Спосіб визначення інтенсивності перекисного окиснення ліпідів культур базидіоміцетів

Реферат: Спосіб визначення інтенсивності перекисного окиснення ліпідів культур базидіоміцетів, який містить отримання культурального фільтрату, гомогенізацію міцелію, додавання до міцеліального гомогенату та культурального фільтрату розчинів трихлороцтової кислоти і тіобарбітурової кислоти та інкубацію реакційної суміші на киплячій водяній бані, охолодження, центрифугування та спектрофотометричне вимірювання екстинкцій дослідних проб проти контрольних при довжині хвилі =532 нм. Перед гомогенізацією міцелій охолоджують, потім охолоджений міцелій тричі гомогенізують при температурі не вище +5 °C, причому 1-й нативний міцелій, 2-й - після додавання 2,0 мл 22,5 % трихлороцтової кислоти, 3-й - 2,0 мл 0,6 % розчину тіобарбітурової кислоти, суміш інкубують протягом 15 хв, охолоджують до +20 °C, центрифугують, вимірюють екстинкції дослідних проб проти контрольної (з 0,5 мл дистильованої води) при довжинах хвилі 532 нм і 590 нм, кількість продуктів перекисного окиснення ліпідів, що реагують з тіобарбітуровою кислотою розраховують в нмоль/г абсолютно сухої біомаси міцелію або на мл культурального фільтрату. UA 78481 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ІНТЕНСИВНОСТІ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСНЕННЯ ЛІПІДІВ КУЛЬТУР БАЗИДІОМІЦЕТІВ UA 78481 U UA 78481 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікології, а саме до способів визначення інтенсивності перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) культур базидіоміцетів. Спосіб визначення інтенсивності перекисного окиснення ліпідів культур базидіоміцетів може бути використаний у наукових мікологічних дослідженнях, при промисловому культивуванні макроміцетів - продуцентів біологічно активних речовин для різних галузей промисловості, з метою розкладання лігноцелюлозних відходів промисловості і сільського господарства та біоремедіації забруднених середовищ [10]. В стані фізіологічного оптимуму існує динамічна рівновага між двома протилежними складовими: вільнорадикальним окисненням і активністю системи антиоксидантного захисту. У звичайних умовах ця рівновага утримує інтенсивність перекисного окиснення на певному рівні, перешкоджаючи розвитку неконтрольованих окислювальних процесів. Дереворуйнівні базидіальні гриби - лігнотрофи, мають унікальну здатність до розщеплення лігноцелюлозного комплексу деревини. Враховуючи значну хімічну стійкість лігніну, очевидно, що гриби білої гнилі мають використовувати надзвичайно потужні механізми його деградації. Встановлено, що процес руйнування лігніну відбувається під впливом лігнінолітичних оксидоредуктаз, та залежить від генерації активних форм кисню (АФК). Останні, в силу своєї хімічної нестабільності, здатні до ініціювання спонтанних ланцюгових реакцій [1, 2, 4, 8]. З іншого боку, АФК мають здатність до ініціювання перекисного окиснення найважливіших макромолекул клітин - ліпідів, білків, нуклеїнових кислот. Це призводить до порушення метаболічних процесів, дезорганізації функціонування, патології та загибелі клітин [7, 9]. Незважаючи на наявність складної і ефективної системи антиоксидантного захисту, ксилотрофні базидіальні гриби можуть знаходитися в стані окисного стресу, тому важливою є оцінка інтенсивності протікання процесів ПОЛ базидіоміцетів, залучених до різноманітних біотехнологічних процесів. Оцінка інтенсивності ПОЛ здійснюється різними методами: встановлення концентрації продуктів ПОЛ в біологічному матеріалі, активності ферментів - активаторів ПОЛ, а також неспецифічними методами (наприклад, хемілюмінесцентний метод) [1]. Найбільш поширеними завдяки точності і нескладності у виконанні є способи оцінки активності ПОЛ, засновані на тесті з тіобарбітуровою кислотою [3]. Відомий спосіб визначення вмісту малонового діальдегіду за допомогою тіобарбітурової кислоти, який полягає в тому, що при нагріванні в кислому середовищі частина продуктів ПОЛ, які належать до класу гідроперекисів, розкладається з утворенням малонового діальдегіду (МДА), взаємодія якого з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) веде до утворення забарвленого комплексу з максимумом поглинання при 532 нм. Встановлено, що реакцію з ТБК дає не тільки МДА, а й багато інших карбонільних сполук, які утворюються під час ПОЛ. Тому разом їх називають ТБК-активні продукти (ТБК-АП) [6]. Спосіб розроблений для визначення продуктів ПОЛ в тканинах тварин та людини і не задовольняє вимогам мікологічних досліджень. Відомий метод вивчення в культурах грибів вмісту продуктів ПОЛ, що реагують з тіобарбітуровою кислотою. Згідно з методом, визначається вміст продуктівПОЛ в гомогенатах міцелію (МГ) і ліпідах грибів різних систематичних, екологічних і фізіологічних груп [3]. В способі передбачається використання складних технологічних підготовчих процедур, додаткових спеціальних реактивів, не розроблено спосіб визначення вмісту продуктів ПОЛ в культуральному фільтраті (КФ) штамів. Найбільш близьким за технічною суттю і досяжності результату є спосіб визначення інтенсивності перекисного окиснення ліпідів в КФ і МГ культур базидіоміцетів за допомогою тесту з ТБК, який складається з наступних етапів. Після визначеного терміну культивування, міцелій шляхом фільтрування відокремлюють від культуральної рідини, отримуючи КФ. Міцелій (0,5 г) гомогенізують з 3 мл дистильованої води шляхом розтирання у фарфоровій ступці. До гомогенату додають 3 мл 20 % трихлороцтової кислоти (ТХО). КФ використовують в кількості 0,5 мл. В мірні пробірки зі скляними пробками відбирають дві проби по 2 мл. До одної проби доливають 2 мл 20 % ТХО (контрольна проба), до іншої - 2 мл 0,5 % розчину ТБК в 20 % ТХО (дослідна проба). Проби інкубують протягом 30 хвилин на киплячій водяній бані, швидко охолоджують. Центрифугують при 3000 об/хв протягом 10 хвилин. Супернатант відбирають у чисті пробірки і вимірюють екстинкцію дослідної проби проти контрольної на спектрофотометрі при довжині хвилі =532 нм. Кількість МДА у тканинах виражають у наномолях МДА на 1 г сирої маси міцелію або 1 мл КФ [5]. Недоліками методу є мала кінцева концентрація мікологічного матеріалу в пробі, а також утворення забарвлених продуктів взаємодії ТБК з деякими речовинами неліпідної природи, що впливає на точність методу. В основу корисної моделі поставлена задача розробки способу визначення інтенсивності перекисного окиснення ліпідів культур базидіоміцетів, в якому завдяки модифікації методу і 1 UA 78481 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 оптимізації складу реакційної суміші та удосконалення процедури підготовки мікологічного матеріалу, етапів інкубування реакційної суміші і вимірювання оптичної густини, зменшується похибка аналізу, розширюються можливості досліду, він є більш придатний у мікологічному лабораторному аналізі. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб визначення інтенсивності перекисного окиснення ліпідів культур базидіоміцетів містить отримання культурального фільтрату, гомогенізацію міцелію, додавання до МГ та КФ розчинів ТХО і ТБК та інкубацію реакційної суміші на киплячій водяній бані, охолодження, центрифугування та спектрофотометричне вимірювання екстинкцій дослідних проб проти контрольних при довжині хвилі =532 нм, згідно з корисною моделлю, охолоджений міцелій тричі гомогенізують при температурі не вище +5 °C (1-й - нативний міцелій, 2-й - після додавання 2,0 мл 22,5 % розчину ТХО, 3-й - 2,0 мл 0,6 % розчину ТБК), суміш інкубують протягом 15 хв, охолоджують до +20 °C, центрифугують, вимірюють екстинкції дослідних проб проти контрольної (з 0,5 мл дистильованої води) при 532 нм і 590 нм, кількість ТБК-АП розраховують в нмоль/г абсолютно сухої біомаси міцелію або на мл КФ. Запропонований спосіб визначення інтенсивності перекисного окиснення ліпідів культур базидіоміцетів, завдяки потрійній гомогенізації міцелію на холоді та співвідношенню компонентів реакційної суміші (мікологічного матеріалу - 0,5 (г - міцелій або мл - КФ), 22,5 % ТХУ та 0,6 % ТБК по 2 мл) забезпечує оптимальні умови реакції утворення забарвленого продукту, що підвищує його чутливість, порівняно з прототипом. Потрійна гомогенізація, як показали результати досліду, забезпечують більш повну поетапну екстракцію продуктів ПОЛ та їх реакцію з ТБК. Гомогенізація міцелію при температурі, нижчій за +5 °C, зупиняє процеси ПОЛ на відповідному (справжньому) рівні і не спотворює реальний результат дослідження. Для