Штам соматичних структур agrocybe aegerita (brig.) fayod 167 – продуцент пероксидаз

Номер патенту: 75538

Опубліковано: 10.12.2012

Автори: Федотов Олег Валерійович, Волошко Тетяна Євгенівна

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Штам соматичних структур Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod 167 продуцент пероксидаз, що виявляє високий рівень пероксидазної активності міцелію та культурального фільтрату, який зберігається в Колекції культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України під реєстраційним номером 167.

Текст

Реферат: Штам соматичних структур Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod 167 - продуцент пероксидаз виявляє високий рівень пероксидазної активності міцелію та культурального фільтрату. UA 75538 U (54) ШТАМ СОМАТИЧНИХ СТРУКТУР AGROCYBE AEGERITA (BRIG.) FAYOD 167 - ПРОДУЦЕНТ ПЕРОКСИДАЗ UA 75538 U UA 75538 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до мікології і біотехнології та може бути використана у грибівництві, в мікробіологічній промисловості та у науково-дослідних лабораторіях для одержання ферменту пероксидази на основі культивування штамів-продуцентів. Пероксидази (КФ 1.11.1.7) - це фермент класу оксидоредуктаз, що каталізує окиснення різних електрон-донорних субстратів за допомогою Н2О2. Відомо, що пероксидаза має не лише пероксидазні, а й оксидазні властивості: каталізує окиснення цілого ряду сполук за рахунок неактивованого молекулярного кисню. Наявні експериментальні дані свідчать про те, що пероксидаза пов'язана з цілим рядом метаболічних перетворень, що відбуваються в клітинах |6|. Фермент пероксидаза має широку область застосування і є основним реагентом в медичних діагностичних тест-системах для імуноферментного аналізу та виявлення цілого ряду вірусних, бактеріальних і онкологічних захворювань; для лікування СНІДу, раку, лепри (прокази) і радіаційних захворювань; для гальмування процесів старіння клітин живих організмів. Цей фермент також застосовується для фундаментальних досліджень в області біотехнології, генно-білкової інженерії, медицини та біології і є основою біосенсорів, хемі- та біолюмінесцентних датчиків. Широке використання пероксидази і в різних галузях промисловості, зокрема в виробництві паперу та обробці деревини, а також в новітніх розробках альтернативних джерел енергії. Перспективне використання пероксидази в екологічному контролі довкілля - для аналізу вмісту важких металів і інших полютантів, зокрема фенолів [6, 7]. Унікальні властивості цього ферменту, добра розчинність в воді, висока специфічність за окисником, стійкість при зберіганні, широкий спектр застосування і висока ціпа чистого препарату стимулювали активний пошук нових джерел отримання ферменту пероксидази і методів її виділення. Встановлено, що ксилотрофні базидіоміцети мають добре розвинений ферментативний апарат та здатні до синтезу, крім ферментів і інших різноманітних біологічно активних речовин. Ферменти мікологічного походження за своїми властивостями є більш близькими до тваринних, у порівнянні з ферментами рослинного походження, та не виявляють токсичної дії, що властиво бактеріальним ферментам [8]. Відомий штам Р-01 макроскопічного гриба Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm., який добре плодоносить до 53,33 кг на 100 кг повітряносухого субстрату і виявляє вміст антиокисних речовин у міцелії -32,11±1,69 % і плодових тілах - 32,15±3,61 % на живильних середовищах, що складаються з дешевих та доступних компонентів, наприклад зволоженого лушпиння соняшника. Не наводяться дані про пероксидазну активність (ПА) штаму Р-01 [4]. Відомий штам F-vv зимового опенька {Flammulina velutipes (Curl.: Fr.) Sing.), який має вміст антиокисних речовин як у міцелії, що дорівнює 76,47±3,56 %; так і в плодових тілах, що дорівнює 58,54±4,21 % в ніжках і 78,33±6,69 % в шапинках на живильних середовищах, що складаються з дешевих та доступних компонентів, наприклад зволоженого лушпиння соняшника. Як і в попередньому винаході, не наводяться дані з пероксидазної активності інтродукованого штаму [5]. Найбільш близький за технічною суттю і досяжності результату є штам F-203 соматичних структур їстівного базидіоміцету Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. продуцент плодових тіл і міцелію з антиокисними властивостями та екзо- і епдопероксидаз [1,3]. В основу корисної моделі поставлена задача отримання нового штаму базидіального дереворуйнівного гриба Agrocybe aegerila (Brig.) Fayod, який відрізняється від найближчого анадога підвищеною здатністю до біосинтезу пероксидази. Поставлена задача вирішується тим, що інтродукований штам 167 гриба Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod, згідно з корисною моделлю, виявляє високий рівень пероксидазної активності культурального фільтрату і міцелію при поверхневому культивуванні на глюкозо-пептонному середовищі при 27,5 °C протягом 12 діб. Отриманий штам 167 макроскопічного гриба Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod має наступні характеристики. Штам 167 Agrocybe aegerita отримано з Колекції культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України. Чисту міцеліальну культуру штаму 167 підтримують шляхом пересівів кожні 5-6 місяців на агаризованому незахміленому пивному суслі (4° по Баллінгу). Культурально-морфологічні ознаки. Штам 167 досліджували на сусло-агарі та рідкому глюкозо-пептонному живильних середовищах. 1 UA 75538 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 На сусло-агарі у чашках Петрі, міцелій розповсюджується рівномірно. Субстратні і повітряні гіфи розвиваються одночасно. Краще розвинуті повітряні гіфи. Колонія гриба має круглу форму, щільна. Колір колонії сніжно-білий, з віком, на 10-25 добу, забарвлюється до світло-кремового чи сіруватого, починаючи з центра колонії. Субстрат не забарвлює. Текстура міцелію щільна бавовняна, вовняна, висота повітряних гіф становить близько 1-2 мм. На застосованих для культивування живильних середовищах, колонія має специфічний грибний запах. Плодові тіла на агаризованих живильних середовищах утворює дуже рідко. Мікроскопічні дослідження свідчать, що гіфи гриба гілчасті, звивисті, з початку їх розгалуження дихотомічне, тісно сплітаються між собою. Добре спостерігаються стінки і багаточисельні перегородки гіф. Перегородки утворюються як в місцях появи пряжок, так і між клітинами без пряжок. Стінки незабарвлені чи слабо забарвлені до світло-кремового чи сіруватого кольору, їх апекси характеризуються гомогенною структурою протоплазми. З часом, в віці 5 і більше діб, в клітинах міцелію з'являються вакуолі та жирові включення. Фізіолого-біохімічні ознаки. Відношення до джерел вуглецевого живлення. Вивчався вплив різних джерел вуглецю на ріст і біосинтез біологічно активних речовин штамом 167 Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod. Встановлено, що утилізація моно-, ді- та полісахаридів протікає з різною швидкістю. Найвище накопичення біомаси спостерігається при вирощуванні штаму 167 на рідкому глюкозопептонному середовищі, яке як вуглецеве живлення містило дульцит, дуже повільний ріст та біосинтез оксидоредуктаз - на середовищі з сорбітом. Високий рівень пероксидазної активності міцелію і культурального фільтрату відмічається в віці 12 діб при культивуванні штаму на живильному середовищі, яке містило ксилозу, максимальне значення ПА культурального фільтрату зафіксовано на середовищі з фруктозою та глюкозою. Приклад конкретного виконання 1. В цьому прикладі описується визначення динаміки росту та ПА міцелію і культурального фільтрату штаму Agrocybe aegerita 167. Для визначення динаміки росту та ПА, штам 167 культивують поверхнево в колбах Ерленмейєра ємністю 250 мл на глюкозо-пептонному середовищі (ГПС) об'ємом 50 мл протягом 12 діб при 27,5 °C. Готують ГПС наступного складу, г/ л [2]: глюкоза 10,0 пептон 3,0 КН2РО4 0,6 К2HРО4 0,4 . MgSO4 7H2O 0,5 СаСl2 0,05 . ZnSO4 7H2O 0,001 до 1 дистильована вода літра. Співвідношення C:N дорівнює 13:1. pH становить 6,5±0,2. Як інокулюм використовують 10-ти денні міцеліальні культури штаму 167 на сусло-агарі. Строк та температуру ферментації вибрано, виходячи з результатів попередніх досліджень, в яких виявлено, що максимуми ПА припадають на період експоненціального росту культури при 27,5 °C. Вибраний термін росту, також, пояснюється недоцільністю довгострокового культивування продуцентів. Визначення ферментативної активності у міцелії (на одиницю маси, г) та культуральному фільтраті (на одиницю об'єму, мл) проводять на 6-ту, 9-ту та 12-ту добу культивування. Матеріалами для досліджень є гомогенізований міцелій (МГ) та культуральний фільтрат (КФ), які готують наступним чином. Міцелій при 5±1 °C відділяють від культуральної рідини шляхом фільтрування. Біомасу міцелію визначають ваговим методом [2]. Отриманий міцелій додатково підсушують на фільтрувальному папері і охолоджують до 1±0,5 °C. Підготовлений міцелій гомогенізують шляхом розтирання у стерильній ступці. Пероксидазну активність у водній витяжці гомогенату міцелію та культуральному фільтраті визначають за методом, який базується на вимірі за допомогою фотоелектроколориметра, наприклад КФК-2, при довжині хвилі 535 мм в кюветі 10 мм, інтенсивності забарвлення продукту окиснення о-діанізидину перекисом водню, який утворюється при дії пероксидази. Одиниця активності пероксидази відповідає кількості ферменту, що каталізує перетворення 1 мкмоля Н2О2 за одну хвилину в оптимальних умовах. Розрахунки проводять за формулою [2]: X E  V1  p, E1  K  V2  t 2 UA 75538 U 5 де: X пероксидазна активність (ум. од.), Е - екстинкція, V1 - об'єм забарвленої проби (мл), V2 - об'єм МГ або КФ (г, мл), Е1 – коефіцієнт мікромолярної екстинкції (0,0128), К коефіцієнт для перерахунку у літри (1000), t - час інкубації (5 хв.), p - коефіцієнт розведення. Дослідження проводять у трикратній повторності. Статистичну обробку проводять з використанням програм статистичної обробки результатів біологічних експериментів. Дані щодо росту та пероксидазної активності нативного міцелію і культурального фільтрату штаму Agrocybe aegerita 167 надані у таблиці 1. Таблиця 1 Динаміка росту та пероксидазної активності міцелію і культурального фільтрату штаму Agrocybe aegerita 167 . Термін культивування, діб 6 9 12 10 15 20 25 30 35 40 45 Біомаса, г/л 0,95±0,01 2,85±0,03 3,22±0,04 -2 ПА, 10 , ум. од. Міцелій КФ 2,37±0,12 1,88±0,14 4,81±0,10 4,65±0,21 9,68±0,24 8,06±0,26 Вивчення динаміки росту та ПА міцелію штаму Agrocybe aegerita 167 показало, що дослідний штам накопичує біомасу протягом всього терміну ферментації та досягає максимуму її накопичення на 12 добу культивування. Встановлено, що існує позитивна кореляція між швидкістю накопичення біомаси та пероксидазною активністю, яка також досягає максимуму наприкінці терміну культивування. ПА КФ та міцелію мають позитивну кореляцію, а рівень пероксидазної активності міцелію в 1,2 разу перевищує цей показник культурального фільтрату. Для порівняння зазначимо, що пероксидазна активність міцелію і культурального фільтрату . -2 штаму Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. F-203 складала 7,8 10 ум. од. на 15 добу культивування [3]. Таким чином, запропонований штам 167 їстівного базидіального гриба Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod. є високоактивним продуцентом екзо- і ендопероксидаз та може бути використаний у біотехнології отримання ферменту пероксидази мікологічного походження. Штам 167 Agrocybe aegerila (Brig.) Fayod. зберігається в Колекції культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАМ України під реєстраційним номером 167 та колекції культур шапинкових грибів кафедри фізіології рослин Донецького національного університету. Джерела інформації: 1. Бисько Н.А. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре / Н.А. Бисько, Л.С. Бухало, СП. Вассср и др. - К.: Наук. думка, 1988. - 144 с. 2. Дудка И.А. Методы экспериментальной микологии. Справочник / И.Л. Дудка, С.П.Вассер, И.Л. Элланская. - К.: Наук. думка, 1982.-550 с. 3. Патент 3863 України. Штам F-203 соматичних структур їстівного базидіоміцету Flammulina velulipes (curt.: Гг.) sing.-продуцент плодових тіл і міцелію з антиокисними властивостями та екзо- і ендопероксидаз/ Федотов О.В. Заявка № 2004032388, від 31.03.2004, кл. 7C12N1/14, A01G1/04, Бюл. № 12, від 15.12.2004. (прототип) 4. Патент 46461 Л України. Штам соматичних структур їстівного базидіоміцета Pleurotus ostreatus (Jacg.: Fr.) Kumm. P-01 - продуцента плодових тіл і міцелію з антиокисними властивостями / Федотов О.В., Вовк П.В. Заявка № 2001075193, від 20.07.01, кл. 7C12N1/14, A01G1/04, Бюл. №5, від 15.05.02. 5. Патент 64129 Л України. Штам соматичних структур їстівного базидіоміцета Flammulina velulipes (Curt.: Fr.) Sing. F-vv - продуцента плодових тіл і міцелію з антиокисними властивостями/ Федотов О.В., Горяшник ІО.В. Заявка № 2003020945, від 04.02.2003, кл. 7C12N1/14, ЛОЮ 1/04, Бюл. № 2, від 16.02.04. 6. Рогожин В.В. Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов / В.В. Рогожин. - СІ 16: ГИОРД, 2004.-240 с 7. Шугалей НА. Поиск промышленных источников выделения растительных пероксидаз, области практического использования полученного фермента / П.А. Шугалей, Л.Б. Власова, Л.Т. Федорова, A.Л. Федулов, Е.В. Спиридович // Груды БГУ.-2010. -T.5. - С.53-61. 8. Fedotov О. V. Wood-destroying fungi as bio-sources of ferments for medicinal and nutritional purposes / O.V. fedotov Plant and Microbial Enzymes: isolation, characterization and biotechnology applications Tbilisi: Myza, 2007.-P. 125-126. 50 3 UA 75538 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Штам соматичних структур Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod 167 - продуцент пероксидаз, що виявляє високий рівень пероксидазної активності міцелію та культурального фільтрату, який зберігається в Колекції культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України під реєстраційним номером 167. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Strain of somatic structures of agrocybe aegerita (brig.) fayod 167 - producer of peroxidases

Автори англійською

Voloshko Tetiana Yevhenivna, Fedotov Oleh Valeriiovych

Назва патенту російською

Штамм соматических структур agrocybe aegerita (brig.) fayod 167 - продуцент пероксидаз

Автори російською

Волошко Татьяна Евгеньевна, Федотов Олег Валериевич

МПК / Мітки

МПК: A01G 1/04, C12N 1/14

Мітки: brig, agrocybe, пероксидаз, fayod, соматичних, продуцент, штам, aegerita, структур

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/6-75538-shtam-somatichnikh-struktur-agrocybe-aegerita-brig-fayod-167-producent-peroksidaz.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Штам соматичних структур agrocybe aegerita (brig.) fayod 167 – продуцент пероксидаз</a>

Подібні патенти