Спосіб культивування калусних тканин рослин

Реферат: Спосіб культивування калусних тканин рослин включає виділення експланту, стерилізацію і культивування його на живильних середовищах Мурасіге і Скуга або Гамборга і Евелега, які містять мінеральні солі, мікроелементи, інозит, тіамін, піродоксин, нікотинову та аскорбінову кислоти, селенистокислий натрій, сахарозу, агар і фітогормони, знімання біомаси, збереження частини її для подальшого культивування. UA 70681 U (54) СПОСІБ КУЛЬТИВУВАННЯ КАЛУСНИХ ТКАНИН РОСЛИН UA 70681 U UA 70681 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнології, а саме до способу культивування калусних тканин рослин, що є цінною сировиною для отримання біологічно активних речовин (БАР), і може бути використано у фармацевтичній, харчовій і косметичній промисловості. Калусну біомасу отримують біотехнологічними способами, культивуючи рослинні клітини і тканини in vitro. Спільним недоліком всіх відомих способів є низька частота калусоутворення і недостатній приріст біомаси. Це обмежує можливість вживання відомих способів для промислового виробництва клітинних культур. У зв'язку з цим виникає необхідність підвищення ефективності способів отримання клітинної біомаси. Як правило, це здійснюється за допомогою фізичних або хімічних дій: температури, випромінювання різної частоти і інтенсивності, синтетичних і природних стимуляторів зростання. Відомий спосіб культивування тривало пасированої калусної тканини Nicotiana tabacum, який містить культивування її на живильному середовищі Мурасіге і Скуга, модифікованому -7 -4 фітогормонами 2,4-Д, ІОК, кинетином та саліциловою кислотою – 10 -10 моль/л в темряві в умовах термостату при 24,5 °C (Дитчено Т.И., Юрин В.М. Регуляция ростовых процессов каллусной культуры Nicotiana tabacum под действием экзогенной салициловой кислоты // Вестник БГУ. Сер. 2, № 3. - 2008. - С. 72-76). Проте цей спосіб дозволяє збільшити приріст біомаси не більш ніж на 50-60 %. Найбільш близьким по технічній суті є спосіб культивування калусної тканини Астрагала шерстистоквіткового (Astragalus dasyanthus Pall.), яка збагачена селеном, що включає виділення експланту (сегменти листової пластинки), стерилізацію і культивування його на живильному середовищі Мурасіге і Скуга, модифікованому фітогормонами 2,4дихлорфеноксіоцтовою кислотою і 6-бензиламінопурином, а також селенистокислим натрієм. Спосіб дозволяє отримувати біомасу Астрагала шерстистоквіткового, збагачену селеном в органічній формі. Проте при цьому приріст біомаси калусу не збільшується, а в деяких випадках навіть знижується порівняно з контрольним варіантом без селену ["Спосіб культивування калусної тканини астрагала шерстистоквіткового (Astragalus dasyanthus Pall), яка збагачена селеном" / І.М. Юркова, В.П. Тайкова, І.О. Бугара та ін. - Патент України на корисну модель № 54431, МПК (2009) С12N5/04, Публ. 10.11.2010, Бюл. № 21]. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб культивування калусної тканини рослин, у якому завдяки введенню до складу живильних середовищ Мурасіге і Скуга або Гамборга і Евелега селенистокислого натрію отримують значно більший приріст кількості біомаси. Поставлена задача вирішується таким чином, що в способі культивування калусної тканини рослин, який містить попереднє виділення експланту, стерилізацію його відомими методами, культивування на живильному середовищі, модифікованому фітогормонами і селенистокислим натрієм, знімання біомаси і збереження частини її для подальшого культивування на середовищах Мурасіге і Скуга або Гамборга і Евелега, відповідно до корисної моделі, до складу живильних середовищ додають 0,1-5,0 мг/л селенистокислого натрію в перерахунку на селен. На живильне середовище висаджують інокулят масою 2,0-2,5 г/50 мл і культивують в стандартних умовах протягом 20-80 діб. У способі за патентом України № 54431, що дозволяє отримувати біомасу Астрагала шерстистоквіткового, яка збагачена селеном в органічній формі, та у заявленому способі експериментально встановлено, що приріст біомаси калусу при додаванні до середовища 5,015,0 мг/л селенистокислого натрію не збільшується, а в деяких випадках навіть зменшується порівняно з контрольним варіантом без селену. Також експериментально (див. приклади 1-12) нами встановлено, що додання до складу середовища селенистокислого натрію у значно менших кількостях значно підвищує приріст біомаси. Таким чином, селенистокислий натрій в малих концентраціях виявляє свої нові властивості - як стимулятор росту. Здійснення способу підтверджується на прикладах. Приклад 1. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга,що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинову кислоту - 1,0, аскорбінову кислоту - 1,0, кінетин - 0,2, 6 бензиламінопурин - 0,2, 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту - 1,0 і селенистокислий натрій - 5,0, розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °C протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя Астрагала шерстистоквіткового), заздалегідь простерилізовані 50 %ним розчином брадофену 10 Н протягом 10 хвилин, культивують при температурі 20 °С 1 UA 70681 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 протягом 80 діб, після чого калус витягують з посудин, відокремлюють від експланту і зважують. Питома швидкість росту калусів збільшилася в 2,3 разу. Приклад 2. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга, агар - 6500, тіамін, -1,5, піродоксин - 0,75, нікотинову кислоту - 1,0, аскорбінову кислоту - 1,0, кінетин - 0,2, 6бензиламінопурин - 0,2, 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту - 1,0 і селенистокислий натрій -2,0 розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °C протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя Астрагала шерстистоквіткового), заздалегідь простерилізовані 50 %ним розчином брадофену 10 Н протягом 10 хвилин, культивують при температурі 20 °С протягом 40 діб, після чого калус витягують з посудин, відокремлюють від експланту і зважують. Питома швидкість росту калусів збільшилася в 3,2 разу. Приклад 3. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинову кислоту - 1,0, аскорбінову кислоту - 1,0, кінетин - 0,2, 6бензиламінопурин - 0,2, 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту - 1,0 і селенистокислий натрій - 8,0, розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °C протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя Астрагала шерстистоквіткового), заздалегідь простерилізовані 50 %ним розчином брадофену 10 Н протягом 10 хвилин, культивують при температурі 20 °С протягом 40 діб, після чого калус витягують з посудин, відокремлюють від експланту і зважують. Питома швидкість росту калусів збільшилася в 0,2 разу. Приклад 4. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинову кислоту - 1,0, аскорбінову кислоту - 1,0, 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту - 2,0, 6-бензиламінопурин - 0,5 і селенистокислий натрій - 0,2, розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °C протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (зародки насінь Плюща звичайного), заздалегідь простерилізовані 50 %-ним розчином брадофену 10 Н протягом 10 хвилин, культивують при температурі 18 °C протягом 80 діб, після чого калус витягують з судин, відокремлюють від експланту і зважують. Питома швидкість росту калусів збільшилася в 1,8 разу. Приклад 5. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинову кислоту - 1,0, аскорбінову кислоту - 1,0, 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту - 2,0, 6-бензиламінопурин - 0,5 і селенистокислий натрій - 1,0, розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °С протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (зародки насінь Плюща звичайного), заздалегідь простерилізовані 50 %-ним розчином брадофену 10 Н протягом 10 хвилин, культивують при температурі 18 °C протягом 45 діб, після чого калус витягують з посудин, відокремлюють від експланту і зважують. Питома швидкість росту калусів збільшилася в 4,0 рази. Приклад 6. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинову кислоту - 1,0, аскорбінову кислоту - 1,0, 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту - 2,0, 6-бензиламінопурин - 0,5 і селенистокислий натрій - 8,0, розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °C протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8, У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (зародки насінь Плюща звичайного) заздалегідь простерилізовані 50 %-ним розчином брадофену 10 Н протягом 10 хвилин, культивують при температурі 18 °C протягом 45 діб, після чого калус 2 UA 70681 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 витягують з посудин, відокремлюють від експланту і зважують. Питома швидкість росту калусів збільшилася в 0,1 разу. Приклад 7. Готують живильне середовище Гамборга і Евелега, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Гамборга і Евелега, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинову кислоту - 1,0, аскорбінову кислоту - 1,0, 6-бензиламінопурин -1,5, 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту - 1,5 і селенистокислий натрій - 2,0, розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °C протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя Ломиносу виноградолистого), заздалегідь простерилізовані 50 %-ним розчином брадофену 10 Н протягом 10 хвилин, культивують в темноті при температурі 20 °C протягом 20 діб, після чого калус витягують з посудин, відокремлюють від експланту і зважують. Питома швидкість росту калусів збільшилася в 6,3 разу. Приклад 8. Готують живильне середовище Гамборга і