більш точного визначення вмісту продуктів ПОЛ в матеріалі, визначають екстинкції дослідних проб при двох довжинах хвиль 532 нм і 590 нм. Вміст ТБК-АП визначають шляхом вираховування з показника екстинкції при 532 нм (максимум поглинання комплексу продуктів ПОЛ з ТБК) показника екстинкції при 590 нм (поглинання комплексами ТБК зі сполуками неліпідної природи). Перерахунок вмісту ТБК-АП на абсолютно суху масу міцелію дозволяє нівелювати індивідуальні характеристики досліджуваного зразка. Приклад конкретного виконання 1. В цьому прикладі описується визначення інтенсивності перекисного окиснення ліпідів в міцелії культур базидіоміцетів. Для отримання соматичних структур міцелію, попередньо відібраний біосинтетично активний штам базидіоміцети, наприклад, Т-10 Fomes fomentarius (L.) Fr. культивуютьна рідкому глюкозо-пептонному живильному середовищі (ГПС) на лабораторній качалці протягом 7-ми діб при температурі 25 °C. ГПС має наступний склад, г/л [5]: глюкоза 10,0 пептон 3,0 КН2РО4 0,6 К2НРО4 0,4 0,5 MgSO47H2O СаСl2 0,05 0,001 ZnSO47H2O дистильована вода до 1 літра. Співвідношення C:N дорівнює 13:1. рН після стерилізації становить 6,6±0,1. Треба враховувати, що склад живильного середовища, рівень рН та умови культивування можуть бути відмінні від вказаних, для культивування різних штамів базидіоміцетів. Наприкінці ферментації міцелій відділяють від культуральної рідини за допомогою щільної капронової тканини, отримуючи таким чином культуральний фільтрат. Міцелій при температурі до +5 °C тричі промивають дистильованою водою, підсушують, забираючи зайву вологу фільтрувальним папером. Частину міцелію використовують для визначення інтенсивності ПОЛ, залишок зважують у відкаліброваних бюксах і висушують при 105 °C до постійної маси та вимірюють абсолютно суху біомасу для встановлення вологості міцелію, що необхідно для перерахунку вмісту ТБК-АП на суху масу. Наважку промитого дистильованою водою міцелію (0,5 г) переносять у фарфорову ступку та гомогенізують шляхом розтирання. Всі операції з гомогенізації проводять при температурі не вище +5 °C. В ступку додають 2,0 мл 22,5 % розчину ТХО і знов гомогенізують. Потім додають 2,0 мл 0,6 % розчину ТБК, ще раз гомогенізують, вміст ретельно перемішують, переносять в пробірку та кип'ятять протягом 15 хвилин на водяній бані. Після інкубації проби швидко охолоджують і центрифугують 15 хвилин при 3000 об/хв. Відбирають супернатант в сухі чисті 2 UA 78481 U пробірки (дослідна проба). В контрольній пробі замість гомогенату використовують 0,5 мл дистильованої води. Подальша обробка контрольної проби проходить так само, як і дослідної. Екстинкції дослідної проби вимірюють проти контрольної на спектрофотометрі, наприклад СФ-26, при довжинах хвиль 532 нм і 590 нм. Розрахунок ведуть за формулою: ' A 5 10 15 20 ' 30 35 40 45 50 55 156  10 5  P , , 6 де: E532 і E590 - показники екстинкції дослідної проби при 532 і 590 нм; 10 - фактор розмірностей; V - об'єм реакційної суміші (мл); K - коефіцієнт перерахунку на абсолютно суху 5 масу міцелію; 1,5610 - молярний коефіцієнт екстинкції; P - наважка матеріалу - сирого міцелію (г). Кількість ТБК-АП виражають в нмоль/г абсолютно сухої маси міцелію. Досліди проводять у трикратній повторності. Отримані експериментальні дані обробляють з використанням Microsoft Excel та пакета програм для проведення статистичної обробки результатів біологічних експериментів. Наприклад, вміст ТБК-АП в глибинному міцелії штаму Т-10 Fomes fomentarius становить 66,98±5,98 нмоль/г. Приклад конкретного виконання 2. В цьому прикладі описується визначення інтенсивності перекисного окиснення ліпідів в культуральному фільтраті культур базидіоміцетів. Культуральний фільтрат отримують за прикладом конкретного виконання 1. КФ у кількості 0,5 мл переносять у пробірку, додають 2,0 мл 22,5 % розчину ТХО та 2,0 мл 0,6 % розчину ТБК. Вміст ретельно перемішують та кип'ятять протягом 15 хвилин на водяній бані. Після інкубації проби швидко охолоджують. Зазвичай центрифугування не потрібне. Підготовка контрольної проби та вимірювання екстинкцій дослідної проби відбувається, як зазначено в прикладі конкретного виконання 1. Розрахунок ведуть за формулою: A 25 E532  E590   10 6  V  K E 532  E 590   10 