Спосіб специфічної імунотерапії аутовакциною хворих на рак шлунка

Спосіб специфічної імунотерапії! хворих на рак шлунка шляхом 3-х щотижневих підшкірних ІН'ЄКЦІЙ вакцини, починаючи з 7-14 доби після хірургічного втручання, та ревакцинації, який відрізняється тим, що вводять аутовакцину, виготовлену з пухлинних клітин, оброблених фільтратом культуральної рідини мікроорганізму В subtihs B-7025, в дозі 35 мг за вмістом білка на одну ІН'ЄКЦІЮ З наступними однократними ревакцинаціями через 1 та 6 МІСЯЦІВ комбінованому лікуванні хворих на рак шлунка обумовлена и перевагами перед променевою та хіміотерапією Імунотерапевтичні заходи діють на ЗЛОЯКІСНІ клітини незалежно від фази клітинного циклу і на відміну від хімю- або променевої терапії не пошкоджують нормальні клітини Відомо, ЩО імунотерапевтичні методи і без залучення хімю- або променевих методів можуть забезпечити пролонгований КЛІНІЧНИЙ ефект Саме тому імунотерапія розглядається як четвертий основний спосіб в онкології і включає в себе різні методи впливу як на злоякісну клітину, так і на імунну систему Сучасна імунотерапія складається з кількох напрямків використання імуномодуляторів, моноклональних антитіл та кон'югатів на їх основі, протиракових вакцин До одного з найбільш ефективних напрямків імунотерапії належать способи протипухлинної терапії, що базуються на специфічній індукції протипухлинних реакцій організму за допомогою вакцин, які містять пухлиноасоційовані антигени [3] КЛІНІЧНІ дослідження з вивчення активної специфічної імунотерапії хворих з пухлинами різних локалізацій виконуються в усіх онкологічних центрах світу Про важливість цих досліджень свідчать проведення в Нью-Йорку кожного року симпозіуму, присвяченого розробці протипухлинних вакцин та інших імуномодулюючих препаратів О (О 60171 Вакцинація використовується з профілактичною (після хірургічного лікування при відсутності КЛІНІЧНО визначених віддалених метастазів) та лікувальною цілями (у випадку дисемінації пухлини) [4] Вакцинотерапія - це метод, заснований на використанні антигена або комплексу антигенів для модуляції імунної ВІДПОВІДІ Одним з напрямків створення вакцин є об'єднання специфічного антигенного матеріалу з факторами, що підсилюють імунну ВІДПОВІДЬ Частіше це компоненти мікробних клітин, що беруть участь у формуванні протимікробного імунітету та стимулюючих цитотоксичну реакцію клітин [5 - 7] У зв'язку з цим актуальним є пошук нових способів комбінованого лікування хворих на рак шлунка при використанні специфічної імунотерапії Відомо, ЩО специфічна імунотерапія включає методи активації специфічного протипухлинного імунітету за допомогою імунізації шактивованими або живими ауто- та алогенними пухлинними клітинами, які входять до складу протиракових вакцин Такі вакцини містять пухлиноасоційовані антигени (ПАА), котрі стимулюють активність Тлімфоцитів, продукцію цитотоксичних антитіл проти специфічних мішеней, а також утворення цитокинів ПАА містяться в цілих або лізованих пухлинних клітинах Найчастіше в ОНКОЛОГІЧНІЙ практиці використовують аутолопчні вакцини, в яких імуногенність ПАА підсилена за допомогою різних речовин, 7-променів, непатогенних вірусів і мікроорганізмів (вірус коров'ячої віспи, хвороби Ньюкастла, БЦЖта ІНШІ) ВІДОМО, ЩО ПОЗИТИВНІ результати одержано зарубіжними онкологами при застосуванні протипухлинних вакцин в лікуванні онкологічних хворих з різною локалізацією