Спосіб імуноцитохімічної діагностики онкогематологічних захворювань

Реферат: Спосіб імуноцитохімічної діагностики онкогематологічних захворювань, причому визначення патологічних субстратних клітин проводять в нативних мазках-препаратах периферичної крові і пунктаті кісткового мозку онкогематологічних хворих шляхом заморожування при -20 C протягом 3-5 год., швидкої фіксації в розчині формол-ацетону (рН 6,6) протягом 1 хв., троєкратної промивки в забуференому фізіологічному розчині, виконання імуноцитохімічної реакції із застосуванням чутливих і специфічних реагентів - авідін-біотинового комплексу та лужної фосфатази як ферментної мітки. UA 70410 U (54) СПОСІБ ІМУНОЦИТОХІМІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ ОНКОГЕМАТОЛОГІЧНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ UA 70410 U UA 70410 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь, до якої належить корисна модель: медицина, лабораторна діагностика онкогематологічних захворювань. Рівень техніки: Загальновідомий, вибраний як показник рівня техніки і водночас як прототип, спосіб виявлення субпопуляцій лімфоцитів шляхом проведення імуноцитохімічного пероксидазноантипероксидазного (ПАП) пофарбування мазків периферичної крові або мазків із лейкоконцентрату венозної крові онкогематологічних хворих шляхом висушування, заморожування, доведення до кімнатної температури, фіксації у формолацетоні, пригнічення активності ендогенної пероксидази, визначення популяції лімфоцитів за допомогою світлооптичної мікроскопії по коричневому обідку на цитоплазмі клітин [Глузман Д. Ф., Сидоренко С. П., Надгорная В. А. Цитохимия и иммуноцитология злокачественных лимфопролиферативных заболеваний. -Киев: Наук. думка, 1982. - 240 с.]. Недоліком цього способу є виконання імуноцитохімічної реакції тільки в мазках периферичної крові та застосування пероксидазно-антипероксидазного пофарбування, що потребує додаткового пригнічення активності ендогенної пероксидази. Існує нагальна потреба у виконанні імуноцитохімічної реакції в нативних препаратах-мазках периферичної крові і кісткового мозку онкогематологічних хворих з використанням як ферментної мітки не пероксидази хрону та ПАП-комплексу, а більш чутливих та специфічних реагентів для покращання чутливості та специфічності методу. Власне опис корисної моделі, що заявляється. В основу корисної моделі поставлено задачу: уникнення втрати унікального клітинного матеріалу в процесі виділення і відмивання клітин з подальшим приготуванням цитологічних препаратів, а також за умов початку дослідження більше ніж 20 год. з моменту забору проб. Поставлена задача вирішується тим, що діагностичне дослідження (імуноцитохімічна реакція) проводиться безпосередньо в нативних мазках-препаратах крові і кісткового мозку, а не у відмитих клітинах периферичної крові і кісткового мозку. При цьому субстратні клітини в нативних мазках-препаратах зберігають незмінними свої унікальні цитоморфологічні ознаки. Застосування лужної фосфатази (ЛФ) як ферментної мітки антитіл виключає необхідність проведення агресивної процедури інгібування активності ендогенної пероксидази із застосуванням перекису водню та нітриту натрію та запобігає появі неспецифічного фарбування структур, що містять гемоглобін, яких багато в зразках крові і кісткового мозку, на останньому етапі визначення активності пероксидази цитохімічним методом з використанням 3,3'-діамінобензидину. Використання авідин-біотинового комплексу (ABC) значно підвищує чутливість і специфічність імуноцитохімічної реакції, особливо при проведенні реакції в мазках кісткового мозку, де є велика кількість мієлоїдних клітин з ендогенною пероксидазою. Застосування ABC-комплексу та ЛФ як ферментної мітки забезпечує утворення на цитоплазматичних мембранах клітин кінцевих продуктів цитохімічної реакції, що добре візуалізуються в імерсійній системі світлооптичного мікроскопу як обідок червоно-малинового кольору, який добре контрастує з ядром клітини, дофарбованим метиленовим зеленим. При виконанні способу, що заявляється, діагностика онкогематологічних захворювань виконується в три етапи. 