Спосіб оцінки біологічної відповіді організму онкологічних хворих на імунотерапію

Реферат: Спосіб оцінки біологічної відповіді організму онкологічних хворих на імунотерапію, що включає виявлення змін імунореактивності організму хворих на меланому шкіри у процесі лікування, причому у периферичній крові хворих визначають індекс співвідношення кількості регуляторних Т-лімфоцитів до кількості цитотоксичних Т-лімфоцитів і в разі отримання зниженого індексу відносно вихідного рівня прогнозують наявність біологічної відповіді організму на отриману терапію. UA 70190 U (12) UA 70190 U UA 70190 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заявка належить до галузі медицини, а саме - онкології, і може бути використана в комбінованому лікуванні хворих на меланому шкіри. Основним методом лікування хворих на меланому шкіри вважається хірургічний, який доповнюється в залежності від стадії захворювання імуно- та хіміотерапією [1]. Проте результати лікування залишаються незадовільними через раннє метастазування, швидке прогресування і низьку чутливість пухлинних клітин до хіміопрепаратів. Об'єктивної відповіді на інтерферонотерапію вдається досягти у 16-48 % хворих, крім того, її застосування супроводжується суттєвою токсичністю та є економічно обтяжливим [2, 3]. Тому важливо визначити групу пацієнтів, які отримають найбільшу користь від застосування інтерферонотерапії, на що спрямовані зусилля щодо розробки надійних критеріїв оцінки біологічної відповіді організму. Для цього у хворих на меланому шкіри здійснюється імунологічний моніторинг [4-6]. За прототип вибрано спосіб імунологічної оцінки ефективності комбінованого лікування хворих на меланому шкіри [Химиотерапия диссеминированной меланомы кожи с включением ингарона (-ИФН). Клинико-иммунологическое исследование / М. Е. Абрамов, С. Л. Гуторов, Е. Г. Славина [и др.] // Рос. биотер. журн. - 2009. - Т. 8, № 1. - С. 64-74], за яким в динаміці комбінованого лікування із застосуванням поліхіміо- й інтерферонотерапії у 39 хворих на дисеміновану меланому шкіри проводили багатопараметричний аналіз імунного статусу в залежності від загальної виживаності хворих. Імунологічне дослідження включало визначення + + + + + + + імунофенотипу лімфоцитів периферичної крові (CD3 , CD5 , CD7 , CD4 , CD8 , HLA-DR , CD38 , + + + + + + + + CD25 , CD50 , CD16 , CD20 , CD11b , CD45RA , CD95 , CD71 ), цитотоксичної активності природних кілерних клітин (ПКК) периферичної крові та рівня сироваткових імуноглобулінів А, М, G, що дозволило виявити збільшення цитотоксичності ПКК, асоційоване із значним підвищенням загальної виживаності хворих. Позитивним в прототипі є оцінка імунологічних параметрів хворих в процесі лікування, що може бути використано для прогнозування його ефективності. Недоліком прототипу є обмеження ідентифікації біологічної відповіді організму хворих на меланому шкіри на проведене лікування через визначення тільки цитотоксичної активності ПКК периферичної крові хворих на меланому шкіри як імунологічного критерію оцінки ефективності лікування, оскільки відомо, що активність останніх залежить від експресії на клітинах-мішенях антигенів і класу головного комплексу гістосумісності, які експресуються на більшості клітин меланоми [8]. Задачею корисної моделі є удосконалення способу оцінки біологічної відповіді організму онкологічних хворих на імунотерапію шляхом визначення в процесі лікування динаміки змін індексу співвідношення кількості регуляторних Т-лімфоцитів (Трег) до кількості цитотоксичних Тлімфоцитів (ЦТЛ) як інтегрального показника хворих на меланому шкіри, що дасть можливість виявити групу хворих з прогнозованою чутливістю до імунотерапії, а також допоможе в розробці більш ефективних схем її застосування. Поставлена задача вирішується таким чином: Хворому з гістологічно підтвердженим діагнозом меланоми шкіри IB-IIС стадії призначають ад'ювантну імунотерапію інтерфероном-2b (Лаферобіон) підшкірно в дозі 3 млн МО 3 рази на тиждень упродовж 12 міс. Оцінку біологічної відповіді організму хворих на імунотерапію проводять з урахуванням динаміки змін індексу співвідношення Трег/ЦТЛ (кількість + high low-neg + CD4 CD25 CD127 /CD8 ), який визначають до та після лікування. Відомо, що зростання чисельності Трег є однією з причин неефективності імунного захисту при пухлинному рості [9], а однією з головних мішеней супресорної дії Трег є ЦТЛ, які виявляють цитотоксичний ефект відносно до клітин, що мають на своїй поверхні комплекс чужорідного антигену з молекулами 1 класу головного комплексу гістосумісності [10]. Визначення кількісного складу субпопуляцій Тлімфоцитів у периферичній крові проводять методом проточної цитофлуориметрії з використанням моноклональних антитіл до CD4і СБ8-антигенів, мічених флуоресцеїнізотіоціанатом (FITC) ("Сорбент", Росія), CD25-антигену, мічених фікоеритринцианіном-5 (РС5), та СD127-антигену, мічених фікоеритрином (РЕ) ("Beckman Coulter", США), згідно з методикою [11]. Результати обчислюють на проточному цитофлуориметрі FACScan ("Becton Dickinson", США) з використанням програми "Cell Quest". Для виявлення Трег використовують багатопараметричний аналіз з багатоетапним введенням 4+ логічних обмежень. Трег визначають серед СD -лімфоцитів за високою експресією CD25 в поєднанні з низькою або негативною експресією CD 127 [12]. Під час обліку результатів 3 3 підраховують 2×10 лімфоцитів при визначенні ЦТЛ та 10×10 - при визначенні Трег. Індекс співвідношення розраховують шляхом ділення кількості Трег на кількість ЦТЛ. Зниження індексу Трег/ЦТЛ у хворих після проведення ад'ювантної імунотерапії відносно вихідного рівня свідчить 1 UA 70190 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 про відповідь організму на лікування, що є сприятливим прогностичним фактором його ефективності. За заявленим способом оцінка біологічної відповіді організму онкологічних хворих на імунотерапію була проведена 20 хворим з гістологічно підтвердженим діагнозом меланоми шкіри IB-IIС стадії. Прикладами реалізації заявленого способу є витяги з історій хвороб наступних пацієнтів. І. Хвора К., 1965 р. н., історія хвороби № 10485. Звернулася у відділення онкоортопедії, пухлин шкіри та м'яких тканин зі скаргами на наявність пігментної пухлини на шкірі правої гомілки, що з'явилася 5 років тому та поступово збільшувалася в розмірах. Після обстеження, що включало рентгенографію органів грудної клітки, ультразвукове дослідження органів черевної порожнини та загальноклінічні дослідження, встановлено клінічний діагноз: Меланома шкіри правої гомілки, II клінічна група. 08.10.2009 р. під внутрішньовенним наркозом виконано широке висічення меланоми шкіри правої гомілки. Патогістологічний діагноз: Злоякісна епітеліоїдно-веретеноклітинна меланома шкіри, вузлова форма, III-IV рівень інвазії за Clark, 2,2 мм товщина за Breslow, без поверхневого виразкування (патогістологічне дослідження № 31743-45/09 від 14.10.2009 p.). Встановлено заключний діагноз: Меланома шкіри правої гомілки, T3aN0M0, стадія IIА, клінічна група II. З 12.11.2009 р. розпочато інтерферонотерапію («Лаферобіон» ("Біофарма", Україна)) підшкірно в дозі 3 млн МО 3 рази на тиждень упродовж 12 міс. Індекс співвідношення Трег/ЦТЛ визначали до (12.11.2009 р.) та після ад'ювантної імунотерапії (02.11.2010 р.). Для цього + high low-neg + досліджували кількість Трег (CD4 CD25 CD127 ) та ЦТЛ (CD8 ) у периферичній крові хворої методом проточної цитофлуориметрії з використанням моноклональних антитіл до CD4та CD8-антигенів, мічених FITC ("Сорбент", Росія), СD25-антигену, мічених РС5, СD127антигену, мічених РЕ ("Beckman Coulter", США), згідно з методикою. Результати обчислювали на проточному цитофлуориметрі FACScan ("Becton Dickinson", США) з використанням програми "Cell Quest". Для виявлення Трег використовували багатопараметричний аналіз з + багатоетапним введенням логічних обмежень. Трег визначали серед СD4 -лімфоцитів за високою експресією CD25 в поєднанні з низькою або негативною експресією CD127. Під час 3 3 обліку результатів підраховували 2×10 лімфоцитів при визначенні ЦТЛ та 10×10 - при визначенні Трег. Індекс співвідношення розраховували шляхом ділення кількості Трег на кількість ЦТЛ. До лікування Трег/ЦТЛ становив 0,21, що є перевищенням показника у практично здорових людей (0,10±0,04). Після проведення імунотерапії досліджуваний показник зменшився в 2,3 разу при порівнянні із вихідним значенням і складав 0,09, що є на рівні показника у практично здорових людей. За період спостереження (25 міс) рецидиву або метастазів меланоми у хворої не виявлено. II. Хвора Д., 1938 р. н., історія хвороби № 10597. Звернулася у відділення онкоортопедії, пухлин шкіри та м'яких тканин зі скаргами на наявність пігментної пухлини на шкірі поперекової області, яка протягом останнього року поступово збільшувалася в розмірах та почала кровити. Після обстеження, що включало рентгенографію органів грудної клітки, ультразвукове дослідження органів черевної порожнини та загальноклінічні дослідження, встановлено клінічний діагноз: Меланома шкіри поперекової області, II клінічна група. 03.11.2009 p. під внутрішньовенним наркозом виконано широке висічення меланоми шкіри поперекової області. Патогістологічний діагноз: Злоякісна епітеліоїдно-веретеноклітинна меланома шкіри, вузлова форма, III-IV рівень інвазії за Clark, 3,7 мм товщина за Breslow, без поверхневого виразкування (патогістологічне дослідження № 34865-71/09 від 09.11.2009 p.). Встановлено заключний діагноз: Меланома шкіри поперекової області, T3aN0M0, стадія IIА, клінічна група II. З 13.11.2009 р. розпочато інтерферонотерапію («Лаферобіон» ("Біофарма", Україна)) підшкірно в дозі 3 млн МО 3 рази на тиждень упродовж 12 міс. Індекс співвідношення Трег/ЦТЛ визначали до (13.11.2009 р.) та після ад'ювантної імунотерапії (19.11.2010 р.). Для цього + high low-neg + досліджували кількість Трег (CD4 CD25 CD127 ) та ЦТЛ (CD8 ) у периферичній крові хворої методом проточної цитофлуориметрії з використанням моноклональних антитіл до CD4та СD8-антигенів, мічених FITC ("Сорбент", Росія), CD25-антигену, мічених РС5, СD127антигену, мічених РЕ ("Beckman Coulter", США), згідно з методикою. Результати обчислювали на проточному цитофлуориметрі FACScan ("Becton Dickinson", США) з використанням програми 2 UA 70190 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 "Cell Quest". Для виявлення Трег використовували багатопараметричний аналіз з + багатоетапним введенням логічних обмежень. Трег визначали серед СD4 -лімфоцитів за високою експресією CD25 в поєднанні з низькою або негативною експресією CD127. Під час 3 3 обліку результатів підраховували 2×10 лімфоцитів при визначенні ЦТЛ та 10×10 - при визначенні Трег. Індекс співвідношення розраховували шляхом ділення кількості Трег на кількість ЦТЛ. До лікування Трег/ЦТЛ становив 0,20, що є перевищенням показника у практично здорових людей (0,10±0,04). Після проведення імунотерапії досліджуваний показник зменшився в 1,7 разу при порівнянні із вихідним значенням і складав 0,12, що є на рівні показника у практично здорових людей. За період спостереження (25 міс) рецидиву або метастазів меланоми у хворої не виявлено. Джерела інформації: 1. Eggermont A. New developments in adjuvant therapy in melanoma / A. Eggermont // Eur. J. Cancer. - 2007. - Vol. 5, № 4 (suppl.). - P. 45. 