Живильне середовище для культивування штаму 167 agrocybe aegerita (brig.) fayod – продуцента пероксидази

Живильне середовище для культивування штаму 167 Agrocybe aegerita - продуцента пероксидази, що включає вуглевод, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій 3 штамів базидіоміцетів - продуцентів пероксидази [3]. Найбільш близьким за технічною суттю і досяжністю результату є живильне середовище для вирощування штаму P-6v Pleurotus ostreatus - продуцента каталази, яке включає глюкозу, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, цинк сірчанокислий і воду, а також додатково містить лігносульфонат у такому співвідношенні компонентів, г/л: глюкоза 12 пептон 1 КН2РО4 0,8 К2НРО4 0,2 MgSO4×7Н2О 0,5 СаСl2 0,05 ZnSO4×7Н2О 0,001 лігносульфонат 8-10 дистильована вода до 1 літра. Не надаються дані про можливості використання цього живильного середовища для культивування штамів базидіоміцетів - продуцентів пероксидази [5]. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення глюкозо-пептонного живильного середовища для вирощування штаму 167 Agrocybe aegerita - продуцента пероксидази, в якому шляхом оптимізації концентрацій компонентів досягають значного підвищення активності ферменту пероксидази, яка може бути використана в біотехнології, медицині, фармацевтичній, хімічній, харчовій та інших галузях промисловості. Поставлена задача вирішується тим, що живильне середовище для вирощування штаму 167 Agrocybe aegerita - продуцента пероксидази, яке включає вуглевод, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, цинк сірчанокислий і воду, згідно з корисною моделлю, як вуглевод використовують сахарозу при наступних співвідношеннях, г/л: сахароза 12 пептон 5 КН2РО4 0,4 К2НРО4 0,2 MgSO4×7Н2О 0,5 СаСl2 0,05 ZnSO4×7Н2О 0,001 дистильована вода до 1 літра. Запропоноване живильне середовище є новим тому, що воно не відоме з рівня складу живильного середовища та об'єкта дослідження. Приклад конкретного виконання 1. Для дослідження росту і пероксидазної активності штаму 167 Agrocybe aegerita та порівняння отриманих результатів з іншими культурами, що росли на стандартному глюкозо-пептонному середовищі, готують вихідне живильне середовище наступного складу, г/л [1, 2]: глюкоза 10 пептон 3 67443 4 КН2РО4 0,6 К2НРО4 0,4 MgSO4×7H2O 0,5 СаСl2 0,05 ZnSO4×7H2O 0,001 дистильована вода до 1 літра. Живильне середовище розливають по 50 мл в конічні колби Ерленмейєра на 250 мл, стерилізують в автоклаві при 121±2 °C протягом 40 хвилин. Кислотність середовища після стерилізації становить 6,0-6,5 рН. Середовище після охолодження інокулюють шматочком міцелію розміром 5×5 мм. Інокулюмом є чиста культура штаму 167, яка росла 7-10 діб на 4° за Баллінгом агаризованому суслі (СА) або на картопляно-глюкозному агарі (КГА) [1]. Штам 167 культивують протягом 20 днів при температурі 27,5 °C. Пероксидазну активність (ПА) міцеліального гомогенату (МГ) та ростові показники: рН культурального фільтрату (КФ) і накопичення біомаси фіксують на 5, 10, 15 і 20-ту добу культивування. Визначення активності ферменту проводили якісно і кількісно. При додаванні перекису водню реакційна суміш за наявності в ній пероксидази набувала рожевого кольору. Інтенсивність забарвлення залежить від концентрації ферменту. Визначають пероксидазну активність за методом, який базується на вимірі за допомогою фотоелектроколориметра, наприклад КФК-2, при довжині хвилі 535 нм в кюветі 10 мм інтенсивності забарвлення продукту окислення о-діанізидину перекисом водню. Одиниця пероксидази відповідає кількості ферменту, що каталізує перетворення 1 мкмоля Н2О2 за одну хвилину в оптимальних умовах. Розрахунки проводять за формулою: E  V1 , X E1  K  V2  t де: X - активність ферменту пероксидази; Е - екстинкція; V1 - об'єм забарвленої