Спосіб прогнозування перебігу атопічного дерматиту у дітей

Реферат: Спосіб прогнозування перебігу атопічного дерматиту у дітей включає ідентифікацію ділянок геному, з якими асоціюється розвиток та перебіг захворювання. UA 79300 U (54) СПОСІБ ПРОГНОЗУВАННЯ ПЕРЕБІГУ АТОПІЧНОГО ДЕРМАТИТУ У ДІТЕЙ UA 79300 U UA 79300 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузей біології та медицини і може бути використана для прогнозування тяжкого та ускладненого перебігу атопiчного дерматиту у дітей. Атопічний дерматит (АД) на сьогодні залишається важливою і складною медико-соціальною проблемою, яка зумовлена його розповсюдженістю, збільшенням переходу захворювання в тяжкі і хронічні форми. Тяжкість проблеми АД також зумовлена початком "алергічного маршу", коли захворювання прогресує від шкірних до респіраторних проявів алергії: алергічного риніту (АР), бронхіальної астми (БА), формування якої часто спричинює підвищена сприйнятливість до вірусних інфекцій. АД розглядають як мультифакторіальне захворювання, виникнення якого значною мірою пов'язане зі спадковою схильністю. Гени схильності до атопічних захворювань містять поліморфізми, які обумовлені відхиленням послідовності структурних компонентів генів, що є причиною зміни їх функцій. Проведення геномних досліджень дозволяє ідентифікувати ділянки геному, з якими асоціюється розвиток АД. Гени можуть спричинювати розвиток атопії в цілому або впливати на специфічну IgE-відповідь на алергени, вираженість алергічного запалення, а також бути пов'язаними з іншими ланками алергічного процесу [Балаболкин И.И., Тюменцев Е.C. Влияние генетических факторов на развитие атонического дерматита у детей / Педиатрия. - 2009. - Т. 87, № 2. - C. 125-129]. Відомо ряд способів визначення генетичної детермінованості при АД: визначена роль поліморфізму гена інтерлейкіну-12b1 у розвитку АД [Association of the IL12RB1 promoter polymorphisms with increased risk of atopic dermatitis and other allergic phenotypes / N. Takahashi, M. Akahoshi, A. Matsuda [et al.] // Human Molecular Genetics. - 2005. - V. 14, № 21. - P. 3149-3159]. Встановлений зв'язок поліморфізму інтерлейкіну-10 з АД у корейських дітей [Association of interleukin-10 gene promoter polymorphism in children with atopic dermatitis / N. Takahashi, M. Akahoshi, A. Matsuda / M.H. Sohn, J.S. Song, K.W. Kim [et al.] // J Pediatr. - 2007. - V. 150, № 1. P. 106-108]. Відомо про роль порушень бар'єрної функції шкіри при АД спричинених мутаціями в гені, що кодує філагрін [Мутации в гене филаггрина как предрасполагающий фактор развития атопического дерматита / Т.И. Саликова, В.Н. Максимов, Ю.В. Максимова [и др.] // Клиническая дерматология и венерология. - 2010. - № 3, C. 4-7; Денисов А.А. Закономерности иммунологической и структурной перестройки кожи при атопическом дерматите: автореф. на соискание уч. степени канд. мед. наук: спец. 14.03.09 "Клиническая иммунология, аллергология", 03.03.04 "Клеточная биология, цитология, гистология" / А.А. Денисов. Новосибирск., 2011. - 36 с.]. Виявлені асоціації тяжкого АД з деякими антигенами HLA та їх комбінаціями [Иллек Я.Ю. Ассоциации HLA-антигенов при тяжелом течении атопического дерматита у детей раннего возраста / Я.Ю. Иллек, Г.А. Зайцева, А.В. Галанина // Педиатрия. 2008. - Т. 87, № 4, с. 18-20]. Доказана роль поліморфізму 2258G/A гена TLR2 у хворих на АД з тяжким перебігом захворювання, підвищеним рівнем IgE та більшою сприйнятливістю до колонізації золотистим стафілококом [The toll-like receptor 2 R753Q polymorphism defines a subgroup of patients with atopic dermatitis having severe phenotype / P. Ahmad-Nejad, S. MrabetDahbi, K. Breuer [et al.] // J. Allergy Clin. Immunol.-2004. - V. 113, № 3. - p. 565-567]. Є дані про зв'язок поліморфізму гену TLR2 (rs4696480) з тяжким перебігом АД в дорослих [Association of the toll-like receptor 2 A-16934T promoter polymorphism with severe atopic dermatitis / D.-Y. Oh, R. R. Schumann, L. Hamann [et al.] // Allergy.-2009. - V. 64, № 11. - P. 1608 1615]. Також, показана асоціація поліморфізму С-1237Т гена TLR9 з АД [Putative association of a TLR9 promoter polymorphism with atopic eczema / N. Novak, C-F. Yu, С. Bussmann [et al.] // Allergy. 2007. - V. 62, № 7. P. 766-772]. Найбільш близьким аналогом до заявленого способу є спосіб дослідження алельних поліморфізмів генів цитокінів TNFA, IL4, IL5 i HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1 при різних варіантах клінічного перебігу АД (Карпова А.В. Сочетанный анализ аллельного полиморфизма генов цитокинов TNFA, IL4, IL5 и HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1 при различных вариантах клинического течения атопического дерматита.: автореф. на соискание уч. степени канд. мед. наук: спец. 14.00.36 "Аллергология и иммунология", 14.00.11 "Кожные и венерические болезни" / А.В. Карпова. - Новосибирск., 2009.