пухлинного процесу Частіше всього для імунотерапії онкохворих використовували У ~ опромінені аутолопчні пухлинні клітини сумісно з БЦЖ [8 - 11], при цьому суттєвий лікувальний ефект досягався лише при ранніх (І-ІІ) стадіях захворювання В дослідженнях, які проводились в Україні в якості ад'юванта, було використано Bsubtihs АБ56 ВІДОМІ експериментальні та КЛІНІЧНІ дані роз робки способу специфічної імунотерапії вітчизняною вакциною, засновані на використанні універсальних технологій приготування аутовакцин з пухлин різного походження з високою терапевтичною активністю Спосіб заснований на інактивації пухлинних клітин без втрати імуногенних властивостей за допомогою культуральної рідини мікроорганізму Bsubtihs АБ-56 Оброблені таким способом клітини як експериментальних, так і пухлин людини одержували здатність активувати імунні реакції, що ефективно попереджало розвиток рецидивів та метастазів у післяопераційному періоді [12-15] Найбільш близьким аналогом до способу, що заявляється, є спосіб післяопераційної імунотерапії хворих на рак шлунка [16], який полягає втому, що імунізацію починали на 7 - 14 добу після хірургічного втручання шляхом 3-х підшкірних щотижневих ІН'ЄКЦІЙ аутовакциною, виготовленою з пухлинних клітин оброблених фільтратом культуральної рідини мікроорганізму В subtihs АБ56 в дозі 50мг за вмістом білка на одну ІН'ЄКЦІЮ З наступною однократною ревакцинацією через 1 місяць Сумарна доза введення по білку становила 220мг В основу винаходу, що заявляється, поставлено задачу удосконалення способу імунотерапії хворих на рак шлунка шляхом використання протипухлинної аутовакцини з вищою імуногенністю і створення такої схеми вакцинації, яка дозволила б стимулювати більш виражену протипухлинну резистентність організму, щоб забезпечити попередження розвитку рецидивів та метастазів, покращити якість життя лікованих пацієнтів і таким чином підвищити ефективність лікування Поставлена задача вирішується тим, що застосовують протипухлинну аутовакцину, виготовлену з пухлинних клітин, оброблених фільтратом культуральної рідини мікроорганізму В subtihs B7025 [17, 18], в дозі 35мг за вмістом білка на одну ІН'ЄКЦІЮ З наступними ревакцинаціями через 1 та 6 МІСЯЦІВ Використання аутовакцини з більш вираженою імуногенністю дозволяє вводити її в меншій КІЛЬКОСТІ для зменшення білкового навантаження на організм, що позитивно впливає на стан лікованих пацієнтів при імунотерапії, покращує їх якість життя Імунотерапію аутовакциною починають на 7 14 добу після операції, щоб дати хворому достатньо часу на реабілітацію після імунодепресії, яку могли викликати анестезія і хірургічне втручання Суть способу імунотерапії аутовакциною хворих на рак шлунка полягає втому, що починаючи з 7 - 1 4 доби після хірургічного втручання проводять підшкірно 3-разову щотижневу імунізацію аутовакциною, виготовленою з пухлинних клітин, оброблених фільтратом культуральної рідини мікроорганізму В subtihs В-7025, в дозі 35мг за вмістом білка на одну ІН'ЄКЦІЮ З наступними ревакцинаціями через 1 та 6 МІСЯЦІВ Аутовакцину стандартизували по білку, визначаючи його по методу Lowry, сумарна доза становила 175мг Дозу аутовакцини для терапії підбирали і контролювали, використовуючи реакцію пперчутливості уповільненого типу (РГУТ) В КЛІНІЧНІЙ імунологи позитивна РГУТ розцінюється як сприятлива прогностична ознака, яка свідчить про формування клітинного імунітету [19] Тобто корелює з активністю Т-лімфоцитів-хелперів периферійної крові, котрі є необхідними для генерації специфічних протипухлинних лімфоцитів Вивчення імунологічних показників у крові лікованих пацієнтів проводили до операції, після операції до початку вакцинації і на 28 - ЗО добу після її завершення, відмічена нормалізація показників Суть способу пояснюють приклади (1 - 2) конкретного виконання Приклади Приклад 1 Хворий Сизко В І , 1957 р н , історія хвороби № 176/01 Діагноз рак шлунка з ураженням астрального відділу, III стадія (T3N0M0) Операція 24 01 2001 р субтотальна резекція шлунка ПГЗ № 1469-73/01 -залозевий рак 60171 інфільтрує усі шари стінки шлунка Починаючи з 7-ої доби після операції хворому провели підшкірно 3-разову щотижневу імунізацію аутовакциною в дозі 35мг по білку (що за об'ємом становило Змл), а через 1 та 6 МІСЯЦІВ провели одноразові ревакцинації в таких же дозах Аутовакцину вводили підшкірно в дві точки на відстані 4см від хребта на рівні лопаток, рівномірно розподіляючи м об'єм В процесі лікування визначали відносну і абсолютну КІЛЬКІСТЬ лімфоцитарних субпопуляціи до операції, після операції до вакцинації і на 29 добу після м завершення Відносна КІЛЬКІСТЬ (%) CD3 до операції - 70,0, після операції до імунізації - 65,7, після імунізації - 66,9, після І ревакцинації - 70,0 (норма - 70,0), CD4 до операції - 43,0, після операції до імунізації - 37,2, після імунізації - 37,6, після І ревакцинації - 42,0 (норма - 41,2), CD8 до операції - 27,0, після операції до імунізації - 28,3, після імунізації - 30,7, після І ревакцинації - 30,0, (норма 31,9), CD4/CD8 до операції - 1,6, після операції до імунізації - 1,3, після імунізації - 1,87, після І ревакцинації 1,4, (норма - 1,50), CD 19 до операції 18,0, після операцій до імунізації - 16,2 , після імунізації - 14,8, після І ревакцинації - 14,0, (норма 10,1), CD 16 після операцій до імунізації - 10,2, після імунізації - 12,8 , після І ревакцинацій - 11,0 (норма -15,7) Абсолютна КІЛЬКІСТЬ (хЮ 9 ) CD3 після операції до імунізації - 1,07, після імунізації - 1,19, (норма 1,614), CD4 після операцій до імунізації - 0,59, після імунізації - 0,65, (норма - 0,954), CD8 після операцій до імунізації - 0,46, після імунізації - 0,57, (норма - 0,739), CD 19 після операцій до імунізації - 0,26, після імунізації - 0,24, (норма - 0,235), CD 16 після операцій до імунізації - 0,18, після імунізації 0,24, (норма-0,371) Продукція гама-штерферону мононуклеарами до операції 18,4 ME, після лікування - 29,8 ME ( н о р м а - 3 2 , 0 ME) Відмічена нормалізація основних субпопуляціи лімфоцитів крові та продукції гама-штерферону На січень місяць 2003 р хворий знаходився під наглядом без проявів прогресування хвороби Приклад 2 Хворий Мельник П В , 1931 р н , історія хвороби № 2095/01 Діагноз рак астрального відділу шлунка, місцеве розповсюдження пухлини (вростання в головку підшлункової залози) IV стадія (T 4 N 2 M 0 ) Операція 3 04 2001 р комбінована субтотальна резекція головки підшлункової залози ПГЗ № 7020-6/01 - залозевий рак шлунка, пухлина інфільтрує усі шари стінки шлунка, сальник, метастази в лімфовузли великого та малого сальника Починаючи з 10-ої доби після операції хворому провели підшкірно 3-разову щотижневу імунізацію аутовакциною в дозі 35мг по білку (що за об'ємом становило 3,5мл), а через 1 та 6 МІСЯЦІВ провели одноразові ревакцинації в таких же дозах Аутовакцину