проби; V2 - об'єм гомогенату міцелію (МГ) або культурального фільтрату (КФ); Е1 - коефіцієнт мікромолярної екстинкції (0,0128); К - коефіцієнт для перерахунку з міліметрів у літри (1000); t - час інкубації (5 хв.); р розведення. Статистичну обробку експериментальних даних проводили за методом дисперсійного аналізу, порівняння середніх арифметичних - за методом Дункана [7]. Дані динаміки пероксидазної активності штаму 167 наведені в табл. 1. Дані досліду (табл. 1) свідчать про наступне. Досліджуваний штам 167 накопичує біомасу протягом усього терміну ферментації. Максимальне накопичення біомаси зафіксовано на 20-ту добу росту і склало 2,68 г/л, що у 8,8 разу вище за показник на 5 добу росту і в 1,2 разу вище маси міцелію у віці 15-ти діб. Таким чином, спостерігається уповільнення накопичення біомаси в кінці терміну ферментації цього штаму. 5 67443 6 Таблиця 1 Динаміка пероксидазної активності штаму 167 Agrocybe aegerita Час культивування, доба 5 10 15 20 2 Біомаса, г/л 0,304±0,10 1,064±0,16 2,213±0,14 2,681±0,23 Пероксидазна активність, 10- , ум. од. МГ КФ 12,19±0,02 2,30±0,01 4,37±0,01 6,45±0,04 0,47±0,01 4,20±0,01 15,63±0,12 20,20±0,10 рН КФ 6,48 6,22 5,55 5,57 рН культурального фільтрату змінюється в процесі росту штаму 167 у бік підкислення до 5,55 од. (мінімальне значення) на 15-ту добу з подальшим незначним підвищенням рН-реакції середовища до 5,57 од., що, ймовірно, пов'язане з використанням компонентів середовища та накопиченням у КФ певних метаболітів. Визначення пероксидазної активності міцелію і культурального фільтрату дозволяє говорити про наступне. Пероксидазна активність міцелію має два максимуми у міцелії - на початку і наприкінці культивування, та максимум у КФ на 20 добу. Другий максимум пероксидазної активності міцелію на 20-тий день росту вище цього показника на 5-ту добу в 1,28 разу. Перший максимум пероксидазної активності, можливо, пов'язаний з інтенсивними процесами метаболізму, характерних для цього періоду розвитку грибної культури. Другий максимум, ймовірно, обумовлений дефіцитом поживних речовин в культуральній рідині, про що говорить уповільнення росту культури. Пероксидазна активність у культуральному фільтраті в порівнянні з міцелієм в 5,3 разу нижче на 5-ту добу, потім зростає і стає в 1,48 разу вище на 10-ту добу та в 8,94 разу - на 15-ту добу росту. Абсолютний максимум пероксидазної активності КФ зафіксований на 20-й день культивування і був в 1,29 разу вище пероксидазної активності міцелію в цьому віці. Максимум пероксидазної активності в культуральній рідині на 20-у добу, ймовірно, пояснюється тими ж причинами, що і максимум пероксидазної активності міцелію в кінці ферментації. Приклад конкретного виконання 2. Дослідження впливу джерел вуглецевого живлення на пероксидазну активність штаму 167 Agrocybe aegerita. При вивченні впливу джерел вуглецевого живлення на пероксидазну активність штаму 167 гриба Agrocybe aegerita було взято 14 вуглецевмісних сполук: моносахариди: пентози - арабіноза, ксилоза; гексози - глюкоза, фруктоза; олігосахариди (дисахариди) - сахароза, лактоза; полісахариди крохмаль; багатоатомні спирти - гліцерин; насичені дикарбонові кислоти - щавлева кислота, бурштинова кислота; карбонові кислоти - саліцилова кислота; гідроксікарбонові кислоти - яблучна кислота; гексози-кетози - фруктоза. Джерела вуглецевого живлення взяті в еквіваленті за вмістом вуглецю в перерахунку на його вміст в глюкозі. Пероксидазну активність визначали на 10 добу. Результати дослідження наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Вплив джерел вуглецю на ріст та пероксидазну активність штаму 167 Agrocybe aegerita 2 № з/п Хімічна сполука Біомаса, г/л рН КФ 1 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 2 3 0,704±0,01 1,020±0,02 