію витримують в холодильній камері при температурі 5°С на протязі 1год. Загальний час екстракції становить 1,3год. Відокремлення екстракту від мезги здійснюють за допомогою центрифугування при температурі 4°С на протязі 30хв. Подальше очищення екстракту здійснюють на ультрафільтраційній установці. Отримують 126,0л продукту, який стабілізують, додаючи до ультрафільтрату аскорбінову кислоту, натрію сульфіт та натрію піросульфіт у кількості 0,2%, 0,1% та 0,1% від об’єму ультрафільтрату відповідно. Готовий продукт зливають у збірники, герметизують та передають на ампулювання. Приклад 3. Заморожену селезінку великої рогатої худоби (19кг - 8 завантажень) розморожують шляхом витримування сировини при кімнатній температурі на протязі 14год до одержання температури у масі сировини 2°С. Розморожену селезінку очищають від жирової капсули. Селезінку подрібнюють на електром’ясорубці та отримують напівпродукт у вигляді суспензії. Як екстрагент використовують водний розчин з вмістом 0,8% натрію хлориду, 0,05% ніпагіну та 0,02% ніпазолу. Селезінку подрібнюють на електром’ясорубці та отримують напівпродукт у вигляді суспензії. Подрібнену селезінку (1,8кг - одне завантаження) завантажують в екстрактор, додають 18,0л розчину екстрагента (співвідношення сировини та екстрагента становить 1:10), перемішують на протязі 5хв. Одержану суспензію витримують в холодильній камері при температурі 4°С на протязі 1год. Загальний час екстракції становить 1,5год. Відокремлення екстракту від мезги здійснюють за допомогою центрифугування при температурі 4°С на протязі 40хв. Подальше очищення екстракту здійснюють на ультрафільтраційній установці. Отримують 140,0л продукту, який стабілізують, додаю 7 36640 чи до ультрафільтрату аскорбінову кислоту, натрію бісульфіт та натрію піросульфіт у кількості 0,15%, 0,1% та 0,1% від загального об’єму ультрафільтрату відповідно. Готовий продукт зливають у збірники, герметизують та передають на ампулювання. Приклад 4. Заморожену селезінку великої рогатої худоби (19кг - 8 завантажень) розморожують шляхом витримування сировини при кімнатній температурі на протязі 15год до одержання температури у масі сировини 3°С. Розморожену селезінку очищають від жирової капсули. Селезінку подрібнюють на електром’ясорубці та отримують напівпродукт у вигляді суспензії. Як екстрагент використовують водний розчин з вмістом 1,0% натрію хлориду. Селезінку подрібнюють на електром’ясорубці та отримують напівпродукт у вигляді суспензії. Подрібнену селезінку (1,8кг -одне завантаження) завантажують в екстрактор, додають 14,4л розчин екстрагента (співвідношення сировини та екстрагента становить 1:8), перемішують на протязі 10хв. Одержану суспензію витримують в холодильній камері при температурі 4°С на протязі 1год. Загальний час екстракції становить 1,5год. Відокремлення екстракту від мезги здійснюють за 8 допомогою центрифугування при температурі 4°С на протязі 20хв. Подальше очищення екстракту здійснюють на ультрафільтраційній установці. Готовий продукт розливають в ампули і ліофілізують. Способом, що заявляється, отримують лікарський засіб, який регулює метаболічні процеси, нормалізує зміни азотистого обміну, виявляє імуностимулюючу дію, який застосовується в формі ін’єкцій як засіб для лікування та профілактики токсикозів ранніх строків вагітності, недостатності функцій паращитоподібних залоз (гіпопаратиреоз), при захворюваннях, які супроводжуються пригніченням імунної системи (злоякісні новоутворення, туберкульоз та ін.). Лікарський засіб, що заявляється, являє собою безбарвну або жовтува того кольору рідину з характерним запахом або порошок білого або кремуватого кольору і містить у своєму складі комплекс біологічно активних речовин: низькомолекулярні пептиди, нуклеїнові кислоти та їх компоненти, вільні амінокислоти, ліпіди та мікроелементи. Порівняльний аналіз технологічних стадій та їх тривалості заявляемого способу і способупрототипу наведений у таблиці 1. Таблиця 1 Порівняльний аналіз технологічних стадій та їх тривалості заявляємого способу і способу-прототипу Спосіб-прототип Назва стадії 1 1. Розморожування селезінки. 