6  V 1,56  10 5  P , 6 де: E532 і E590 - показники екстинкції дослідної проби при 532 і 590 нм; 10 - фактор 5 розмірностей; V - об'єм реакційної суміші (мл); 1,5610 - молярний коефіцієнт екстинкції; P об'єм КФ (мл). Кількість ТБК-АП виражають в нмоль/мл КФ. Досліди проводять у трикратній повторності. Отримані експериментальні дані обробляють за прикладом конкретного виконання 1. Наприклад, вміст ТБК-АП в КФ штаму Т-10 Fomes fomentarius становить 1,47±0,01 нмоль/мл. Таким чином, запропонований спосіб визначення інтенсивності перекисного окиснення ліпідів культур базидіоміцетів є адаптованим для мікологічного матеріалу, достатньо простим для виконання у лабораторній практиці, та має високу чутливість, завдяки застосованим прийомам проведення досліду. Джерела інформації:, які використані при складанні заявки: 1. Владимиров Ю.А. Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция как инструмент в медико-биологических исследованиях // Соросовский образовательный журнал.2001. - Т. 7, № 1. - С. 16-23. 2. Капич А.Н. Определение антиоксидантной активности на модели перекисного окисления линолевой кислоты, инициированного грибной марганец пероксидазой / А.Н. Капич, Т.В. Корнейчик // Успехи медицинской микологии.-2007. - Т. 9. - С. 162-164. 3. Капич А.Н. Содержание в грибах продуктов перекисного окисления липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой / А.Н. Капич, Т.С. Гвоздкова // Микология и фитопатология.-1998. - Т. 32, вып. 4. - С. 30-36. 4. Капич А.Н. Сопряжение перекисного окисления липидов с деградацией лигнина у дереворазрушающих базидиомицетов / А.Н. Капич // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сб. науч. тр.-2011. - Т. 3.-316-335. 5. Соломко Е.Ф. Вплив хімічних речовин на інтенсивність перекисного окислення ліпідів штамів грибів Flammulina velutipes (Curt, ex Fr.) Sing, та Lentinula edodes (Berk.) Pegler. / Е.Ф. Соломко, О.В. Федотов, O.B. Чайка // Збірник наукових праць Волинського національного університету імені Лесі Українки “Природа Західного Полісся та прилеглих територій”.-2010. - № 7. - С. 146-149. (прототип) 6. Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили. Под ред. В.Н. Ореховича / Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С. 66-68. 3 UA 78481 U 5 7. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function / W. Droge // Physiological Reviews.-2002.-82. - P. 47-95. 8. Hammel K.E. Reactive oxygen species as agents of wood decay by fungi / K.E. Hammel, A.N. Kapich, K.A.Jr. Jensen, Z.C. Ryan // Enzyme and Microbial Technology.-2002.-30. - P. 445-453. 9. Pham-Huy L.A. Free radicals, antioxidants in disease and health / L.A. Pham-Huy, H. He, C. Pham-Huyc // International Journal of Biomedical Science.-2008.-4. - P. 89-96. 10. Winquist E. Production of lignin modifying enzymes on industrial waste material by solid-state cultivation of fungi / E. Winquist, U. Moilanen, A. Mettala, M. Leisola, A. Hattaka // Biochem. Eng. J.2008.-42. - P. 128-132. 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 Спосіб визначення інтенсивності перекисного окиснення ліпідів культур базидіоміцетів, який містить отримання культурального фільтрату, гомогенізацію міцелію, додавання до міцеліального гомогенату та культурального фільтрату розчинів трихлороцтової кислоти і тіобарбітурової кислоти та інкубацію реакційної суміші на киплячій водяній бані, охолодження, центрифугування та спектрофотометричне вимірювання екстинкцій дослідних проб проти контрольних при довжині хвилі =532 нм, який відрізняється тим, що перед гомогенізацією міцелій охолоджують, потім охолоджений міцелій тричі гомогенізують при температурі не вище +5 °C, причому 1-й - нативний міцелій, 2-й - після додавання 2,0 мл 22,5 % трихлороцтової кислоти, 3-й - 2,0 мл 0,6 % розчину тіобарбітурової кислоти, суміш інкубують протягом 15 хв, охолоджують до +20 °C, центрифугують, вимірюють екстинкції дослідних проб проти контрольної (з 0,5 мл дистильованої води) при довжинах хвилі 532 нм і 590 нм, кількість продуктів перекисного окиснення ліпідів, що реагують з тіобарбітуровою кислотою розраховують в нмоль/г абсолютно сухої біомаси міцелію або на мл культурального фільтрату. Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4