1-й етап - цитоморфологічний. Включає морфоцитологічне дослідження пофарбованих за Романовським-Гімзою препаратів-мазків, виготовлених із гепаринізованої периферичної крові та пунктату кісткового мозку хворих. Мазки готують за допомогою розподільного скла на тонких, знежирених предметних скельцях, попередньо капнувши на скло краплину крові чи краплину кістковомозкового пунктату. Мазки повинні бути не густими та добре просушеними на повітрі не менше 1 години при кімнатній температурі. Фарбують мазки за методикою (по РомановськомуГімзі). Оцінюють морфоцитологічні властивості клітин в імерсійній системі світлооптичного мікроскопа. Результат дослідження - констатація наявності чи відсутності онкогематологічного захворювання. 2-й етап - цитохімічний. Включає цитохімічне визначення активності ферментів (за візуалізацією продуктів цитохімічної реакції) в клітинах периферичної крові і кісткового мозку. Етап включає виконання щонайменше 5 цитохімічних реакцій: реакція визначення активності пероксидази; визначення PAS-позитивних речовин; визначення активності кислої фосфатази; реакція на кислу неспецифічну естеразу; визначення активності нафтол-AS-D-хлорацетатестерази. Результат дослідження - встановлення форм і варіанту гострого чи хронічного проліферативного процесу. 1 UA 70410 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 3-й етап - імуноцитохімічний. Включає виконання імуноцитохімічних реакцій по визначенню експресії специфічних маркерів - лінійноспецифічних та диференційних антигенів - на поверхневих мембранах і в цитоплазмі клітин периферичної крові і кісткового мозку. Згідно з способом, що заявляється, пропонується застосування наступної методики виготовлення препаратів-мазків та проведення імуноцитохімічної реакції. Мазки готують за допомогою розподільного скла на тонких, знежирених предметних скельцях, попередньо капнувши на скло краплину крові чи краплину кістковомозкового пунктату. Мазки повинні бути не густими та добре просушеними на повітрі не менше 1 години при кімнатній температурі. Нативні, висушені на повітрі препарати-мазки загортають у алюмінієву фольгу і кладуть в морозильну камеру при температурі -20 °C щонайменше на 3-5 годин (за таких умов антигенні властивості патологічних клітин в препаратах-мазках зберігаються в незмінному вигляді). Мазки виймають з морозильної камери холодильника безпосередньо перед фіксацією. Для фіксації використовують розчин забуференого формол-ацетону (Mason et al., 1975), який готують таким чином: 128 мг NaH2PO4·2H2O і 12 мг Na2HPO4·12H2O розчиняють в 30 мл дистильованої води, додають 45 мл хімічно чистого ацетону і 25 мл 40%-ного нейтрального формальдегіду. Доводять суміш до рН 6,6 під контролем рН-метра концентрованим розчином NaOH (суміш зберігають при 4 °C в посуді з шліфованою пробкою приблизно 1 місяць). Мазки фіксуються близько 1 хв., після чого фіксатор зливають, а мазки відразу занурюють у відмиваючий розчин (ЗФР), що містить 94 мл 0,9%-ного розчину NaCl і 6 мл 0,1 Μ фосфатного буферу (рН 7,2-7,4). Мазки виймають з ЗФР, окреслюють ділянки, на які будуть нанесені моноклональні антитіла (МкАт), просушують фільтрувальним папером зони навколо зони безпосереднього нанесення МкАт. Ділянка на склі, де буде проходити імуноцитохімічна реакція, повинна залишатися вологою протягом усіх циклів інкубації із специфічними реагентами, але без зайвої рідини, щоб не допустити перерозведення МкАТ. Зі зворотної сторони скла маркером підписують окреслені ділянки нанесення МкАТ. Для виявлення антигенної структури клітин в нативних препаратах-мазках периферичної крові і кісткового мозку використовується авідин-біотиновий комплекс (ABC) з ЛФ як мітки. Проведення імуноцитохімічної реакції із застосуванням АВС-комплексу. 