2. Автоліз селезінки 3. Очи щення від жирової капсули 4. Подрібнення селезінки 5. Екстракція селезінки дихлоретаном Заявляє мий спосіб Тривалість стадії (год) 2 14,0 130,0 11,0 1,0 144,0 6. Відокремлення екстракту від мезги 0,6 фільтрацією під вакуумом 7. Упарювання дихлоретанового до 8,0 водного екстракту 8. Очищення водного екстракт спле2,0 ніну петролейним ефіром та спиртом етиловим 9. Упарювання спирто-водного до во2,0 дного екстракту спленіну 10. Висолювання з водного екстракту 14,0 натрію хлоридом 11. Фільтрація осаду 0,5 12. Розведення водного екстракту фізіологічнимрозчином, консервування 0,2 спиртом етиловим 13. Опромінення ртутно-кварцевою 0,4 лампою 14. Формування готового продукту 120,0 Загальна тривалість процесу 447,7год Вихід становить: з 540кг сировини отримують 13,5л готового продукту Сухий залишок становить 1% Назва стадії 3 1. Розморожування селезінки 2. Очи щення від жирової капсули 3. Приготування екстрагента: водного розчину натрію хлориду та антимікробного засобу 4. Подрібнення селезінки 5. Екстракція селезінки підготовленим екстрагентом 6. Відокремлення екстракту від мезги центрифугуванням Тривалість стадії (год) 4 14,0 0,5 5,0 1,0 1,5 0,7 7.Ультрафільтрація екстракту 6,0 8. Стабілізація готового продукту (ультрафільтрату) 1,5 Загальна тривалість процесу 30,2год Вихід становить: з 19кг сировини отримують 142,0л готового продукту; С ухий залишок становить 2% 9 36640 Технологічний процес заявляемого способу одержання лікарського засобу має такі переваги у порівнянні зі способом-прототипом: - підвищення виходу готового продукту; - селективне (вибірне) здобування біологічно активних речовин з сировини завдяки підібраному складу екстрагента; - зменшення кількості технологічних стадій майже у 2 рази, а тривалості технологічного процесу одержання цільового продукту - у 14,8 разів; - зменшення енергоємності та трудомісткості; - відсутність шкідливих для організму людини та для екології розчинників: дихлоретану, діетилового ефіру та етилового спирту; - відсутність стадії автолізу - тривалої (здійснюється на протязі 5-6 діб) стадії розкладання білків тваринної сировини на повітрі, яка забруднює оточуюче середовище; - відсутність стадії висолювання, на якій відбуваються втрати біологічно активних сполук; - відсутність стадій упарювання дихлоретану та водного спирту під вакуумом при температурі 40-50°С, які призводять до значних втрат цільового продукту; - отримання готового продукту з високою активністю та стерильністю завдяки визначеним необхідним умовам здійснення очищення екстракту шляхом ультрафільтраційного процесу (зокрема, підібраним розмірам поруватості фільтру), який дозволяє одночасно з баластними речовинами звільняти екстракт від бактерій, вірусів та пірогенних сполук; - стабілізація готового продукту завдяки підібраному якісному та кількісному складу стабілізаторів та антиоксидантів. Взаємозв’язок та послідовність технологічних операцій заявляємого способу, підбір режимів і параметрів (температура, іонна сила розчину, тривалість циклу та ін.) повністю забезпечують виконання поставленого завдання. Як екстрагент використовують водний розчин натрію хлориду (0,8-1,0) % або натрію хлориду (0,8-1,0) % та ніпагіну 0,1% або замість ніпагіну суміш ніпагіну 0,05% та ніпазолу 0,02%, у підібраних співвідношеннях, які забезпечують оптимальні умови екстракції. Концентрація натрію хлориду (0,8-1,0) % обумовлена необхідністю створення ізотонічності ін’єкційної лікарської форми, що важливо при парентеральному введенні лікарського засобу в організм людини. Якісні та кількісні дані відносно консервантів (або консерванту), які входять до складу екстрагента (ніпагін або суміш ніпагіну з ніпазолом) обумовлені необхідністю дотримання норм мікробної чистоти на протязі усіх стадій технологічного процесу, що позитивно впливає на вихід,термін зберігання та застосування кінцевого продукту. При використанні консервантів (консерванту) в кількості, менше заявляємих значень, не достатньо проявляється антимікробна дія, а в кількості, більше заявляємих значень - виявляється їх токсичність. Заявляємі співвідношення сировини та екстрагента (1:(8-10) визначені експериментально. При кількості екстрагента менше заявляємих значень спостерігається зниження швидкості та повноти 10 екстракції фізіологічно активних речовин; при використанні екстрагента в кількості більше заявляємих значень відбувається розбавлення розчину за основними діючими речовинами, що негативно впливає на подальші стадії та знижує ви хід цільового продукту. Термін екстракції (1год 20хв - 1год 30хв) дорівнює терміну завершення процесу агрегації нерозчинного клітинного матеріалу та баластних речовин з одночасним переходом в екстракт розчинних фракцій пептидів та інших біологічно активних сполук. При тривалості екстракції менше заявляємого терміну не встигає повністю пройти процес агрегації. Збільшення терміну процесу екстракції вище заявляємого значення