Спосіб зняття неспецифічного зв’язування антитіл при серологічній діагностиці віл-інфекції та гепатиту с

Реферат: Спосіб зняття неспецифічного зв'язування антитіл при серологічній діагностиці ВІЛ-інфекції та гепатиту С шляхом використання блокатора, що додають у розчини для розведення сироваток при проведенні серологічних реакцій, причому як блокатор застосовують антитіла протибактеріальних мімікринів, які мають гомологічні амінокислотні послідовності з білками вірусів імунодефіциту людини та гепатиту С. UA 91677 U (12) UA 91677 U UA 91677 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Корисна модель належить до медицини, біотехнології та імунохімії і може бути використана для зняття неспецифічного зв'язування антитіл (AT) при серологічній діагностиці вірусних інфекцій, зокрема вірусів імунодефіциту людини (ВІЛ) та гепатиту С (ВГС). В останні роки досить активно проводяться дослідження щодо вивчення антигенної мімікрії, тобто наявності у різних гомологічних чи негомологічних білкових або нуклеотидних структур ділянок, які містять тотожні послідовності амінокислот. Антигенна мімікрія найчастіше пов'язана з подібністю лінійної або конформаційної структури вірусних або бактеріальних антигенів і клітин макроорганізму, в результаті чого AT із сироваток крові взаємодіють перехресно з ними, що призводить до виникнення хибних результатів при проведенні аналізів серологічними методами. Існує декілька блокаторів, такі як знежирене молоко, альбумін великої рогатої худоби, тритон Х-100, які додаються в розчини для розведення сироваток при проведенні серологічних реакцій [Guide of Solid Phase Immunoassays / Rowell V., ed. - Nunc Brand Products 1999. - 149 p.; Гураль А.Л. Серологічна діагностика ВІЛ-інфекції. Практичний посібник / Гураль А.Л., Іванська Н.В., Кислих О.М. та ін./ під ред. Гураля А.Л. - К.: ДМП "Полімед". - 2004. - 58 с.]. Найближчим до корисної моделі, що заявляється, є спосіб діагностики ВІЛ-інфекції, згідно з яким в тест-системах для діагностики ВІЛ-інфекції як блокатор використовують сироватку великої рогатої худоби (ВРХ) [Інструкція по виготовленню тест-системи для діагностики ВІЛінфекції. НВК "Діапроф-Мед". - 2010]. Проте цей блокатор. Як і попередні аналоги, не завжди допомагає при наявності в сироватках, що досліджуються, перехресно реагуючих антитіл. В основу корисної моделі поставлено задачу створення способу зняття неспецифічного зв'язування антитіл при серологічній діагностиці ВІЛ-інфекції та гепатиту С за допомогою зміни блокатора. Поставлену задачу вирішують тим, що у способі зняття неспецифічного зв'язування антитіл при серологічній діагностиці ВІЛ-інфекції та гепатиту С шляхом використання блокатора, який додають у розчини для розведення сироваток при проведенні серологічних реакцій, згідно з корисною моделлю, як блокатор застосовують антитіла протибактеріальних мімікринів, що мають гомологічні амінокислотні послідовності з білками вірусів імунодефіциту людини та гепатиту С. Спосіб дає можливість зняти неспецифічне зв'язування перехресно реагуючих антитіл шляхом використання блокатора з антитілами проти бактеріальних мімікринів, що мають гомологічні амінокислотні послідовності з білками ВІЛ і ВГС, і додавання цього блокатора в розчин для розведення сироваток. Корисна модель пояснюється прикладами. Приклад 1 Для отримання блокатора імунізували кролів внутришньобульбарно мімікринами із Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Mycobacterium tuberculosis і Candida albicans, які одержували з культурального середовища після культивування бактерій. Сироватку крові кроля тестували на наявність AT до мімікринів імуноферментним методом. Титр анти-мімікринових AT становив від 1:100 до 1:1000. Були проведені дослідження по зниженню зв'язування перехресно реагуючих AT із хибно-позитивних сироваток (ХПС) з рекомбінантними білками ВІЛ за допомогою AT з кролячих анти-мімікринових сироваток. В таблиці 1 наведено результати визначення таких досліджень за показниками оптичної густини (ОГ), отриманими при проведенні імуноферментного аналізу (ІФА). 45 1 UA 91677 U Таблиця 1 Результати впливу анти-мімікринових АТ на взаємодію AT із ХПС з білками ВІЛ Білки ВІЛ Gp160 Env Gag Env+Gag ОГ сер Анти-ВІЛ AT + сироватка ВРХ ОГ 0,391 1,442 1,463 1,295 1,013 ОГ 0,322 1,003 0,985 1,208 0,709 Анти-ВІЛ AT + анти-мімікринові AT з сироваток 1 2 3 4 % нейтр ОГ % нейтр ОГ % нейтр ОГ % нейтр 17,7 0,365 6,7 0,376 3,9 0,370 5,4 30,5 0,654 54,7 0,504 35,0 1,045 27,5 32,7 0,823 43,8 0,735 49,5 1,296 11,4 6,7 1,068 17,5 1,200 7,3 1,005 22,4 24,3 0,572 36,0 0,485 41,8 0,622 37,4 Примітка. Сироватки: 1 - проти мімікрину із Bacillus subtilis, 2 - проти мімікрину із Mycobacterium tuberculosis, 3 - проти мімікрину із Staphylococcus aureus та 4 - проти мімікрину із Candida albicans. % нейтр - відсоток нейтралізації перехресно реагуючих AT. 5 10 За даними, наведеними в таблиці 1, анти-мімікринові AT частково знижують значення оптичної густини (ОГ) зразків, що свідчить про їхню взаємодію з антитілами із ХПС. Так, AT з сироватки № 1 проти мімікрину з Bacillus subtilis знижує значення ОГсер на 24,3 %, сироватки № 2 проти мімікрину із Staphylococcus aureus - на 36 %, сироватки № 3 проти мімікрину з Mycobacterium tuberculosis - на 41,8 % і сироватки № 4 проти мімікрину з Candida albicans - на 37,4 %. Це свідчить про те, що анти-мімікринові антитіла здатні блокувати неспецифічне зв'язування антитіл із ХПС з білками ВІЛ. Вплив анти-мімікринових сироваток на зміну значень ОГ в ХПС від вагітних жінок наведено в таблиці 2. Таблиця 2 Вплив анти-мімікринових сироваток на значення ОГ ХПС від вагітних при діагностиці ВІЛ-інфекції № ХПС 38 41 56 64 81 83 85 182 сер Анти-ВІЛ** ОГ 0,407 1,871 0,820 1,802 0,717 2,328 0,753 0,494 1,149 ОГ 0,283 0,142 0,187 0,200 0,206 0,716 0,139 0,138 0,251 Анти-ВІЛ АТ + анти-мімікринова сироватка №1 №2 №3 % нейтр ОГ % нейтр ОГ % нейтр 31 0,135 67 0,133 67 92 0,160 91 0,115 94 77 0,073 91 0,142 83 89 0,111 94 0,143 92 72 0,230 68 1,250 -74 69 0,874 63 0,875 63 82 0,104 86 0,153 80 72 0,212 57 0,175 65 78 0,237 79 0,373 68 Примітка. Сироватки: 1 - проти мімікрину із Staphylococcus aureus, сироватки № 2 - проти мімікрину із Mycobacterium tuberculosis і сироватки № 3 проти мімікрину із Candida albicans **Анти-ВІЛ - специфічна сироватка проти ВІЛ з додаванням сироватки ВРХ. 15 У більшості ХПС від вагітних відбувається зміна значень ОГ, що свідчить про їхню взаємодію з анти-мімікриновими AT (нейтралізація в середньому - 68-79 %). Такі ж результати отримано при блокуванні перехресної взаємодії антитіл із ХПС від хворих на туберкульоз (таблиця 3). 2 UA 91677 U Таблиця 3 Вплив анти-мімікринових AT на значення ОГ ХПС від хворих на туберкульоз № ХПС 2 5 7 10 12 20 21 сер Анти-ВІЛ** ОГ 0,195 0,375 0,315 0,422 0,247 0,765 0,315 0,376 №1 ОГ 0,158 0,223 0,228 0,242 0,160 0,378 0,124 0,216 Анти-ВІЛ АТ+ анти-мімікринові сироватки* №2 №4 % нейтр ОГ % нейтр ОГ % нейтр 19,0 0,132 32,4 0,125 35,9 40,6 0,198 47,2 0,167 55,5 27,7 0,156 50,5 0,147 53,4 42,7 0,180 57,4 0,150 64,5 35,3 0,098 40,3 0,057 77,0 50,4 0,221 71,2 0,162 78,9 40,7 0,167 47,0 0,135 57,2 42,6 0,164 56,4 0,135 64,1 Примітка. *Сироватки: 1 - проти мімікрину із Staphylococcus aureus, сироватки № 2 - проти мімікрину із Mycobacterium tuberculosis і сироватки № 3 проти мімікрину із Candida albicans **Анти-ВІЛ - специфічна сироватка проти ВІЛ 5 За результатами досліджень, представлених в таблиці 3, показник блокування перехресної взаємодії антитіл, що взаємодіють з білками ВІЛ в сироватках від хворих на туберкульоз, становив від 42,6 до 64,1 %. У той же час значення ОГ для ВІЛ-позитивної сироватки № 3 при внесенні цих антитіл збільшувались з 0,991 до 2,0 оптичних одиниць (о.о.) Приклад 2. Вплив анти-мімікринових AT на перехресно реагуючи AT в ХПС при діагностиці гепатиту С наведено в таблиці 4. 10 Таблиця 4 Вплив анти-мімікринових сироваток на значення ОГ ХПС від вагітних при діагностиці гепатиту С № ХПС 1 2 3 4 5 6 7 8 сер Анти-ВГС** ОГ 0,623 0,842 0,423 1,322 0,711 0,328 0,453 0,794 0,687 ОГ 0,183 0,164 0,107 0,200 0,145 0,116 0,139 0,238 0,161 Анти-ВГС АТ + анти-мімікринова сироватка* №1 №2 №3 % нейтр ОГ % нейтр ОГ % нейтр 70,7 0,235 62,3 0,133 67 80,5 0,196 76,7 0,115 94 74,7 0,173 59,1 0,142 83 84,9 0,162 98,0 0,143 92 79,6 0,230 67,7 1,250 -74 64,6 0,174 47,0 0,875 63 69,4 0,154 66,1 0,153 80 71,1 0,112 85,9 0,175 65 74,4 0,176 79 0,373 68 Примітка. *Сироватки: 1 - проти мімікрину із Staphylococcus aureus, № 2 - проти мімікрину із Mycobacterium tuberculosis і № 3 проти мімікрину із Candida albicans ** Специфічна сироватка проти вірусу гепатиту С (ВГС) з додаванням сироватки ВРХ 15 За результатами досліджень, представлених в таблиці 4, показник блокування перехресної взаємодії AT, що взаємодіють з білками ВГС в сироватках від вагітних, становив від 68 до 79 %. Таким чином, "неспецифічну" взаємодію AT в ХПС частково можливо знижувати за допомогою блокування сайтів зв'язування додаванням до досліджуваних сироваток антимімікринових AT. 3 UA 91677 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб зняття неспецифічного зв'язування антитіл при серологічній діагностиці ВІЛ-інфекції та гепатиту С шляхом використання блокатора, що додають у розчини для розведення сироваток при проведенні серологічних реакцій, який відрізняється тим, що як блокатор застосовують антитіла протибактеріальних мімікринів, які мають гомологічні амінокислотні послідовності з білками вірусів імунодефіциту людини та гепатиту С. Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4