Штам синьозелених водоростей oscillatoria neglecta lemm. – продуцент біологічно активних речовин з антибластомними та антимікробними властивостями

Штамм синезеленых водорослей Osciltatona neglecta Lemm № 25 HPDP - продуцент биологически активных веществ с антибластомными и антимикробными свойствами Изобретение относится к биологии и медицине и представляет собой штамм синезеленых водорослей - продуцент биологически активных веществ, которые могут быть использованы в медицинской практике и пищевой промышленности Известно, АТО многие гидробионты являются продуцен тами био логиче ски акти вны х ве ществ (И С Турин, И С Ажгихин Биологически активные ве ще ства гидроби он тов - и сточник новы х лекарств и препаратов /Москва Наука, 1981 - 136 с, Г Н Апры шко, М В Не хорошее Про тивооп ухолевые препараты из морских организмов - М Медицина и здравоохранение сер Фармакология и фармация, вып 2, 1989 - 60 с) При анализе видно, что наибольший интерес представляют индивидуальные вещества с полезными фармакологическими свойствами, особенно цитостатическими, противоопухолевыми и антимикробными К настоящему времени используются около 50 химиотерапевтических средств из гидробионтов Э ти препараты относятся к различным группам химических соединений и имеют различные механизмы бактерицидного и цитостатического действия Клинически и экспериментально установлено, что при ряде гемобластозов и солидных опухоля х при помощи этих средств может быть достигнуто полное излечение Основными требованиями к противоопухолевым и антимикробным препаратам являются достижение максимальной избирательности действия и целевой активности без сопутствующего влияния на др угие ор ганы и системы, а также наличие сырьевой базы для получения вы ше указанных веществ Известна противоопухолевая активность комплекса вы тяжек из синезеленых во дорослей , вегетир ующи х в природных усло виях Приводятся сведения по противоопухолевой активности синелеленых водорослей Microcystis aeruginosa, Aphanizomenon flos-aquae, Anabaena vartabihs в отношении культуры злокачественного новообразования че ловека Нер-2 , Неіа (Ю А Кириенко, Л А Сиренко, В М Орловский, Л Ф Лукина Токсины синеэеленых водорослей и организм животного Киев На ук думка, 1977 - 252 с, с 90 -93) Дихлорэтан-изопропаноловый экстракт синезеленой водоросли Scytonema pseudohoffmani содержит макролиды сцитофицины А, В, С, Д, Е. обладающие противоопухолевой активностью (М Ishibashi, R E Moore, G М Pa tterson et al Scytophycins cytoto xic and antimycetic agents from cyanoph ytae Scytonema pseudohoffmaru// J Org C h em -1 98 6 , № 51 -P 53 0 0-53 0 6) Многими авторами описано уменьшение численности микроорганизмов при интенсивном развитии синезеленых водорослей и скачкообразное их увеличение при отмирании последних ("Цветение " воды - Кие в На ук думка , вып I. 1968-250 с) Широкий спектр ан тимикробной активности описан у синеэеленых водорослей и и х ме та боли то в Micro cys tis ae rugi nosa, Ap ha nizomenon flos-aquae, Anabaena vanabilis в отношении сапрофитной, патогенной и условно патогенной флоры (Ю А Кмрпенко и др Токсины сине (46) 15 09 2000. Бюп Ыв А, 2000 р (72) Сіренко Лідія Якимівиа, Кірпенко Юрій Олексійович, Кірпенко Наталія Іванівна Романенко Олександр Вікторович Панфьоров Віктор Миколайович, Паршикова Тетяна Вікторівна (73) Інститут гідробіологи НАН України (56 ) GML Patterson , T R No rton , E Fu rusa va e t а\ Antmeoplastfc evaluation of mann algal extracts // Bo t mar - 19 84 - 27 , № 1 0 , p 48 5-4 87 О со CM 27446 зеленых водорослей и организм и-ияотного Киев Наук думка 1977 - С 7В 00) Наиболее