призводить до переходу в екстракт токсичних домішок. Відокремлення екстракту від мезги за допомогою підібраних умов та режиму центрифугування дозволяє уникнути значних втрат цільового продукту. Температурний фактор значно впливає на активність речовин білкової природи, до яких відносяться біологічно активні сполуки лікарського засобу, що отримують по заявляємому способу. Основні технологічні процеси в заявляємому способі проводяться при знижених температурах, зокрема, при (6+2) °С, при якій небажані процеси, що можуть проходити в екстракті (окислення, протеоліз, розкладання, осмолення та ін.), значно уповільнюються. При підвищенні температури вище 20°С до екстракту переходять супутні домішки, які не мають фізіологічної активності. Експериментально визначені режими та параметри проведення ультрафільтраційного процесу для отримання готового продукту з високою активністю та стерильністю, зокрема, завдяки підібраним розмірам поруватості фільтру (10Å), що дозволяє одночасно з баластними речовинами звільняти екстракт від бактерій, вірусів та пірогенних сполук. Лікарський засіб, отриманий по заявляємому способу, являє собою комплекс речовин, що містить, головним чином, низькомолекулярні пептиди, ліпіди, нуклеїнові кислоти, вільні амінокислоти та мікроелементи. Наявність в цих молекулах функціональних груп з рухливим атомом водню може привести до втрати біологічної активності за рахунок окислення препарату під дією кисню повітря з утворенням продуктів розкладу. Для отримання лікарського засобу, стабільного при зберіганні та використанні, в очищений екстракт додають стабілізатори (натрію сульфіт, натрію піросульфіт) та антиоксидант (аскорбінову кислоту). Вони відповідають необхідним вимогам: запобігають процесам окислення розчину лікарського засобу киснем повітря, мають ефективність при малих концентраціях, нешкідливість у припустимих дозах та хорошу розчинність, а також володіють антимікробною дією і використовуються як консерванти для ін’єкційних розчинів. Проведені обмежені клінічні дослідження лікарського засобу, який одержують за заявляємим способом, з метою визначення ефективності та безпечності препарату, що має імуномодулюючу 11 36640 та дезінтоксикуючу дію у хворих цукровим діабетом типу 1 та типу 2. На підставі даних клінічних досліджень імуномодулюючу ефективність лікарського засобу (отриманого за заявляємим способом) при лікуванні хворих цукровим діабетом оцінюють як помірно-високу. Підтверджується дезінтоксикаційна ефективність препарату. По сукупності даних препарат є безпечним у застосуванні, тому що відсутні побічні явища. Таким чином, заявляємий спосіб одержання лікарського засобу з селезінки ссавців у порівнянні зі способом-прототипом має наступні переваги: підвищення виходу цільового продукту, спрощення та скорочення технологічного процесу, зменшення його енергоємності та трудомісткості при збереженні чистоти екологічного стану оточуючого середовища. Література: 1. Патент Российской Федерации №2142284, кл. А61К35/28. Опубл. офиц. бюл. "Изобретения" от 10.12.1999. 2. Патент України №27540, кл. А61К35/28. Опубл. 15.09.2000, бюл. „Промислова власність", 2000, №4. 3. Заявка на видачу патенту України на Корисна модель №94020324, кл. А61К35/407. Опубл. 29.09.1995, бюл. „Промислова власність", 1995, №3. 4. Заявка на видачу патенту України на Корисна модель №94061620, кл. А 61 К 35/407. Опубл. Комп’ютерна в ерстка Л. Купенко 12 29.09.1995, бюл. "Промислова власність", 1995, №3. 5. Патент України №75736, кл. А61К35/28, А61К35/42, С07Н19/20, С07К1/00. Опубл. 15.05.2006, бюл. „Промислова власність", 2006, №5. 6. Патент Российской Федерации №2152219, кл. А61К35/28, А61К38/02. Опубл. офиц. бюл. "Изобретения" от 10.07.2000. 7. Патент Российской Федерации №2153343, кл. А61К35/28. Опубл. офиц. бюл. "Изобретения" от 27.07.2000. 8. Патент №ЕА4788, кл. А61К35/48; А61К35/54; А61Р37/02; А61Р43/00; А61К35/48; А61Р37/00; А61Р43/00. Опубл. 26.08.2004. 9. Патент Российской Федерации №2033796, кл. А61К35/28. Опубл. офиц. бюл. "Изобретения" от 30.04.1995. 10. Патент Российской Федерации №2164142, кл. А61К35/14, А61К35/407, А61К35/28, А61К35/64. Опубл. о фиц. бюл. "Изобретения" 20.03.2001. 11. Патент Российской Федерации №2192264, кл. А61К35/28. Опубл. офиц. бюл. "Изобретения" 10.11.2002. 12. Промисловий регламент на виробництво спленіну-субстанції (ПР 64-34-36-90). Міністерство медичної промисловості. Київське виробниче хіміко-фармацевтичне об’єднання "Дарниця" (прототип). Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601