вводили підшкірно в дві точки на відстані 4см від хребта на рівні лопаток, рівномірно розподіляючи м об'єм В процесі лікування визначали відносну і абсолютну КІЛЬКІСТЬ лімфоцитарних субпопуляціи до операції, після операції до вакцинації і на 29 добу після м завершення Відносна КІЛЬКІСТЬ (%) CD3 до операції - 64,0, після операції до імунізації - 64,7, після імунізації - 65,9, після І ревакцинації - 67,0 (норма - 70,0), CD4 до операції - 43,5, після операції до імунізації - 43,2, після імунізації - 38,6, після І ревакцинації - 40,0 (норма - 41,2), CD8 до операції - 26,0, після операції до імунізації - 27,3, після імунізації - 29,7, після І ревакцинації - 29,9, (норма 31,9), CD4/CD8 до операції - 1,7, після операції до імунізації - 1,6, після імунізації - 1,7, після І ревакцинації 1,6, (норма - 1,50), CD 19 до операції 19,0, після операції до імунізації - 17,2, після імунізації - 15,8, після І ревакцинації - 15,0, (норма 10,1), CD 16 після операції до імунізації - 10,5, після імунізації - 11,8, після І ревакцинації - 11,6 (норма -15,7) Абсолютна КІЛЬКІСТЬ (хЮ 9 ) CD3 після операції до імунізації - 1,02, після імунізації - 1,12, (норма 1,614), CD4 після операції до імунізації - 0,56, після імунізації - 0,61, (норма - 0,954), CD8 після операції до імунізації - 0,42, після імунізації - 0,54, (норма - 0,739), CD 19 після операції до імунізації 0,28, після імунізації - 0,25, (норма - 0,235), CD 16 після операції до імунізації - 0,16 , після імунізації 0,22 , (норма-0,371) Продукція гама-штерферону мононуклеарами до операції 17,4 ME, після лікування - 28,6 ME ( н о р м а - 3 2 , 0 ME) Відмічена нормалізація основних субпопуляціи лімфоцитів крові та продукції гама-штерферону На січень місяць 2003 р хворий знаходився під наглядом без проявів прогресування хвороби КЛІНІЧНІ випробування способу проводили у відділенні абдомінальної онкології Інституту онкологи АМН України Способом, що заявляється, у післяопераційному періоді проліковано 57 хворих основна група, серед них 35 (61%) ЧОЛОВІКІВ та 22 (39%) жінок Контрольну групу склали 52 хворих, серед них ЧОЛОВІКІВ 28 (54%) та жінок 24 (46%), яким не проводилась вакцинація Вік хворих знаходився у межах 31 - 72 років Зазначені групи були однорідними за віком, стадіями захворювання (Тз 4NO0 2M0), наявністю супроводжуючої патологи, видами оперативних втручань, більшість пухлин були аденокарциномами Класифікацію пухлин проводили за системою TNM 4-го видання [20] Виживання лікованих пацієнтів визначали актуриальним методом, порівняльний аналіз виживання проводили за допомогою logrank- критерію [21] Якість життя лікованих пацієнтів визначали по Карновському [22] Основними критеріями ефективності лікування були якість і тривалість життя лікованих пацієнтів Характеристику хворих за показниками pTNM наведено в таблиці 1 60171 Таблиця 1 Розподіл хворих на рак шлунка за показниками pTNM Показники pTNM Основна група Контрольна група % п % 44 13 33 24 51 6 77 23 58 42 89 11 41 11 31 21 44 8 79 21 60 40 85 15 57 РТз РТ4 PNo PN 1 2 РМо РМі Всього п 100 52 100 Розподіл хворих на рак шлунка за ступенем диференціації представлено в таблиці 2 Таблиця 2 Розподіл хворих за ступенем диференціації пухлини Основна група Ступінь Контрольна група п п % 12 31 14 21 54 25 9 32 11 17 62 21 57 Gi 2 G3 G4 Всього % 100 52 100 Розподіл хворих основної та контрольної груп в залежності від форми росту пухлини представ лено в таблиці З Таблиця З Розподіл хворих за формою росту пухлин Основна група Тип росту Контрольна група п п % 16 32 9 28 56 16 11 29 12 21 56 23 57 Екзофітний Ендофітний Змішаний Всього % 100 52 100 Переважна більшість хворих основної групи була з поширенням пухлин на всі шари стінки шлунку (Тз - 71%), відсутністю метастазів в репонарних лімфовузлах (pNo - 58%) та віддалених метастазів (рМо - 89%), більшість складали аденокарциноми різного ступеня диференціації ( d з 75%) Наведені дані свідчать, що за основними про гностичними показниками (Т, N, М, G, типу росту пухлин, співвідношення хворих в групах) було практично однаковим, що дозволяє їх порівнювати між собою Хворим обох груп проводили хірургічне втручання - субтотальну резекцію шлунка (СРШ) або гастректомію (ГЕ) Розподіл хворих в залежності від виконаної операції представлено в таблиці 4 Таблиця 4 Розподіл хворих в залежності від виконаної операції Основна група Обсяг операції Субтотальна резекція - з них комбінованих і розширених Гастректомія - з них комбінованих і розширених Комбіновані хірургічні Контрольна група п втручання % п % 23 11 34 14 40 48 60 41 21 8 31 13 40 38 60 42 складали 42% від загальної КІЛЬКОСТІ операцій, в ДОСЛІДНІЙ групі 42%, в контрольній групі - 40% Під час опе рацій виконувались резекції мезоколон, підшлункової залози, печінки, ніжок діафрагми, видалення селезінки 60171 10 Дані про виживання хворих основної та контрольної груп представлено в таблиці 5 Таблиця 5 Загальне виживання хворих на рак шлунка, % Виживання, МІСЯЦІВ 6 12 18 Групи хворих, лікованих за способом запропонованим прототипом 100 99,0 93,0 90,0 86,0 78,0 Аналізуючи дані виживання хворих дослідних груп, слід ВІДМІТИТИ, що використання аутовакцини поліпшує однорічне виживання хворих основної групи на 7%, 18-місячне - на 14% порівняно з виживанням контрольної групи Відмічено збільшення показників виживання пацієнтів, лікованих за способом (що заявляється) до 86% проти 78% в групі лікованих за способомпрототипом Встановлено, що проведення імунотерапії протипухлинною аутовакциною після хірургічного втручання задовільно переноситься хворими, не викликає ускладнень, сприяє зниженню рівня рецидивів та метастазів Відмічена нормалізація імунологічних показників у пацієнтів, лікованих запропонованим способом Вивчені результати ефективності лікування хворих на рак шлунка при використанні протипухлинної аутовакцини в комбінованому лікуванні Відмічено, що разом зі збільшенням показників виживання лікованих пацієнтів за способом, що заявляється, і способом-прототипом покращується і якість життя в цих групах до 70% і 65% ВІДПОВІДНО Таким чином, одержані позитивні результати свідчать про ДОЦІЛЬНІСТЬ та перспективність застосування імунотерапії протипухлинною аутовакциною хворих на рак шлунка, і навіть при наявності метастазів (T34N12М0) Джерела інформації 1 Щепотин И Б, Эванс С Р Т Рак желудка практическое руководство по профилактике, диагностике и лечению Киев "Книга Плюс" 2000 227 с 2 Білинський Б Т , Стернюк Ю М , Шпарик Я В Онкологія ЛЬВІВ, 1998 р —270 с 3 Engelhard V Н , Bullock T N V , Colella T А , Mullms D W Direct identification of human tumorassociated peptide antigens and a prechmcal model to evaluate their use Cancer Journal 2000, 6(3) 272280 4 Rosenberg S Progress in human tumour immunology and immunotherapy Nature 2001, 411 380-384 5 Потебня Г , Лисовенко Г , Ялкут С