Евелега, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Гамборга і Евелега, агар 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинову кислоту - 1,0, аскорбінову кислоту - 1,0, 6-бензиламінопурин -1,5, 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту - 1,5 і селенистокислий натрій - 5,0, розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °С протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя Ломиносу виноградолистого), заздалегідь простерилізовані 50 %-ним розчином брадофену 10 М протягом 10 хвилин, культивують в темноті при температурі 18 °C протягом 40 діб, після чого калус витягують з посудин, відокремлюють від експланту і зважують. Питома швидкість росту калусів збільшилася в 7,0 разів. Приклад 9. Готують живильне середовище Гамборга і Евелега, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Гамборга і Евелега, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинову кислоту - 1,0, аскорбінову кислоту - 1,0, 6-бензиламінопурин -1,5, 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту - 1,5 і селенистокислий натрій - 7,0, розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °C протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя Ломиносу виноградолистого), заздалегідь простерилізовані 50 %-ним розчином брадофену 10 Н протягом 10 хвилин, культивують в темноті при температурі 18 °C протягом 40 діб, після чого калус витягують з посудин, відокремлюють від експланту і зважують. Питома швидкість росту калусів збільшилася в 0,05 разу. Приклад 10. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинову кислоту - 1,0, аскорбінову кислоту - 1,0, 6-бензиламінопурин -0,5, кінетин - 1,0, 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту - 1,5 і селенистокислий натрій - 0,5, розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °C протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя і листових черешків Фатсхедери лізе), заздалегідь простерилізовані 50 %-ним розчином брадофену 10 Н протягом 10 хвилин, культивують в темноті при температурі 20 °C протягом 40 діб, після чого калус витягують з посудин, відокремлюють від експланту і зважують. Питома швидкість росту калусів збільшилася в 2,5 рази. Приклад 11. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинову кислоту - 1,0, аскорбінову кислоту - 1,0, 6-бензиламінопурин -0,5, кінетин - 1,0, 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту - 1,5 і селенистокислий натрій - 5,0, розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °C протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя і листових черешків Фатсхедери лізе), заздалегідь простерилізовані 50 %-ним розчином брадофену 10 Н протягом 10 хвилин, культивують в темноті при температурі 20 °C протягом 30 3 UA 70681 U 5 10 15 20 діб, після чого калус витягують з посудин, відокремлюють від експланту і зважують. Питома швидкість росту калусів збільшилася в 3,0 рази. Приклад 12. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0.75, нікотинову кислоту - 1,0, аскорбінову кислоту - 1,0, 6-бензиламінопурин -0,5, кінетин - 1,0, 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту - 1,5 і селенистокислий натрій - 7,0, розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °C протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя і листових черешків Фатсхедери лізе), заздалегідь простерилізовані 50 %-ним розчином брадофену 10 Н протягом 10 хвилин, культивують в темноті при температурі 20 °С протягом 30 діб, після чого калус витягують з посудин, відокремлюють від експланту і зважують. Питома швидкість росту калусів збільшилася в 0,2 разу. Пропонований спосіб культивування калусної тканини рослин може бути використано для біотехнологічного виробництва біомаси рослин з метою отримання біологічно активних речовин, що є основою для цінних лікарських препаратів. Використання замість інтактних лікарських рослин їх клітинних культур, одержаних біотехнологічним методом, має ряд переваг: зменшення антропогенної дії на дику природу, можливість отримання фітомаси - екологічно чистої сировини, незалежно від періоду вегетації, повністю вільної від полютантів (гербіцидів, пестицидів, важких металів і ін.) і управління процесом біосинтезу цільових продуктів. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб культивування калусних тканин рослин, що включає виділення експланту, стерилізацію і культивування його на живильних середовищах Мурасіге і Скуга або Гамборга і Евелега, які містять мінеральні солі, мікроелементи, інозит, тіамін, піродоксин, нікотинову кислоту, аскорбінову кислоту, селенистокислий натрій, сахарозу, агар і фітогормони, знімання біомаси, збереження частини її для подальшого культивування, який відрізняється тим, що живильні середовища містять селенистокислий натрій в перерахунку на селен у кількості 0,1-5,0 мг/л. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4