близки к заявляемому изобретению по фармакологическим свойствам водные экстракты синеэеленой водоросли Oscillalona, обладающие противоопухолевой активностью, выражающейся в увеличении продолжительности жизни мышеи и инигибироиании асцитной опуголи Эрпи ха {G М L Pa tte rson Г R No rton E Furusawa el al Antineopiastic evaluation of mann alqal extracts // Oo t m a r -1 9 8 4 -2 7 , №1 0 -P 4 8 5 -4 8 / ) Однако эта водоросль вегетирует в естественных условиях в морской воде и образует небольшие (микроскопические) скопления биомассы, чго не позволяет решить задачу практического по лучения биологически активных ве ществ' Кроме того, природные источники сырья гидробионтов не удовлетворяют многим требованиям, в частности, стабильность активности и чистота метаболитов Поэтому не исключено колебание фармакологической активности их, загрязнение метаболитами други х гидробионтов, образование конъюгатов с различными веществами Сказанное выше обусловливает маловыгодные экономические ситуации, связанные с сырьевой базой Помимо указанных недостатков, водный экстракт обладает узким спектром противоопухолевой активности Альтернативой сбора гидробионтов в природных водоемах может являться их искусственное культивирование Задача настоящего изобретения - получение нового штамма HPDP-25 Gsaiiatona neglecta Lemm с определенным морфологическим статусом и стабильной активностью продуцируемых веществ Штамм введен в культур у в мае 1992 г Выделен из природных обрастаний придонных камней загрязненного ручья г Япты Вода в месте выделения обогащена разлагающимися органическими веществами и сероводородом Развивается в иловых отложениях и природных обрастаниях пресных и солоноватоводных водоемов Штамм выделен методом многократных пересевов с помощью микробиологической петли на агаризованной среде Громова Отсевались молодые отрастающие трихомы Интенсивная культура на жидкой среде Фитцджеральда при температуре 26-32°С, осве щении 12-30 клк Штамм во доросли кла сси фициро ван по общепризна нном у "Опр еде ли телю пре сно водных водоро слей СССР в 2 Синезеленые во до р осли Авто р ы Г о л ле р ба х М М , Ко си н ска я fc К , По лянский В И Государственное изда тельство "Советская наука", М 1953, описание водоросли представлено в книге на стр 439, п 60 Oscillatona negiecta Lemm Штамм отличается от други х по морфологическим, физиологическим характеристикам и фармакологической активности своих метаболитов Морфологические особенности Величина клеток ширина 0 9-13 микрона, длина 1 ,1-2,0 микрона Форма клеток цилиндрическая нитчатая Отличительные признаки длина в 1-2 раза больше ширины трихомы у поперечных перегородок перешнурованы клеточные оболочки толстые, верхняя клетка с утолщенной оболочкой Физиологические особенности в отличие от други х штаммов хорошо расте т на слабочагр ужентй содой среде {например, среде Фи тцджеральда в модификации Цендера и Горема в наШРИ модификации) Близкие штаммы предпочитают среду .Чарукка с высоким содержанием соды П огличие от других видов и штаммов характеризуется высокой фармакологической активностью - цитотоксическая активность в культуре клеток Hep 2 проявляе тся в концентрации 810 мг/л, - противоопухолевая активность проявляет ся при подкожном введении метаболи тов в дозе 0,1 мг/кг на протяжении 10 дней с момента регист рации появления опухоли, - противометастатическая активность в от ношении перевивных опухолей Бро уна-Пирс, кар циному Эрли ха проявляе тся при подкожном вве дении метаболитов по 0,1 мг/кг за 5 дней по имп лантирования, - антимикробная акти вность в о тно шении патогенной, условно-патогенной