2. A prospective randomized Phase III trial of concurrent biochemotherapy (BCT) with cisplatin, vinblastine, dacarbazine (CVD), IL-2 and interferon alpha-2b (IFN) versus CVD alone in patients with metastatic melanoma (E3695). An ECOG-coordinated intergroup trial / M. B. Atkins, S. Lee, L. E. Flaherty [et al] // Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. - 2003. - Vol. 22. - P. 708. 3. Sequential biochemotherapy versus chemotherapy for metastatic melanoma: results from a Phase III randomized trial / O. Eton, S. S. Legha, A. Y. Bedikian [et al.] // J. Clin. Oncol. - 2002. - Vol. 20. - P. 2045-2052. 4. Демидов Л. В. Результаты иммунопрофилактики метастазов меланомы кожи рекомбинантным гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором после хирургического иссечения первичной опухоли: динамика иммунологических и гематологических показателей / Л. В. Демидов, Г. Ю. Харкевич, И. В. Тимофеев // Рос. биотер. журн. - 2002. - Т. 1, № 4. - С. 49-53. 5. Multiplex analysis of serum cytokines in melanoma patients treated with interferon-alpha2b / Z. R. Yurkovetsky, J. M. Kirkwood, H. D. Edington [et al.] // Clin. Cancer Res. - 2007. - Vol. 13, № 8. - P. 2422-2428. 6. Autoimmune antibodies and recurrence-free interval in melanoma patients treated with adjuvant interferon / M. G. Bouwhuis, S. Suciu, S. Collette [et al.] // J. Natl. Cancer Inst. - 2009. - Vol. 101, № 12. - P. 869-877. 7. Химиотерапия диссеминированной меланомы кожи с включением ингарона (-ИФН). Клинико-иммунологическое исследование / М. Е. Абрамов, С. Л. Гуторов, Е. Г. Славина [и др.] // Рос. биотер. журн. - 2009. - Т. 8, № 1. - С. 64-74 (прототип). 8. Проблемы клинического применения ИЛ-2/ЛАК-терапии / Л. В. Демидов, И. Н. Михайлова, И. Е. Синельников [и др.] // Рос. биотер. журн. - 2005. - Т. 4, № 4. - С. 29-37. 9. Иммунорегуляторные субпопуляции Т-клеток при опухолевом росте и аллергических заболеваниях / B. C. Свиридова, В. В. Климов, А. А. Денисов [и др.] // Сиб. онкол. журн. - 2010. Т. 3, № 39. - С. 38-47. 10. Ярилин А. А. Естественные регуляторные Т-клетки / А. А. Ярилин // Рос. мед. журн. 2007. - № 1. - С. 43-48. 11. Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека / Б. В. Пинегин, А. А. Ярилин, А. В. Симонова [и др.] : пособие для врачейлаборантов. - М.: 2001. - 55 с. 12. Основные и малые популяции лимфоцитов периферической крови человека и их нормативные значения (методом многоцветного цитометрического анализа) / Хайдуков С. В., Зурочка А. В.,. Тотолян А. А, Черешнев В. А. // Мед. иммунол. - 2009. - Т. 11, № 2-3. - С. 227-238. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 55 Спосіб оцінки біологічної відповіді організму онкологічних хворих на імунотерапію, що включає виявлення змін імунореактивності організму хворих на меланому шкіри у процесі лікування, який відрізняється тим, що у периферичній крові хворих визначають індекс співвідношення кількості регуляторних Т-лімфоцитів до кількості цитотоксичних Т-лімфоцитів і в разі отримання зниженого індексу відносно вихідного рівня прогнозують наявність біологічної відповіді організму на отриману терапію. 3 UA 70190 U Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4