Спосіб визначення бактерицидної та бактеріостатичної дії дезінфекційних засобів без застосування нейтралізаторів

Реферат: Спосіб визначення бактерицидної та бактеріостатичної концентрації дезінфекційних засобів без застосування нейтралізаторів включає багаторазові послідовні розведення дезінфекційного засобу в стерильній рідині, в кожну пробірку отриманого ряду розведень дезінфекційного засобу додають суспензію тестових бактерій. Потім витримують суміш протягом заданого дослідженням часу, додають до кожної пробірки надлишок стерильного живильного середовища. Після цього культивують зразки протягом досліджуваного терміну, а про бактерицидну та бактеріостатичну концентрації дезінфекційного засобу судять по параметрах зразка розведення, в якому наявний ріст бактерій. UA 89484 U (12) UA 89484 U UA 89484 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини і стосується лабораторного визначення бактерицидної і бактеріостатичної дії дезінфікуючих засобів, як основи їх специфічної активності. Відомі способи визначення бактерицидної та бактеріостатичної дії дезінфекційних засобів базуються на визначенні залишку живих бактерій в реакційній суміші з дезінфекційним засобом посівом на поживне середовище. Але для цього перед посівом доводиться припиняти (нейтралізувати) дію дезінфекційного засобу. Причина в тому, що прямий посів неминуче прихоплює частку дезінфекційного засобу, який продовжує свою дію і спотворює результат дослідження. Аналогом пропонованого способу є методика, що була впроваджена Інструкцією Міністерства охорони здоров'я СРСР в 1968 році №739-68 [1], згідно з якою, нейтралізація дії дезінфекційного засобу виконується на клаптиках батисту («тест-об'єктах») з попередньо сорбованими на них бактеріями. Після занурення в розчин дезінфекційного засобу тест-об'єкти відмиваються від нього послідовним зануренням в 2 пробірки з водою або з розчином одної з речовин-«нейтралізаторів»: 0,5-1,0% тіосульфат у натрію, сульфазолу, або універсального нейтралізатора в складі твін-80, сапоніну, гістидину і цистеїну та інших. Після нейтралізації виконується висів у рідке поживне середовище. Такий ступінчастий метод відображає не пряму дію дезінфекційного засобу на бактерії, а на їх в стані іммобілізації на батисті, до того ж супроводжується неконтрольованими і неминучими втратами залишку бактерій при відмиванні, накопичує похибки вимірів, складний у виконанні і вимагає значних витрат часу і супутніх матеріалів. Він не придатний для точного виміру величини залишку бактерій після дії дезінфекційного засобу, як основного критерію його специфічної активності. Другим аналогом пропонованого способу є наведені в Методичних рекомендаціях «Визначення чутливості/стійкості мікроорганізмів до дезінфікуючих засобів», затверджених МОЗ України 2008 р. [2] «розгорнуті» і «прискорені» методики, за якими реакційна суміш складалася з розведень дезінфекційного засобу з суспензією бактерій в об'ємі 10 мл. Після часу взаємодії дезінфекційного засобу з бактеріями, з реакційної суміші відбиралось по 0,5 мл і суспендувалось у 9,5 мл розчину нейтралізатора, а звідти забиралось 0,5 мл і суспендувалось у 9,5 мл фізіологічного розчину, щоб відмити нейтралізатор. Лише після цього виконувався посів 1 мл на 10 мл рідкого поживного середовища і 0,1 мл на чашку з твердим середовищем. Недоліком наведеної методики є необхідність 10-разових додаткових розведень в розчинах нейтралізатора та у фізіологічному розчині, завдяки чому лише 1/1000 або 1/10000 частка йшла на посів. Тому виходить, що метод даватиме помилкову позитивну оцінку активності, якщо в залишку буде трохи менше 1000 бактерій на кожні 0,5 мл реакційної суміші, що зменшує чутливість визначення у відповідне число разів. Для виконання методики поряд з необхідними витратами матеріалів для реакційної суміші додатково потрібно ще вдвічі більші витрачати матеріалів і часу для нейтралізації та відмивання. Все це поряд з браком точності робить методику громіздкою і високо затратною на матеріали і робочий час. Найближчим аналогом пропонованого способу є наведена в Методичних рекомендаціях «Визначення чутливості/стійкості мікроорганізмів до дезінфікуючих засобів», затверджених МОЗ України 2008 р. [2] методика «Експрес дослідження», за якою реакційна суміш компонувалась з 2,5 мл водного розчину дезінфекційного засобу (50%), 2 мл м'ясо-пептонного бульйону (40 %) 9 та 0,5 мл (10 %) суспензії бактерій концентрацією 210 клітин на мл. Бульйон додавався як речовина, що містить білок, з метою випробування дезінфекційного засобу при дії так званого «білкового навантаження». Після часу взаємодії дезінфекційного засобу з бактеріями з реакційної суміші мікропіпеткою робився висів 0,02 мл на чашку з агаризованим середовищем і після 1-2 добового пророщування в термостаті визначався результат. Висів на агаризоване середовище виконувався без застосування нейтралізаторів і був розрахований на те, що малий об'єм посівного матеріалу (0,02 мл), особливо після ретельного розподілянню матеріалу по поверхні чашки, нібито припинить дію дезінфектанту і забезпечить пророщування мікробів, що залишилися живими. Недоліками способу є невиправданий і не перевірений розрахунок на припинення дії дезінфекційних засобів на агаризованих середовищах, оскільки різні дезінфектанти по-різному дифундують в агаровому середовищі (через що не вдається зробити такі паперові диски, як для антибіотиків). Другим недоліком методики є використання м'ясо-пептонного бульйону, який як «білкове навантаження» не застосовується в дезінфектологічних дослідженнях (прийнято використовувати інактивовану сироватку [1]). М'ясо-пептонний бульон не містить білка, а лише продукти його гідролізу. Недоліком методу є також над малий об'єм висіву на агаризоване середовище (0,02 мл) який складає всього 1/250 частину реакційної суміші. Тобто чутливість 1 UA 89484 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 методу вимагає щоб залишок живих бактерій складав не менше 250 клітин, інакше можна отримати помилково-позитивний результат. До недоліків методу слід віднести його оцінка авторами лише як орієнтовного, тобто такого, що після отримання результату потрібно буде знову вдаватись до повторних більш вимогливих досліджень. В основу корисної моделі поставлена задача створення способу визначення бактерицидної та бактеріостатичної концентрації дезінфекційних засобів без застосування нейтралізаторів, в якому за рахунок застосування новий дій, порядку здійснення дій та застосування нового показника для визначення бактерицидної та бактеріостатичної концентрації дезінфекційних засобів забезпечується визначення бактерицидної та бактеріостатичної концентрації дезінфекційних засобів без застосування нейтралізаторів. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб включає дослідження взаємодії дезінфекційного засобу з тест-об'єктом та оцінку наявності зросту бактерій, згідно з корисною моделлю, здійснюють багаторазові послідовні розведення дезінфекційного засобу в стерильній рідині, в кожну пробірку отриманого ряду розведень дезінфекційного засобу додають суспензію тестових бактерій, витримують суміш протягом заданого дослідженням часу, додають до кожної пробірки надлишок стерильного живильного середовища, культивують зразки протягом досліджуваного терміну, а про бактерицидну та бактеріостатичну концентрації дезінфекційного засобу судять по параметрам зразка розведення, в якому наявний зріст бактерій. Застосування такого методу дозволяє визначити бактерицидну та бактеріостатичну концентрації дезінфекційних засобів без застосування нейтралізаторів, дозволяє розмножуватись всім бактеріям, що залишились живими після дії дезінфікуючого засобу, навіть якщо це будуть поодинокі клітини. Пропонованим способом усуваються всі зазначені недоліки притаманні аналогу і найближчому у аналогу. Метод простий у виконанні, не потребує зайвих розведень, використання нейтралізаторів, їх відмивання, а також зайвих витрат часу та матеріалів. В загальному вигляді при здійсненні прикладів проблему вирішують шляхом зменшення об'ємів реакційної суміші в серійних пробіркових розведеннях до 2 мл. Після необхідного часу дії дезінфекційного засобу припинення його дії виконується додаванням в усі пробірки ряду по 12-14 мл рідкого поживного середовища, що забезпечує розведення реакційної суміші в кожній пробірці у 7-8 разів. При такому розведенні водний склад реакційної суміші практично не знижує ростових властивостей доданого рідкого поживного середовища, що вразі потреби не важко компенсувати готуванням його в більш концентрованій формі. Після розведення рідким середовищем пробірки ставлять на 1-2 доби в термостат при +37 градусів Цельсію і враховують результат по наявності або відсутності росту в пробірках. Якщо дезінфекційний засіб діє, то в перших пробірках ряду розведень росту (помутнінню) бульйону не буде і пробірки залишатимуться прозорими. В пробірці, де вижило одна чи кілька бактерій, (тобто коли в попередньому розведенні досягнуто мінімальної бактерицидної або бактеріостатичної концентрації), додані перед тим 12-14 мл поживного середовища означатимуть розведення дезінфекційного засобу ще у 7-8 разів. Через таке радикальне падіння його концентрації починається активне розмноження бактерій оскільки вони потрапляють в умови 7-8 разового розведення мінімальної бактерицидної (бактеріостатичної) концентрації дезінфекційного засобу. Застосування такого методу дозволяє розмножуватись всім бактеріям, що залишились живими після дії дезінфікуючого засобу, навіть якщо це будуть поодинокі клітини. Пропонованим способом усуваються всі зазначені недоліки притаманні аналогу і найближчому у аналогу. Метод простий у виконанні, не потребує зайвих розведень, використання нейтралізаторів, їх відмивання, а також зайвих витрат часу та матеріалів. Приклад 1 здійснення корисної моделі. Створюють серійні розведення, для чого встановлюють в штативі ряд з 8 стерильних 3 пробірок, корисною ємкістю більшою за 16 см , з ватно-марлевими корками і заливають в кожну по 2 мл стерильної водопровідної води (або 0,9% ізотонічного «фізіологічного» розчину хлориду натрію). В першу додають 2 мл робочого розчину дезінфекційного засобу, наприклад, 0,5% дезактину. Старанно перемішавши, відбирають 2 мл і переносять в другу пробірку і перемішують, потім в той же спосіб 2 мл переносять в третю і так далі до останньої. З останнього розведення 2 мл виливають. В кожну пробірку ряду, який тепер містить серійні 21 кратні розведення дезінфекційного засобу (від /2 до 1/512) додається по 0,1 мл суспензії 9 тестових бактерій, наприклад Е.соlі 1407, в максимальній концентрації, наприклад 110 клітин, і починається відлік часу. Через період, тривалість якого вимагається задачею дослідження, наприклад через 17 хвилин, дія дезінфекційного засобу припиняється додаванням до кожної пробірки надлишку (до 14 мл) стерильного м'ясо-пептонного бульйону і штатив ставиться на 1-2 доби в термостат з температурою +37 градусів Цельсію. Результат враховується по наявності 2 UA 89484 U 5 10 15 20 росту бактерій (помутнінні) бульйону, за потребою - іншими додатковими загальновідомими бактеріологічними тестами. Перші кілька пробірок залишається прозорими через стерилізуючу дію дезінфекційного засобу. Поява росту в подальших пробірках свідчить, що в них розведення дезінфекційного засобу було нижчим за мінімальну бактерицидну концентрацію, яку визначають по останній в ряду пробірці, що не мала ознак мікробного росту. Приклад 2 здійснення корисної моделі. Визначення бактеріостатичної дії. Дослідження проводиться в той же спосіб, як і в Прикладі 1, з тією різницею, що дезінфекційний засіб серійно розводиться не водою, а безбілковим рідким поживним середовищем, наприклад м'ясо-пептонним бульйоном. Серійні розведення на рідкому поживному середовищі експонують 1 добу при +37 градусів Цельсію. Відмічають пробірки які не мають ознак росту, тобто визначають мінімальну бактерицидну концентрацію за добовий інтервал часу. Після цього в усі пробірки додають 6-8 кратний надлишок рідкого поживного середовища і вміщують їх в термостат. Якщо після пророщування виявиться ріст в пробірках які були перед тим без ознак росту - значить відповідне розведення мало бактеріостатичну дію. Приклад 3 здійснення корисної моделі. Порівнюються результати оцінки дезінфекційного засобу методом рекомендованим діючою інструкцією МЗ СРСР №739-68 [1] з використанням універсального нейтралізатору (метод № 1), та способом експрес дослідження, рекомендованим методичними рекомендаціями МОЗ України 2008 р. [2] без використання нейтралізаторів (метод № 2). Для визначення переваг корисної моделі наводяться результати оцінки того ж самого дезінфекційного засобу в тому ж робочому розведені з тим же штамом Е. соlі за методом, описаним в Прикладі 1 (метод № 3) - див. таблицю 1. Таблиця 1 Порівняльна характеристика та індекс чутливості дії 0,5 % дезактину на тест-культуру кишкової палички 1245 Кратність розведення по пробірках дезінфектанту 2 4 8 16 32 64 128 512 Види досліджень Метод №1 (аналог) Наявність росту (+), відсутність (-) Метод № 1, контроль на чашках з м'ясо-пептонним агаром, кількість колоній (аналог) Метод №2 (найближчий аналог) Метод № 3 - корисна модель Індекс чутливості (ОЕ) + + + 1 4 112 220 1 + + + + + + + + 1 6 25 Примітка - Індекс чутливості методу є помножена на 100 зворотна величина кратності розведення дезінфекційного засобу, при якому починається ріст тест-бактерій. 30 35 Як показано в таблиці, корисна модель - пропонований метод, у 6 разів більш чутливий за аналоги і найближчий аналог, простіший і значно менш вимагає матеріалів і трудовитрат. Джерела інформації: 1. Инструкция по определению бактерицидных свойств новых дезинфицирующих средств. М.,1968. - № 739-68. - 108 с. 2. Визначення чутливості / стійкості мікроорганізмів до дезінфікуючих засобів (методичні рекомендації) - К.: Знання України, 2008. - 12 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 45 Спосіб визначення бактерицидної та бактеріостатичної концентрації дезінфекційних засобів без застосування нейтралізаторів, що включає дослідження взаємодії дезінфекційного засобу з тест-об'єктом та оцінку наявності росту бактерій, який відрізняється тим, що здійснюють багаторазові послідовні розведення дезінфекційного засобу в стерильній рідині, в кожну пробірку отриманого ряду розведень дезінфекційного засобу додають суспензію тестових бактерій, витримують суміш протягом заданого дослідженням часу, додають до кожної пробірки надлишок стерильного живильного середовища, культивують зразки протягом досліджуваного 3 UA 89484 U терміну, а про бактерицидну та бактеріостатичну концентрації дезінфекційного засобу судять по параметрах зразка розведення, в якому наявний ріст бактерій. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4