и сапрофитной микрофлоры проя вляе тся в концен трации 0,1% Питательная среда для культивирования штамма включает 9 осно вны х компонентов и 13 дополни тельных Основные, г/л. натрий азотнокислый 0 496 калий фосфорнокислый од незамещенный 0.039, магний сернокислый семиводный 0,075, хлористый кальций 0,036, натрий карбонат 0,020, натрий кремневокислый 0 ,053, железо лимонно кислое 0,006 , лимонная кисло та 0,006; трилон Б (ЭДТА) 0,001 Дополнительные компоненты (при работе на дистиллированной воде) добавляются после стерилизации из расчета 0,08 мл/л следующего раствора (соли в г/л) борная кислота 3,1, марганец сернокислый водный 2,23, цинк сернокислый семиводный 0,287, молибденовоаммонийные квасцы 0,088, кобальт азотнокислый четырехводный 0,146, натрий вопьфрамовокислый водный 0,033, калий бромистый 0,119, калий йодистый 0,083, кадмий азотнокислый четырехводный 0,154, никель сернокислый в комплексе водный с сульфатом аммония шестиводным 0,198, висмутсульфа т двухводный 0,020, алюмокалиевых квасцы двадцатичетырехводные 0,474, хромазотнокислый семиводный 0,037 Штамм продуцирует биологически активные вещества (БАВ) на все х стадиях своего развития Для получения метаболита имеет значение только время наработки нужного количества биомассы В условия х режима интенсивного культивирования оно может составлять в закрытых трубчатых фотобиореакторах {объемом 2500 л) от 7 до 14 дней Конечный продукт получают из биомассы штамма путем водной экстракции с последующим ионообменным выделением согласно методу, описанному в "Определение токсинов синеэеленых водорослей в воде и рыбе, диагно стика отра вления рыб в период интенсивного "цветения" воды, Киев, 1986 АН Украинской ССР Институт гидробиологии Авторы Маляреаская А Я , Сиренко Л А , Карасина Ф М . Кириенко Н И Методические рекомендации - 42 с Тип размножения вететативныи, бесполый 27446 Условия размножения нейтрофил, термофил, автотро ф, температура интенсивного размножения 26-32°С, осве щение 12-30 клк Пересев на агэризованную среду 1-2 раза в месяц, на жидкой среде - не менее 3 раз в месяц Характеристика роста колоний образует плотные дерно вины ярко синезеленого цве та, форма разнообразна Трихомы бледно-зеленые, более или менее прямые Рост нитей начинается через 1-2 часа после пересева, период удвоения биомассы в оп тимизиро ванны х условия х 13-15 час Другие признаки из каротиноидов - бета-каротин, эхиненон, криптоксантин, зеаксантин, миксоксантофил, осциллаксантиноподобный пигмент, содержит С-фикоциан Обладает высокой ростингибирующей активностью метаболитов, что вызывает самоотравление и прекращение роста 1 Культивирование штамма Oscillatorta neglecta Lemm Интенсивное культивирование штамма проводили с использованием жидкой среды Фитцджеральда В лабораторных условиях получали суспензию водоросли с высокой плотностью клеток, которую затем засевали в фотореактор и выращивали на той же среде при температуре 26-32°С и осве щении 12-30 кпк 2 Цитостатическая активность штамма Oscillatona neglecta Lemm на культуре клеток Музейную культур у Нер-2 в виде клеточной суспензии засевали в пробирки со средой 199 + гидролизат лактальбумина + бычья сыворотка и инкубировали в течение 2 суток до получения сплошного монослоя клеток На вторые сутки производили замену среды роста на среду поддержки, состоящую из среды 199 + гидролизат лактапьбумина Исследуемые концентрации метаболита штамма Oscillatona neglecta растворяли в среде 199 и вносили в опытные пробирки Учет результатов производили через 24, 48, 72 и 96 часов Учитывали степень дегенерации культуры клеток по общепринятой 