1,064±0,16 1,500±0,09 0,940±0,02 0,390±0,05 0,650±0,08 1,580±0,03 0,820±0,06 0,870±0,09 0,012±0,01 0,115±0,05 0,011±0,02 0,104±0,01 4 6,55 6,25 6,22 6,20 6,60 6,40 6,45 6,50 6,65 6,00 4,60 4,50 4,95 4,80 Арабіноза Ксилоза Глюкоза Фруктоза Сахароза Лактоза Крохмаль Маніт Дульцит Гліцерин Щавлева к-та Бурштинова к-та Саліцилова к-та Яблучна к-та Дані таблиці 2 показують, що джерела вуглецевого живлення вірогідно впливають на пероксидазну активність штаму 167 гриба Agrocybe ПА·10- , ум. Од. КФ 5 1,14±0,02 0,89±0,01 6,45±0,04 0,78±0,09 9,16±0,01 1,72±0,02 8,75±0,05 5,24±0,08 2,74±0,03 1,56±0,06 0 0 0 0 МГ 6 0,78±0,07 0,78±0,04 4,37±0,01 0,34±0,01 1,58±0,04 2,50±0,05 0,78±0,02 0,78±0,09 0,31±0,06 0,78±0,03 0 0 0 0 aegerita. Максимальне значення ПА КФ на 10-у добу культивування зафіксували на рівні -2 9,16·10 ум. од. в культурах, що росли на живиль 7 67443 ному середовищі з сахарозою. Дещо нижча ПА зафіксована в КФ культури, що росла на живильному середовищі з крохмалем. Мінімальні значення ПА, близько -2 0,78·10 ум. од., спостерігали в культурах, що росли на середовищі з фруктозою. Не зафіксована пероксидазна активність на середовищах зі щавлевою, бурштиновою, яблучною та саліциловою кислотами. У міцелії абсолютний максимум ПА становив -2 4,37·10 ум. од. на 10-у добу в культурах, що росли на живильному середовищі з глюкозою. Максимальне накопичення біомаси, що становить 1,59 г/л, спостерігається на 10-у добу росту на живильному середовищі з манітом. Дещо нижче накопичення біомаси відмічене на середовищі з фруктозою. Приклад конкретного виконання 3. 8 Оптимізація складу живильного середовища для росту та пероксидазної активності штаму 167 Agrocybe aegerita. Удосконалення вихідного середовища, згідно з поставленою задачею, проводять за методом пов4 ного факторного експерименту (ПФЕ-2 ) [5]. Варіювання () вмісту у живильних середовищах сахарози і пептону - факторів х1, х2 складає 2 г/л, а КН2РО і К2НРО4 - факторів х3 і х4 - 0,2 г/л, інші компоненти мають постійну концентрацію (табл. 3.). Сахароза, як компонент живильного середовища, була обрана, оскільки на цьому середовищі спостерігалась максимальна пероксидазна активність культурального фільтрату, який доцільно використовувати в біотехнології з метою отримання ферменту. Таблиця 3 Склад живильних середовищ для оптимізації росту і підвищення пероксидазної активності штаму 167 Agrocybe aegerita Фактори № живильного середовища х1 (сахароза) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 10 х2 (пептон) х3 (КН2РО) х4 (К2НРО4) Взаємодія факторів Вміст у живильному середовищі, г/л 1 0,4 0,2 1 0,4 0,2 5 0,4 0,2 5 0,4 0,2 1 0,8 0,2 1 0,8 0,2 5 0,8 0,2 5 0,8 0,2 1 0,4 0,6 1 0,4 0,6 5 0,4 0,6 5 0,4 0,6 1 0,8 0,6 1 0,8 0,6 5 0,8 0,6 5 0,8 0,6 3 0,6 0,4 Всі операції по приготуванню живильних середовищ; культивуванню штаму 167 та визначенню його пероксидазної активності і накопичення біомаси проводять за прикладом конкретного вико 1 х1 х2 х1х2 х3 х1х3 х2х3 х1х2х3 х4 х1х4 х2х4 х1х2х4 х3х4 х1х3х4 х2х3х4 х1х2х3х4 0 нання 1. Штам 167 культивують упродовж 10 діб при температурі 27,5 °C. Вплив складу живильного середовища на ріст та пероксидазну активність штаму 167 Agrocybe aegerita представлено в таблиці 4. Таблиця 4 Вплив складу живильного середовища на ріст та пероксидазну активність штаму 167 Agrocybe aegerita № живильного середовища 1 2 3 4 5 -2 рН КФ Біомаса, г/л 6,39 6,32 6,60 6,37 6,97 0,28±0,01 0,42±0,05 1,36±0,03 1,88±0,01 0,52±0,04 ПА·10 , ум. од. МГ 1,92±0,03 5,95±0,02 2,67±0,03 6,25±0,04 0,80±0,08 КФ 6,46±0,01 7,51±0,02 7,60±0,02 10,26±0,02 7,29±0,01 9 67443 10 Продовження таблиці 4 Вплив складу живильного середовища на ріст та пероксидазну активність штаму 167 Agrocybe aegerita № живильного середовища 