1. Препарати-мазки після фіксації помістити в горизонтальному положенні у вологу камеру і нанести 20 мкл моноклональних антитіл в окреслені ділянки мазка. 2. Інкубація - 1 год. у вологій камері при кімнатній температурі (18-22 °C). 3. Обережно стряхнути антитіла першого етапу і промити скельця в трьох змінах забуференого фізіологічного розчину; просушити, намагаючись не торкатись окреслених ділянок. Нанести 20 мкл сироватки проти імуноглобулінів мишей, кон’юговану з біотином. 4. Інкубація - 30 хв. у вологій камері при кімнатній температурі (18-22 °C). 5. Стряхнути антитіла другого етапу, відмити препарати в двох-трьох змінах ЗФР, видалити надлишок вологи фільтрувальним папером і нанести в зону реакції по 20 мкл сироватки третього етапу (стрептавідин, кон’югований з ЛФ). 6. Інкубація - 1 год. у вологій камері при кімнатній температурі. 7. Відмити препарати, як зазначено вище. 8. Провести імуноцитохімічну реакцію визначення активності лужної фосфатази - реакція з використанням нового фуксину - гексаазотованого парарозаніліну. Склад інкубаційної суміші: Нафтол-АS-BI-фосфат диметилформамід (або ацетон) 0,05 Μ трис-HCl-буфер 1 Μ розчин левамізолу 4%-ний нітрит натрію (NaNO2) 5%-ний новий фуксин 50 5 мг 0,2 мл 10 мл 0,01 мл 0,05 мл 0,02 мл Розчинити нафтол-АS-ВІ-фосфат в декількох краплинах ацетону або диметилформаміду, додати трис-буфер і левамізол.Цей розчин є стабільним і може зберігатися при 4 °C декілька тижнів. Окремо змішати 4%-ний NaNO2 і 5%-ний новий фуксин, стряхнути пробірку 20 с для отримання гексаазотованого парарозаніліну. Безпосередньо перед використанням додати до розчину субстрату 75 мкл парарозаніліну, суміш перемішати і нанести на скельця на 20 хв. Потім змити інкубаційну суміш дистильованою водою, дофарбувати ядра клітин метиловим 2 UA 70410 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зеленим, знову промити препарати і висушити їх на повітрі. Продукт реакції візуалізується як обідок червоно-малинового кольору на поверхневій мембрані клітин. 9. Дофарбувати ядра клітин 2-% розчином метилового зеленого, висушити на повітрі, мікроскопіювати в імерсійній світлооптичній системі. Результат дослідження - верифікація підваріанту гострого чи хронічного проліферативного процесу. Виконання імуноцитохімічної реакції безпосередньо в нативних препаратах-мазках крові та кісткового мозку дає можливість провести 3-й етап діагностичних досліджень у хворих з онкогематологічними захворюваннями, коли не має можливості надіслати в лабораторію пробірки з гепаринізованою кров'ю та пунктат кісткового мозку протягом 20 год. з моменту забору проб. За результатами проведення імуноцитохімічної реакції в нативних препаратахмазках крові і кісткового мозку встановлюється уточнюючий діагноз злоякісного проліферативного процесу (гострого чи хронічного лейкозу різних підваріантів, лейкемізації злоякісних лімфом різних нозологічних форм). Приклади практичного застосування корисної моделі. Приклад 1. В лабораторію надіслали нативні мазки-препарати периферичної крові та кісткового мозку хворого N, 1953 р.