4-балльной системе 4 балла полная дегенерация, 3 - частичная, 2 - выраженная, 1 - сомнительная Результаты эти х исследований приведены в табл 1 Таким образом, как видно из данных табл 1, дегенерация культуры клеток Нер-2 под влиянием метаболитов Oscillatona neglecta Lemm наблюдается через 24 часа при концентрации 8 101 мг/л 3 Влияние метаболитов Oscillatona neglecta Lemm на перевивные опухоли у животных Противоопухолевая активность штамма Oscillatona neglecta Lemm испытана на 19 видах перевивных опухолей различных гистологических типов (ліителиальньїх, соединительнотканных, лимфоидных) и 2 видах индуцированны х опухо лей, вызванных метилхолантреном и диметилбензантраценом Исследования проведены в соответствии с требованиями к работе с химиотерапевтическими препаратами При этом учитывали динамику разви тия оп ухоли по вели чине и весу (при забивке или гибели животного), продолжительность жизни животных, некоторые закономерности метастазирования опухолей, гистологическую картин у В качестве примеров приведено действие метаболито в Oscillatona neglecta Lomm на развитие карциномы Герена и саркомы Иенсена в табл 2 , 3 4 Мета боли ты Osciliafona negle cta в дозе 0,1 мі /кг вводили животным под кожу с 5-го дня после прививки опухолей {когда опухоли четко контурируются) на про тяжении 10 дней В результате экспериментальные животные все выжили при полном отсутствии опухолей Установлено, что после 10-дневного лечения метаболитами Osciilatorta neglecta Lemm опухоли на 15-й день эксперимента лизируются и в дальнейшем не определяются, животные развиваются нормально до забивки для гистоло гических исследований При пере ви вании асци тной кар циномы Эрлиха у контрольных животных наблюдали развитие оп ухолей с множественными метастазами При этом продолжительность их жизни составляла около 32 дней На фоне введения метаболитов Oscillatona neglecta опухоли и метастазы не обнаруживаются После забивки на 45 день животных для патоморфологи ческого изучения зарегистрировано отсутствие опухолей В экспериментах по введению культуры клеток карциномы Эрлиха в хвостовую вен у мышам у контрольных животных развиваются множественные метастазы в печени, легких, селезенке При введении метаболитов Osciflatona negtecta no 0,1 мг/кг под кожу перед имплантированием клеток карциномы Эрлиха, развития опухолей и метастазов не наблюдается В аналогичных экспериментах на кролях при имплантировании клеток Броуна-Пирс in testis в контрольной" группе зафиксированы метастазы в легких, печени, почках Профилактическое введение метаболитов Oscillatona neglecta в дозе 0,1 мг/кг под кожу за 5 дней перед имплантацией обеспечивает ингибирование роста опухолей и отсутствие метастазирования 4 Спектр антимикробного действия метаболитов Oscillatona neglecta Lemm Штаммы микроорганизмов засевали на косой агар и через сутки роста культуры смывали 3 мл стерильного изотонического раствора Микробную эмульсию добавляли в пробирки с различными раз веден иями ме та бо ли то в Oscil la to ria neglecta Контролем служила пробирка с изотоническим растеором После приготовления микробных эмульсий производили высев из опытных и контрольных пробирок на чашки с питательным агаром Этот посев служил контролем для сравнения роста микроорганизмов при последующи х посевах Все пробирки помещали в термостат при 37°С, затем через 2, 4, 6, 8, 24, 48 и 72 часа производили посев из каждой пробирки на секторы с агаром В контрольных пробирках микроорганизмы сохраняли жизнеспособность на протяжении всего опыта Результаты представлены в табл 5 Таким образом, метаболиты Oscillatona neglec'a Lemm обладают широким спектром антимикробного действия, концентрация их 0 1% вызывает гибель микроорганизмов на 1-2 сутки и является бактерицидной, концентрация 0,01% - бактериостатическая 27446 Таблица 1 Динамика дегенеративных изменений культуры клеток Hep- 2 под влиянием метаболита Oscillatona neglecta Концентрация метаболита. мг/л 8101 8 10 ? 8 10 3 8 10^ 8 10 5 контроль Сроки наблюдения Через 24 час 2 3 4 4 1 4 2 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 4 4 1 4 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 Через 4В час. 2 3 4 4 2 0 0 0 0 4 4 0 0 0 0 0 0 1 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 Через 72 час. 2 3 . 4 4 2 0 0 0 0 4 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Таблица 2 Продолжительность жизни, величина, вес и торможение роста карциномы Герена и саркомы Иенсена у лабораторных крыс в контроле и под действием метаболитов Oscillatona neglecta (n=10) Доза метаболитов Продолжительность жизни, дней м Вес опухоли, г Средняя величина опухоли в момент гибели, см1 м 24.7 живы контроль 0,1 мг/кг 17,6 живы 15,5 опухоли нет Карцинома Герена 13,54 опухоли нет Саркома Иенсена 17,0 опухоли нет Торможение роста опухолей нет 100% 44,24 опухоли нет контроль 0,1 мг/кг м нет 100% Таблица 3 Динамика роста опухолей (в см 2) карциномы Герена и саркомы Иенсена в контроле и при введении метаболитов Oscillatoria neglecta на лабораторных крысах (п-10) Дозы Сроки определения в днях метаболита 5 7 контроль 0,1 мг/кг. 0,284 0,338 1.424 0,200 контроль 0,1 мг/кг 3,19 3.12 4,14 2,59 10 12 15 ! 20 30 45 Карцинома Герена 6,751 2,745 7,40 | 10,14 животные погибли 0,15 0,164 опухоль не обнаружив ается, животные живы Саркома Иенсена 11,13 16,61 | животные погибли опухоль 8,48 1,00 не обнаруживается, животные живы 1.466 Таблица 4 Динамика развития асцитнои карциномы Эрлиха и ее метастазов в контроле и при введении крысам метаболитов О neglecta (п=10) Дозы метаболита П родопжител ьность жизни, дней (М) Контроль 0,1 мг/кг 32.4 крысы остались живы до забивки Обнаружено: единичных опухолей опухолей с метастазами без опухолей 0 0 10 0 0 10 Таблица 5 Бактерицидные и бактериостатические концентрации метаболитов О neglecta в отношении различных штаммов микроорганизмов Концентрация метаболитов Название штаммов микроорганизмов 0,1% Стафилококк пимонно-желтый Стафилококк белый Стафилококк золотистый N9 209 Стафилококк гемолитический Стафилококк негемолитический 0,01% о,оог%_ -в -8 ±6 ±6 ±10 ±24 ±8 +72 -24 -48 -6 • 72 +72 + Г2 27446 Продолжение табл. 5 Концентрация метаболитов Название штаммов микроорганизмов 0,1% Энтерококкк Тифозная палочка Дизентерийная палочка Флекснера ^ Дизентерийная палочка Шига Бактерия паратифа А Бактерия паратифа Б Бактерия паратифа Бреслау Бактерия паратифа Гертнера Бактерия паратифа Моргана Бактерия паратифа Суипестифер Бактерия паратифа Пиллорум Кишечная палочка Вибрион Мечникова Бактерия рожи свиной Чудесная палочка Синегнойная папочка Протей вульгарный Палочка Фридлендера Дифтероид Bacillus subtilis Bacillus Megatenum Bacillus Mesentericum Bacillus Anthracoides Bacillus Maycoides Условные обозначения' - роста нет, + рост единичных колоний + сплошной рост, цифра - время действия в -6 -8 -8 -6 ~4 -8 -8 -6 -6 -А -А ~4 -6 -8 -8-24 -AQ -18 -24 . -24 -10 -24 -24 -24 часах Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м Ужгород, вул Гагаріна, 1С1 (03122)3 - 72 - 89 (0312 2) 2 - 57 - 03 0,01% 0,001% 16 з8 +72 +72 +72 +72 +72 +72 +72 +72 +72 +72 + 72 + 72 +72 +72 +72 +72 +72 +72 +72 +72 +72 +72 +72 +72 tto +8 ±8 ±10 +8 +6 ±8 +6 +8 ±8 +8 ±10 ±10 ±10 ±24 ±24 ±48 ±48 ±24 ±24 ±10 ±24