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 -2 рН КФ Біомаса, г/л 6,02 6,10 6,27 6,76 6,73 6,80 6,94 6,67 6,58 6,77 6,66 6,60 0,49±0,07 1,08±0,02 1,71±0,05 0,90±0,08 1,29±0,03 0,94±0,06 1,98±0,09 1,08±0,02 1,25±0,07 1,25±0,09 2,51±0,04 0,94±0,02 Дані досліду (табл. 3) свідчать про наступне. Найбільше накопичення біомаси на 10-ту добу культивування штаму 167 спостерігалося на живильних середовищах № 16, 12 та 4 в порядку убування. Ці три середовища мали максимальний вміст сахарози та пептону, середовище № 16 також мало максимальний вміст КН2РО4 та К2НРО4. Мінімальне накопичення біомаси зафіксовано при рості на середовищі № 1, де був найменший вміст факторів х2, x3 і х4, а вміст сахарози був на стандартному рівні. Максимальна пероксидазна активність як у міцелії, так і в культуральному фільтраті, відмічена у культурах, що росли на середовищах № 4, 8, 12 і 16, що відповідає пікам найвищого накопичення біомаси, за винятком середовища № 8. Також всі ці середовища були близькими за складом та характеризувалися високим вмістом сахарози та пептону, вміст калію фосфорнокислого одно- і двозаміщеного варіює. рН культурального фільтрату з рН0=6,57 змінюється в межах від 6,10 (середовище № 7) до 6,97 (середовище № 5). Отже, живильне середовище № 12 є найбільш придатним для росту - накопичення біомаси (перевищує контроль (середовище № 17) у 2,44 разу за цим показником), а живильне середовище № 4 для синтезу ендо- та екзопероксидаз (перевищує контроль (середовище № 17) у 4,11 разу за ПА міцелію, та у 1,12 разу за ПА КФ) штамом 167 Agrocybe aegerita. Оптимізація глюкозо-пептонного середовища для росту і пероксидазної активності штаму 167 Agrocybe aegerita дозволяє вести його культивування, направлене на отримання міцеліальної біомаси чи ферментів пероксидази екзо- і ендопоходження, що спрощує і здешевлює їх виробництво. ПА·10 , ум. од. МГ 0,95±0,04 4,24±0,08 4,46±0,07 3,92±0,09 1,27±0,06 1,89±0,02 4,19±0,03 0,80±0,01 0,83±0,07 0,88±0,09 4,71±0,05 1,58±0,04 КФ 7,13±0,01 7,30±0,01 8,74±0,04 5,99±0,05 9,68±0,01 9,11±0,06 8,80±0,01 7,34±0,05 6,61±0,07 9,65±0,02 10,20±0,01 9,16±0,01 Джерела інформації: 1. Бухало А.С., Бисько Н.А., Соломко Э.Ф., Билай В.Т., Митропольская Н.Ю., Поєдинок Н.Л., Гродзинская А.А., Михайлова О.Б. Культивирование съедобных и лекарственных грибов. Практические рекомендации / Под общ. ред. А.С. Бухало. - Киев, 2004. - 120 с. 2. Ломберг М.Л. Лікарські макроміцети у поверхневій та глибинній культурі: дис. канд. біол. наук: 03.00.21 / HAH України; Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного. - К., 2005. - 20 с. 3. Патент 22915 А України. Живильне середовище для вирощування штаму М-81 Hirschioporus laricinus - продуцента молокозгортаючого ферменту / Бойко М.І., Негруцький С.Ф., Федотов О.В., Борисенко О.О. Заявка № 96031179 від 27.03.1996, кл.С12N1/38, Бюл. № 3, від 30.06.1998. 4. Патент 39243 А України. Спосіб визначення каталазної активності базидіоміцетів / Федотов О.В., Гавриленко Г.В. Заявка №2000116560, від 21.11.00, МПК 7C12N9/58, Бюл. № 5, від 15.06.2001. 5. Патент 39760 України. Живильне середовище для вирощування штаму Р-6v Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. - продуцента каталази / Федотов O.B., Брусніцина О.М. Заявка № u200812035, від 10.10.2008, МПК (2009), кл. C12N9/52, А23С19/00 Бюл. №5, від 10.03.2009 (прототип). 6. Патент 63177 А України. Живильне середовище для виділення і пересівання чистих культур вищих базидіоміцетів / Федотов О.В., Бугрім Є.Ю., Крюков О.А. Заявка № 2003021394, від 17.02.2003, МПК7C12N9/54, А23С19/032, Бюл. № 1, від 15.01.2004. 7. Приседський Ю.Г. Статистична обробка результатів біологічних експериментів / Ю.Г. Приседський. - Донецьк: Кассиопея, 1999. - 210 с. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601