н., мешканця м. Севастополя, з попереднім діагнозом - хронічний лімфопроліферативний процес. Для встановлення точного діагнозу, мазки-препарати були досліджені за допомогою цитоморфологічного, цитохімічного та імуноцитохімічного методів. За результатами цитоморфологічного та цитохімічного досліджень нами був встановлений попередній діагноз хронічного лімфолейкозу (ХЛЛ). Для уточнення діагнозу (визначення В- чи Тлінійного походження ліміфоцитів в даному випадку ХЛЛ) та встановлення у хворого типу В-ХЛЛ (типовий/атиповий) і клініко-прогностичної групи, що визначаються за клініко-гематологічними показниками та експресією на патологічних лімфоїдних клітинах аберантних маркерів, ми проводили імуноцитохімічну реакцію безпосередньо в нативних мазках периферичної крові і кісткового мозку. Імуноцитохімічну реакцію проводили в попередньо загорнутих у фольгу, заморожених на 20 °C більше ніж 2 години, і далі швидко зафіксованих в розчині формолацетону (рН 6,6), тричі промитих у забуференому фізіологічному розчині, акуратно просушених мазках-препаратах периферичної крові та кісткового мозку, застосовуючи специфічні моноклональні антитіла до лінійноспецифіних та диференційних антигенів В-лімфоцитів, ABC-комплекс з лужною фосфатазою як ферментну мітку. Патологічні лімфоїдні клітини в нативних мазках-препаратах експресували наступні антигени В-лімфоцитів: CD19, HLA-DR, CD20, CD23, CD5, CD43, CD38. Таким чином, за результатами цитоморфологічного, цитохімічного та імуноцитохімічного дослідження у хворого був встановлений діагноз: В-клітинний хронічний лімфолейкоз атипового типу, несприятливої клініко-прогностичної групи, що потребує негайного призначення хіміотерапії. Приклад 2. В лабораторію були надіслані нативні мазки-препарати периферичної крові та кісткового мозку хворої N, 1962 р.н., мешканки м. Вінниці, з попереднім діагнозом неходжкінська злоякісна лімфома (НЗЛ) в стадії лейкемізації процесу. Для встановлення нозологічної форми НЗЛ були застосовані цитоморфологічний, цитохімічний та імуноцитохімічний методи діагностичних досліджень. За результатами цитоморфологічного та цитохімічного дослідження мазків периферичної крові та кісткового мозку нами був встановлений попередній діагноз В-клітинна НЗЛ в стадії лейкемізації процесу. Для уточнення гістогенетичного варіанту В-НЗЛ, імуноцитохімічну реакцію проводили в нативних мазках-препаратах кісткового мозку. Для цього їх загортали у фольгу, заморожували при -20 °C, швидко фіксували в розчині формол-ацетону (рН 6,6), тричі промивали у забуференому фізіологічному розчині, акуратно просушували і проводили імуноцитохімічну реакцію із застосуванням специфічних моноклональних антитіл до лінійноспецифічних та диференційних антигенів В-лімфоцитів, ABC-комплексу з лужною фосфатазою як ферментної мітки. Патологічні лімфоїдні клітини внативних мазках-препаратах кісткового мозку експресували наступні антигени В-лімфоцитів: CD19, CD20, CD22, CD79a, CD5, циклін D1. Антиген CD23 не визначався. За результатами цитоморфологічного, цитохімічного та імуноцитохімічного дослідження у хворої був встановлений діагноз: В-клітинна НЗЛ з клітин мантійної зони; стадія з агресивним клінічним перебігом. 3 UA 70410 U Таким чином, одержані дані підтверджують дієвість способу, що заявляється. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб імуноцитохімічної діагностики онкогематологічних захворювань, який відрізняється тим, що визначення патологічних субстратних клітин проводять в нативних мазках-препаратах периферичної крові і пунктаті кісткового мозку онкогематологічних хворих шляхом заморожування при -20 C протягом 3-5 год., швидкої фіксації в розчині формолацетону (рН 6,6) протягом 1 хв., троєкратної промивки в забуференому фізіологічному розчині, виконання імуноцитохімічної реакції із застосуванням чутливих і специфічних реагентів - авідін-біотинового комплексу та лужної фосфатази як ферментної мітки. Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4