Противоопухолевые вакцины перспективы применения Доктор 2002, 2 с 52 - 58 6 Macchianni P, Hardm M, Angiletti CA Longterm evaluation of mtrapleural bacillus CalmetteGuerm with or without adjuvant chemotherapy in completely resected stages II and III non-small-cell lung cancer Am J Clm Oncol 1991, 14(4) 291-7 7 Schulof RS, Mai D, Nelson MA, Paxton HM, Контрольна група 96,0 86,0 72,0 Cox JWJr, Turner ML, Mills M, Hix WR, Nochomovitz LE, Peters LS Active specific immunotherapy with an autologous tumor cell vaccine in patients with resected non-small cell lung cancer Мої Biother 1988, 1 30-6 8 Berd D , Dunton С , Mastrangelo M J , Sato T , Maguire H С Autologous, hapten-modified vaccine as a treatment for human cancers Semin Oncol 1998 25(6) 646-653 9 Vermorken JB, Clarsen AM, van Tmteren et al Active specific immunotherapy for stage II and stage III human colon cancer Lancet 1999, 353 345-50 10 Mitchell M S Perspective on allogeneic melanoma lysates in active specific immunotherapy// Semin Oncol — 1998 — Vol 25, N6 — P 623 - 635 11 Takita H, Hollmshead AC, Adier RH, Bhayana J, Ramundo M, Moskowitz R, Rao UN, Raman S Adjuvant, specific, active immunotherapy for resectable quamous cell lung carcinoma a 5-year survival analysis JSurg Oncol 1991, 46(1) 9-14 12 Затула ДГ Микроорганизмы, рак и противоопухолевый иммунитет Киев Наук думка, 1985 247 с 13 Колесник Е А , Потебня Г П , Кикоть В А , Черный В А и др Противоопухолевая вакцина в лечении больных распространенным колрректальным раком Он кол 1999 2с 192-195 14 Потебня Г П , Смоланка И И , Лисовенко ГС и др Еффективность иммунотерапии аутовакциной в лечении больных раком легкого Онкол 2000 — 2 с 191 —194 15 Патент 10555 України, МПК А61К35/74 Спосіб специфічної імунотерапії онкологічних хворих після радикальної операції / Потебня ГП, Загадарчук НЛ, Ситенко ВК, Кикоть ВО, № 93005385, Заявл 5 08 93, Опубл 1110 99, Бюл № 6 16 Кірсенко О В , Логвшова І О , Чорний В О та ш Результати використання протипухлинної автолопчної вакцини у лікуванні хворих на рак шлунка Сучасна гастроентерологія 2001 — 2 с 75-76 17 Заявка № 2001042565 від 17 04 2001 на винахід «Штам бактерій Bacillus subtihs продуцент протипухлинних цитотоксичних речовин» 18 Заявка на патент України № 2001064158 від 15 06 01 р на винахід "Спосіб одержання протипухлинної аутовакцини" 19 Hoover H С Jr, Brandhorst J S , Peters L С , Surdyke M G , Takeshita Y , Madanaga J , Muenz L R , Hanna M G Jr Adjuvant active specific immunotherapy for human colorectal cancer 6 5-year median follow-up of a phase III prospectively randomized trial // J Clm Oncol — 1993 Vol 11, N3 — P 390 11 60171 12 399 tical methods in cancer research (v 4) Desknptive 20 Атлас TNM Иллюстрированное руководство no TNM/pTNM - классификации злокачественных опухолей /Пер с англ 4-го издания/ Под ред В Е Кратенка, Е А Короткевича Минск Белорусский центр науч мед информации 1998 381 c 21 Esteve J , Benhamou E , Raymond L Statis Epidemiology (IARC scientific publications N 128) IARC, Lyon 1994 —302 pp 22 Manual for clinical research in breast cancer 3 rd Edition EORTC Breast Cancer Cooperative group 1 s t European Breast Cancer Conference, Florence, 29 September - Oktober 1998 (Ed J A van Dongen) EORTC, Brussels, 1998 131 pp Комп'ютерна верстка А Крулевський Підписано до друку 06 10 2003 Тираж 39 при м Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна