Спосіб прогнозування наслідків запліднення in vitro та переносу ембріонів

Реферат: UA 72171 U UA 72171 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до акушерства та гінекології (до репродуктивної медицини), і може бути використана в роботі лікарів-репродуктологів для прогнозування ненастання вагітності та невиношування вагітності після проведення запліднення in vitro і переносу ембріонів (ЗІВ і ПЕ). Упродовж останніх десятиріч в Україні погіршується медико-демографічна ситуація через падіння народжуваності, зростання захворюваності та смертності. Безпліддя є одним з вагомих факторів демографічної проблеми в Україні, адже частота безпліддя в шлюбі досягає 18-20 % [1]. ЗІВ і ПЕ розглядається як один з найбільш перспективних методів лікування безпліддя. Однак протягом останніх років не відмічено суттєвого зростання частоти настання вагітностей у програмах допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ): лише приблизно одна з чотирьох програм ЗІВ і ПЕ закінчується народженням живих дітей [2], що пов'язано як з високою частотою ненастання вагітності, так і високою частотою мимовільних викиднів після програм ЗІВ та ПЕ [3]. Багаторазові невдалі програми ДРТ є однією із найактуальніших проблем сучасної репродуктивної медицини, що зумовлює пошук їх причин і шляхів подолання. Однією з основних причин невдалих спроб ЗІВ і ПЕ вважають розлад імунологічних механізмів імплантації. Імплантація є складним, багатоетапним процесом, який реалізується за участі множинних клітинних і гуморальних факторів і каскаду різноманітних міжклітинних взаємодій. Особливої пошкоджуючої дії клітинам трофобласту можуть завдавати клітини натуральні кілери (NK-клітини). Так, інтерлейкін - 2 (IL-2) перетворює NK-клітини в лімфокінактивовані кілери, подібні до тих, що вбивають пухлинні клітини; інтерферон - у (ІФН-) активує макрофаги, внаслідок чого продукуються фактор некрозу пухлин- (ФНП-) та інтерлейкін-12 (IL-12), які, в свою чергу, теж активують NK-клітини. Окрім того, цей тип NK-клітин (CD56+) може самостійно синтезувати ряд прозапальних цитокінів, в першу чергу, ФНП-. Нещодавні дослідження на мишах показали, що основною точкою прикладання NK-клітин є не стільки трофобласт, скільки ендотелій судин: виникнення васкулітів через інфільтрацію судинної стінки лімфоцитами, порушене кровопостачання трофобласта - це пояснює як відсутність настання вагітності, так і низьку концентрацію хоріонічного гонадотропіну (ХГ) в крові або його падіння після перших позитивних результатів [4]. Серед інших імунологічних причин порушення імплантації розглядають аутоімунізацію, зміну кількості та активності певних імунних клітин під час вагітності [5]. Аутоімунізація як стан перманентної циркуляції аутоантитіл та аутореактивних лімфоцитів, дія яких спрямована проти власних антигенів організму, може бути причиною пошкодження як безпосередньо плода, так і плаценти, ендотеліоцитів, тромбоцитів тощо. Більшість спостережень свідчить, що жінки з класичними аутоімунними захворюваннями входять в безплідну популяцію ще перед клінічними проявами хвороби. До антитіл, які можуть порушувати фертильність, належать антифосфоліпідні (АФА) (фосфатидилсеринові, фосфатидилетаноламінові, фосфатидилхолінові, фосфатидилгліцеролові, фосфатидилінозитолові), антитіла до тиреоїдної пероксидази та тиреоглобуліну (АТА), антинуклеарні, антиспермальні, антиоваріальні антитіла, антитіла до гормонів та нейротрансміттерів [6] тощо. Найбільш близьким аналогом запропонованої корисної моделі є спосіб прогнозування невиношування вагітності аутоімунного ґенезу [7], що включає визначення концентрації антитіл до тиреоїдної пероксидази та тиреоглобуліну в периферійній крові. Недоліком аналога є те, що визначення лише антитіл до тиреоїдної пероксидази та тиреоглобуліну є недостатнім для оцінки ступеня аутоімунних порушень та прогнозування ризику невиношування чи негативного результату після ЗІВ та ПЕ. В основу корисної моделі поставлено задачу створити спосіб, який дозволить спрогнозувати наслідки ЗІВ та ПЕ у пацієнток, що проходять лікування безпліддя шляхом ЗІВ та ПЕ. Поставлена задача вирішується тим, що у способі прогнозування наслідків ЗІВ та ПЕ, що включає визначення АТА в периферійній крові пацієнток, згідно з корисною моделлю, до початку лікування безпліддя методом ЗІВ та ПЕ додатково проводять визначення АФА та вмісту NK-клітин CD3-/CD56+/CD16+ і NKT-клітин CD3+/CD56+/CD16+ і при отриманих значеннях, які перевищують встановлені межі норми, прогнозують можливе ненастання або невиношування вагітності. Перевагою заявленого способу є те, що проводять визначення не лише АТА, а й АФА. Додаткове визначення іншого виду аутоантитіл та певних імунних клітин дає змогу більш ефективно спрогнозувати ризики для вагітності. Ці дослідження проводять одночасно з визначенням NK-клітин CD3-/CD56+/CD16+, NKT-клітин CD3+/CD56+/CD16+ в периферійній крові, що дає можливість більш комплексно оцінити відповідь материнського організму і спрогнозувати можливі наслідки після проведення ЗІВ та ПЕ. Визначення NKT-клітин 1 UA 72171 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CD3+/CD56+/CD16+ представляє на сьогоднішній день найбільший інтерес через свою особливу властивість зв'язувати антиген без участі головного комплексу гістосумісності [8]. На основі запропонованого способу проводять прогнозування не лише невиношування вагітності, але й можливого ненастання вагітності у жінок, що проходять лікування безпліддя методом ЗІВ та ПЕ, аналізуючи імунологічні порушення серед різних груп пацієнток з безпліддям: серед жінок з двома і більше негативними спробами ЗІВ та ПЕ, серед жінок з викиднем в анамнезі в терміні до 22 тижнів та з доношеною вагітністю, що наступила після першої спроби ЗІВ та ПЕ. У пацієнток з повторними негативними спробами ЗІВ та ПЕ та у пацієнток з анамнезом невиношування вагітності та негативними спробами ЗІВ та ПЕ спостерігається висока частота аутоімунізації (підвищення АТА і АФА), що часто поєднується з підвищенням NKT-клітин CD3+/CD56+/CD16+, NK-клітин CD3-/CD56+/16+. У жінок, в яких вагітність наступила з першої спроби ЗІВ та ПЕ, вищевказані зміни практично не виявляються. Пацієнтки з підвищенням АТА, АФА, що поєднуються з підвищенням NKT CD3+/CD56+/CD16+, NK CD3-/CD56+/16+ в периферійній крові, є групою високого ризику повторних негативних спроб ЗІВ і ПЕ та невиношування вагітності. Спосіб здійснюють таким чином. До початку лікування безпліддя методом ЗІВ та ПЕ виконують забір периферійної крові пацієнток шляхом венепункції в кількості 10 мл в систему з ЕДТА (гепаринові кульки). Визначення NK-клітин CD3-/CD56+/CD16+ та NK-T-клітин CD3+/CD56+/CD16+ в периферійній крові проводять методом проточної цитометрії з ТМ використанням моноклональних антитіл (фірма Beckman Coulter, США) на пристрої СуАn ADP (фірма Beckman Coulter, США). Підраховують показники відносного (%) та абсолютного вмісту NK-клітин CD3-/56+/16+, NKT-клітин CD3+/56+/16+. Відносну кількість NK-клітин CD3-/56+/16+ та NKT-клітин CD3+/56+/16+, яка перевищує встановлені межі норми, розцінюють як патологічну (межі норми відносної кількості NK-клітин CD3-/56+/16+ - 5-15 %; та NK-T-клітин CD3+/56+/16+ 3-7 % (лабораторія "Євролаб", м. Київ). Визначення АТА проводять електрохромолюмінесцентним методом на аналізаторі Cobas 6000 (фірма Roche Diagnostics, Швейцарія). Результат оцінюють як позитивний при рівні антитіл до тиреопероксидази більше 34 МО/мл та більше 115 МО/мл для антитіл до тиреоглобуліну (лабораторія "Синево", м. Київ). Визначення АФА проводять імунолюмінесцентним методом на аналізаторі Liaison Diasorin (Італія). АФА класу IgM and IgG більше, ніж 10 МО/мл, розцінюють як позитивний тест (лабораторія "Синево", м. Київ). Запропонований спосіб впроваджується на базі клініки репродуктивної медицини "МЦ Інтерсоно" (м. Львів, Україна). За запропонованим способом комплексно обстежено 100 жінок перед початком проведення програми ЗІВ та ПЕ (60 жінок з двома і більше негативними спробами ЗІВ - І група; 20 жінок з викиднем в анамнезі в терміні до 22 тижнів і проходили лікування безпліддя шляхом ЗІВ та ПЕ - II група; 20 жінок з доношеною вагітністю, що наступила після першої спроби ЗІВ - III група). Всі жінки були віком до 35 років, проведені спроби ЗІВ та ПЕ характеризувались переносом якісних бластоцист 5-ої доби культивування; у всіх жінок було виключено маткову патологію та зміни каріотипу у подружжя. У 40 % жінок І групи виявлено підвищення NK-клітин CD3-/CD56+/CD16+, NK-T-клітин CD3+/CD56+/CD16+ в периферійній крові, у 56,7 % жінок відносна кількість NK-клітин CD3/CD56+/CD16+, NK-T-клітин CD3+/CD56+/CD16+ була в межах норми, а у 3,3 % - спостерігалось зниження цих показників. У II групі жінок з наявністю викидня в анамнезі частота виявлення підвищеного вмісту NK-клітин CD3-/CD56+/CD16+, NK-T-клітин CD3+/CD56+/CD16+ була найвищою і склала 65 %, у 35 % - змін не виявлено. У жінок з доношеною вагітністю (III група), яка наступила з першої спроби ЗІВ та ПЕ, підвищені рівні NK-клітин CD3-/CD56+/CD16+, NKTклітини CD3+/CD56+/CD16+ виявлялись найрідше - в 20 % випадків, у 80 % - змін не було виявлено (р