Штам синьо-зелених водоростей spirulina platensis – продуцент біологічно активних речовин з антибластомними та антимікробними властивостями

Штамм синезеленых водорослей Spiruhna platensis (Nordst) Geitl № HPDP-60/128 - продуцент активных веществ с антибластомными и антимикробными свойствами Изобретение относится к биологии и медицине и представляет собой штамм синезеленых водорослей - продуцент биологически активных веществ, которые могут быть использованы в медицинской практике и пищевой промышленности Известно, что многие гидробионты являются продуцентами биологически активных веществ (см например, Кирпенко Ю А , Сиренко Л А , Орловский В М и др Токсины синезеленых водорослей и организм животного К, Наукова думка, 1977, 251 с , Гурин И С , Ажгихин И С Биологически активные вещества гидробионтов - источник новых лекарств и препаратов М , Наука, 1981 136 с) В настоящее время используются около 50 химиотерапевтических средств из гидробионтов Эти препараты относятся к различным группам химических соединений и имеют различные механизмы бактерицидного и цитостати чес кого действия Клинически и экспериментально установлено, что при ряде гемобластозов и солидных опухолей с помощью этих средств может быть достигнуто полное излечение Известен штамм синезеленой водоросли HPDP-25 Oscillatona neglegta Lemm , продуцент биологически активных веществ с антибластомными и антимикробными свойствами (заявка на изобретение № В 4401174/4 (3684) Института гидробиологии НАНУ) Однако этот штамм существенно отличается по спектрам биологической активности от предлагаемого HPDP-25 эффективен при карциномах, a HPDP-60/128 проявляет химиотерапевтическое действие при лимфоидных опухолях Задача настоящего изобретения - выращивание в индустриальной культуре специально адаптированного к условиям интенсивного культивирования штамма Spiruhna platensis (Nordst) Geitl HPDP-60/128 Дикий штамм этой водоросли выделен из солоноватоводного водоема в районе г Геническа (Украина) в 1989 г и введен в культуру путем многократных пересевов с помощью микробиологической петли на агаризованной среде Заррукка в пятикратном разведении Выделенный штамм характеризовался большой устойчивостью к бактериальному загрязнению, но продуктивностью (максимально 0,9-1,0 г/л сухого вещества) Биологически активные вещества гидробионтов характеризуются широким спектром и высоким уровнем физиологической активности, поэтому в последние годы все чаще используются для получения ценных лекарств и препаратов (Ажгихин И С , Шпаков Ю Н , Кипиани Р Е и др Морская фармация - Кишинев, 1982 - 259 с , Сиренко Л А Козицкая В Н Биологически активные вещества водорослей и качество воды - К , Наукова думка - 1988 - 256 с Апрышко Г Н , Нехорошев М В Противоопухолевые препараты из морских организмов - М Медицина и здравоохранение, сер Фармакология и фармация, вып 2, 1989 - 6 0 с, Pulz О, Franke Н , Peme G et al, AlgenBiotechnologie, 1995) Анализ имеющейся литературы свидетельствует, что наибольший интерес представляют индивидуальные вещества с полезными фармакологическими свойствами, особенно цитостатическими противоопухолевыми и антимикробными Зоя Путем отсева быстро растущих трихомов и оптимизации условий выращивания достигнуто О го 00 го го 43383 повышение продуїсгивности штамма Штамм адаптирован к неразведенной среде Заррука, широкому диапазону температуры (20-36°С), освещенности от 2,5 до 30 клк и росту в закрытом фотобиореакторе в циркуляционном режиме В результате проведенных исследований методом клоновой селекции получен штамм спирулины HPDP60/128 с продуктивностью в оптимальных условиях до 5-6 г/л сухого вещества (среда Заррука, температура 30-36°С, освещенность не ниже 5 клк и не выше 15 клк) Адаптированный штамм Spirulma platensis (Nordst) Geitl HPDP-60/128 имеет следующие культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки Морфологические признаки При выращивании штамма на жидкой среде Заррука при температуре 20-32°С, освещенности 5-20 клк скорости перемешивания не выше 0 , 1 0,2 м/сек трихомы сохраняют спирализацию, образуя по длине нити от 3 до 5 крупных витков спирали Диаметр витков спирали трихомов 160-180 мкм, расстояние между витками 400-500 мкм Ширина нити трихома 5,8-9 мкм, длина трихома до 3000 мкм Трихомы синезеленого цвета Форма клеток изменяется от прямоугольной до бочонковидной Длина клеток 3-7 мкм, ширина 4-5 мкм У поперечных перегородок клетки имеют типичную для р Spirulma грануляцию Их число в одной клетке колеблется от 5 до 25 Газовые вакуолы четко видны Культуральные свойства В жидкой среде Заррука водоросль растет в виде спиралевидных трихомов различной степени изогнутости, которые находятся во взвешенном состоянии По мере старения и в отсутствие перемешивания трихомы оседают на дно сосуда, затем всплывают на поверхность и скапливаются в пристеночных участках последнего, спиральность уменьшается Жидкая культура имеет окраски от голубовато- до сине-зеленой в зависимости от возраста и уровня освещенности На агаризованной среде с наслаиванием жидкого слоя водоросль растет радиально располагающимися колониями В зависимости от темпа роста регистрируются отдельные трихомы, их скопления в виде пучков или глобул Цвет от голубовато-синего до сине-зеленого В условиях экстенсивной культуры (освещенность до 2 клк, температура 20-26°С перемешивание не чаще 5-6 раз в день в суспензии накапливается до 1,0-1,5 г/л сухого вещества (продолжительность выращивания не менее 20 дней) При интенсивном выращивании (трубчатый стеклянный фотобиореактор, скорость протока до 0,1-0,2 м/сек при использовании не центробежных насосов) при начальном засеве 0,2-0,3 г/л сухого вещества, освещенности не менее 20 клк и температуре 30-36°С максимальное накопление биомассы в среде роста достигает 6 г/л сухого вещества Размножение Вегетативное, путем деления клеток и фрагментации трихомов на отдельные гормогонии В оптимальных условиях относительная скорость роста равна 0,22 ч \ что соответствует минимальному времени удвоения 4,5 час Маркерные признаки Штамм устойчив к снижению температуры до 18-20°С, хорошо развивается на разведенной 75% среде Заррука, вместо дистиллированной воды предпочитает природную (кипяченую) гидрокарбонатно-кальциевоготипа 2-го класса При освещенности до 2 клк трихомы имеют темно-голубую окраску за счет усиления образования С-фикоцианина Этот синий пигмент выделяется при подсыхании культуры на границе раздела двух сред Спиралевидность трихомов и их голубоватозеленая окраска хорошо сохраняется даже при высушивании до порошка Физиолого-биохимические признаки Штамм спирулины HPDP-60/128 из форм минерального азота предпочитает нитраты (натрий азотнокислый, калий азотнокислый) Источником углерода для водоросли служат карбонаты и гидрокарбонаты натрия и калия Оптимальная температура 30-36°С позволяет отнести его к числу мезофильных и термофильных форм Автотроф Оптимальная освещенность находится на уровне 6-10 клк Оптимум рН 8,5-10,5 По мере развития на свету происходит подщелачивание питательной среды до рН 11-14 Подщелачивание выше 10 тормозит рост и накопление биомассы Пигментный комплекс представлен хлорофиллом а, бета-каротином, миксоксантофиллом, криптоксантином, зеаксантином, С-фикоцианином Получаемая биомасса содержит не менее 50% белка со всеми незаменимыми аминокислотами (цистин, лизин, гистидин, аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, треонин, серин, фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан), которые составляют 40% общего количества аминокислот Углеводы составляют 10-20% биомассы, липиды 6-7% В их составе найдены ейкозеновая, линоленовая, линолевая, олеиновая, миристиновая, стеариновая и др жирные кислоты Богат и разнообразен состав витаминов бета-каротин 600-1700 мг/кг, витамин В1 (тиамин) от 3,5 до 40 мг/кг, витамин В2 - от 10 до 55 мг/кг, витамин Е - от 150 до 200 мг/кг, достаточно высокое содержание биотина, пантотеновой и фолиевой кислот, а также комплекс других биологически активных веществ (БАВ) Из биомассы штамма выделено БАВ Sp-1, обладающее антимикробным и антибластомным дейстием Sp-1 представляет собой полипептидно-полисахаридный комплекс, содержащий в своем составе 32 аминокислотных остатка, брутто-формула пептидного компонента (СО Н N S) 131 38 224 4511 4 Он имеет 4 дисульфидных сязи Цис 16- Цис 30, Цис 12- Цис 21 Цис 6- Цис 14, Цис 18 - Цис 24 Вещество представляет собой полипептидную цепочку, свернутую в спираль и стабилизированную дисульфидными связями Поставленная задача изобретения поясняется следующими примерами Пример 1. Сохранение штамма в коллекции осуществляют на жидком (полной) или агаризованной разбавленной (50-75%) среде Заррука Среду готовят последовательным растворением в 43383 дистиллированной воде следующих компонентов (г/л) NaHCO 3 -16,6, K2HPO4X ЗН2О 1,0 NaNO 3 -2,5, K 2 SO 4 -1,0, NaCI - 1,0, MgSO4 x 7H2O - 0,2, CaCI2 x 6H2O -0,04, FeSO 4 x7H 2 O-0,01, EDTA - 0,08 Раствор микроэлементов по Арнону - 1 мл/л Состав раствора микроэлементов, г/л НзВОз - 2,86, MnCI2 х 4Н2О - 1,81, ZnSO4 x 7Н2О - 0,22, CuSO4 х 5Н2О - 0,08, МоО3 - 0,015, NH4VO3 - 0,023, K2Cr2(SO4)3 х 24Н2О - 0,096, NiSO4 х 7Н2О - 0,48, Na2WO4 x 2Н2О - 0,018, Ti 2 (SO 4 ) 3 - 0,040, Co(N) 3 ) 2 x6H 2 O-0,044 После стерилизации среду охлаждают и вносят инокулят посевного материала штамма HPDP-60/128 в количестве 0,2-0,4 г/л сухого вещества При освещенности 5-8 клк, температуре 28-30°С на 7-ой день запуска фотобиореактора концентрация биомассы достигает 6,2-6,5 г/л сухого вещества и поддерживается на таком режиме при непрерывном культивировании (ежедневно из фотобиореактора сливается 1/3 объема и вносится свежая питательная среда) Пример 2. Получение инокулята для засева фотобиореактора осуществляют путем переноса культуры штамма-продуцента из агаризованной среды в инокулятор с жидкой питательной средой Заррука Выращивание посевного материала проводят при температуре 25-30°С, освещенности до 5-6 клк и перемешивании насосом в течение 5-7 дней При достижении плотности биомассы 1,5-2,5 г/л сухого вещества инокулят используют для посева после проведения микроскопического контроля его альгологической чистоты Пример 3. После интенсивного выращивания продуцента в фотобиореакторе биомассу водоросли отделяют от питательной среды путем фильтрования через мельничный газ номер 76, промывают от метаболитов 2-3 раза чистой питательной средой От культуральной среды биомассу выделяют центрифугированием (при 10-12 тыс ) Полученную клеточную массу элюируют спиртом, элюат разделяют на колонке с ионообменной смолой, вымывают с колонки полипептидо-полисахаридную фракцию Sp-1 Чистоту ее проверяют электрофорезом Полученное вещество лиофилизируют и используют для проверки биологической активности Пример 4 Противоопухолевое действие вещества Sp1 из штамма HPDP-60 было испытано в отношении трансплантированных опухолей различного генеза и локализации - эпителиальных, соединительнотканых, лимфоидных (табл 1) Введение вещества животным производили внутрибрюшинно в дозах 0,1-0,5 ЛД50 на протяжении 15 дней Как видно из табл 1, в большинстве случаев при введении вещества у животных наблюдали полную резорбцию солидных опухолей, а продолжительность жизни животных с гематобластозами увеличивалась до 400%, если за 100% принималась продолжительность жизни контрольных животных с опухолями Вещество преимущественно проявляло химиотерапевтическое действие в отношении лимфоидных опухолей Пример 5. Вещество Sp-1 из биомассы штамма HPDP60 вводили животным с индуцированными различными химическими веществами (канцерогенами) опухоли Методика введения была такой же, как и в примере 1 Как видно из табл 2, процент торможения индуцированных опухолей в основном был несколько ниже, чем у трансплантированных (например, опухоли, индуцированные метилбензилнитрозоамином), но эффект антибластомного действия регистрировался во всех вариантах опыта Пример 6 Цитотоксическая и цитостатическая активность Sp-1 проверена по отношению к фибробластам эмбрионов крыс и человека, асцитным клеткам, клеткам костного мозга щенка, злокачественным клеткам рака шейки матки Hela, злокачественным клеткам рака гортани НЕР-2 в концентрациях 15-145 мг/дм3 Установлено наличие активности при всех испытанных концентрациях, причем культуры клеток злокачественных опухолей были на 5-10 порядков чувствительнее немалигнизованных Пример 7. Антимикробные (бактерицидные) свойства Sp-1 проверены на различных штаммах микроорганизмов (табл 3) Как видно из нее, бактерицидный эффект проявлялся в отношении грамположительной и грамотрицательной, спороносной и аспорогенной микрофлоры и некоторых полирезистентных госпитальным штаммов Таким образом, метаболиты штамма Spirulma platensis (Nordst) Geitl , депонированного в Институте гидробиологии НАНУ под номером HPDP-60, могут применяться как превентивное и лечебное средства при опухолях патологии, что указывает на необходимость их дальнейшего широкомасштабного изучения и клинических испытаний 43383 Таблица 1 Эффективность и спектр актибластомного действия Sp-1 на трансплантированные животным опухоли различного генеза Дозы Sp-1, мг/кг Индекс эффективности % торможения роста опухолей Карцинома Герена 50 5,73 94,27 Карцинома Эрлиха 50 7,37 86,43 Карцинома Брауна-Пирс 50 Карцино-саркома Уокера 50 9,41 89,37 Саркома 45 50 11,48 91,29 Саркома Иенсена 50 3,88 74,21 Саркома Крокера 250 3,62 72,39 Саркома 37 50 9,73 89,72 Лимфома ЛИО-1 50 29,95 96,29 Лейкоз J1-IV 50 Лейкоз NK/Ly 50 -" -" Лейкоз L-1210 50 -" -" Виды опухолей Опухоли и метастазы отсутствуют Продолжительность жизни животных 60 дней, а в контроле 15 дней Таблица 2 Эффективность и спектр актибластомного действия Sp-1 на индуцированных химическими веществами опухолях у животных Виды опухолей индуцированные мутагенами Дозы Sp-1, мг/кг Индекс эффективности % торможения роста опухолей Метилхолантреном 70 4,32 76,88 Диметилбензантраценом 70 18,35 94,55 Метил нитрозомочевиной 70 38,27 68,06 Метилбензилнитрозоамином 70 21,23 37,75 Бенз-альфа-пиреном 70 27,88 49,57 Таблица 3 Спектр и концентрации антимикробного влияния вещества на микроорганизмы Штамм микроорганизма Действующая концентрация, %: бактериостатическая бактерицидная Staphylococcus aureus N 209 0,001 0,1 Staphylococcus haemohticus 0,002 0,02 Staphylococcus faecahs 0,001 0,01 Salmonella typhi 0,03 0,3 Schigella dysentenal (Shiga) 0,03 0,3 Eschenchia coh 0,001 0,01 Proteus vulgans 0,03 0,3 43383 Тираж 50 екз Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м Ужгород, вул Гагаріна, 101 (03122) 3 - 7 2 - 8 9 (03122) 2 - 5 7 - 0 3 43383