-22 с.). В основу цього способу поставлено задачу оцінити інформативність сполученого виявлення алелей генів цитокінів IL4, IL5, TNFA і HLA-комплексу для прогнозу розвитку різних варіантів перебігу АД. Методика ґрунтується на генотипуваннi алельних варіантів генів методом рестриктного аналізу продуктів ампліфікації (ПДРФ - аналіз) і методом алель-специфічної ампліфікації зі сиквенс-специфічними праймерами (PCR-mSSP), та виявленні асоційованості алельних варіантів для прогнозування варіанту перебігу АД на ранніх етапах виникнення захворювання. Проте, для практичної медицини, даний спосіб має ряд недоліків, які обумовлені складністю та громіздкістю проведення обстежень, що вимагає значних фінансових затрат на дослідження "генетичних ансамблів", відсутністю чітких критеріїв для призначення подібної методики. Крім 1 UA 79300 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 того, спосіб прогнозу розвитку різних варіантів перебігу АД за рахунок виявлення поліморфізму генів цитокінів, застосовувався лише щодо дорослих осіб. Відомості про інформативність даного методу серед дитячого населення відсутні, що вносить протиріччя в доцільність застосування подібного обстеження. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб прогнозування тяжкого та ускладненого перебігу захворювання в дітей хворих на АД зі схильністю до гострих респіраторних вірусних інфекцій з урахуванням генотипу. Поставлена задача вирішується шляхом створення способу визначення генетичної детермінованості при атопічному дерматиті шляхом ідентифікації ділянок геному, з якими асоціюється розвиток та перебіг захворювання, згідно з корисною моделлю, для підвищення ефективності визначення ризику тяжкого та ускладненого перебігу атопiчного дерматиту у дітей зі схильністю до частих гострих респіраторних вірусних інфекцій, як генетичні маркери використовують аналіз поліморфних ділянок 896A/G гену TLR4 (rs4986790) методом ПЛР на наявність мутантної алелі 896 G. Запропонований спосіб дозволяє прогнозувати тяжкий перебіг та подальший розвиток "атопічного маршу" в дітей хворих на АД зі схильністю до частих гострих респіраторних вірусних iнфекцій з урахуванням генетичних маркерів ризику розвитку патології. Заявлений спосіб вирішується наступним чином: після проведеного детального збору анкетних даних, анамнезу, даних клінічного стану на час огляду, об'єктивних даних зі сторони різних органів та систем та алергологічного обстеження була сформована група хворих на АД, до якої ввійшли 27 дітей з АД зі схильністю до частих ГРВІ (діти віком від 1 до 3 років з кратністю ГРВІ - 6 і більше разів на рік, діти від 3 до 5 років - 5 і більше разів на рік, діти старші за 5 років - 4 і більше разів на рік), які перебували на диспансерному обліку в дитячих поліклінічних відділеннях дитячих міських клінічних лікарень м. Полтави. Діагноз АД установлювали на основі діагностичного алгоритму, що прийнятий в Україні та затверджений МОЗ України на основі критеріїв діагностики Hanifin, Rajka (1980). Групу контролю склали 81 практично здорові особи з бази ДНК НДІ генетичних та імунологічних основ розвитку патології та фармакогенетики ВДНЗУ "Українська медична стоматологічна академія", які були скриновані на відсутність обтяженого алергологічного анамнезу. Отримання периферичної крові пацієнтів здійснювали шляхом забору крові з кубітальної вени натщесерце в об'ємі 4 мл у вакуумну пробірку з ЕДТА (8,4 мг K3EDTA). Виділення геномної ДНК проводили методом фенол-хлороформної екстракції. Визначення поліморфізму 896A/G гену TLR4 проведено методом полімеразної ланцюгової реакції. Ампліфікацію специфічної ділянки ДНК здійснювали на ампліфікаторі "Терцик" ("ДНК-Технология", м. Москва) з використанням специфічних олігонуклеотидних праймерів: 5'GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3' та 5'-GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC-3' за такою програмою: денатурація 94 °C, 30 сек., 52 °C, 1хв., 72 °C 1 хв., 1 цикл; 30 циклів: 94 °C, 30 сек., 55 °C, 30 сек., 72 °C 30 сек.; заключний цикл - 72 °C 5 хв. Зберігання -10 °C. Для ідентифікації алелей проводили рестрикційний аналіз ампліконів за допомогою ендонуклеази рестрикції Msp І (НВО "Сибензим", Новосибірськ). Продукти рестрикції аналізували за допомогою електрофорезу в 3 % агарозному гелі ("Helikon", Москва) в 1хТВЕ (50 мМ трис-Н3ВО3 та 2 мМ ЕДТА, рН 8,0) протягом 2 годин при напрузі 2V на 1 см гелю. Гель фарбували етидіумом бромідом із подальшою візуалізацією результатів в УФ-світлі. Математичну обробку отриманих даних здійснювали з використанням програми "STATISTICA 6.0" (StatSoft Inc). Розподіл генотипів за досліджуваними поліморфними локусами 2 перевіряли на відповідність рівновазі Харді-Вайнберга за допомогою критерію χ . Для 2 порівняння частот алелей використовували критерій χ Пірсона з поправкою Ієтса на безперервність за кількості ступенів свободи рівній 1. Порівняння частот генотипів між досліджуваними групами проводили шляхом аналізу таблиць спряженості за допомогою точного тесту Фішера. Для порівняння частот варіантів у незв'язаних групах вираховували відношення шансів (ВШ) із визначенням 95 % довірчого інтервалу (ДІ). Аналіз відмінності частотних характеристик якісних ознак у двох незалежних групах проводили за допомогою точного двостороннього критерію Фішера (для малих груп). Для усіх видів аналізу статистично значущими вважали відмінності при р