Ефективні олігонуклеотиди lna для інгібування експресії hif-1a

1. Олігонуклеотид LNA, що складається з послідовності, яка являє собою 5'TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3' (SEQ ID № 1), де заголовними буквами позначений аналог нуклеотиду бета-D-окси-LNA, малими буквами позначений 2-дезоксинуклеотид, підрядковим індексом "s" позначений фосфоротіоатний зв'язок між сусідніми нуклеотидами/аналогами нуклеотиду LNA. UA (21) a200706383 (22) 09.11.2005 (24) 25.01.2011 (86) PCT/DK2005/000721, 09.11.2005 (31) 60/626,563 (32) 09.11.2004 (33) US (31) 60/647,186 (32) 25.01.2005 (33) US (31) 60/699,721 (32) 15.07.2005 (33) US (31) 60/724,621 (32) 07.10.2005 (33) US (46) 25.01.2011, Бюл.№ 2, 2011 р. (72) РАСМУССЕН ФРАНК ВІНТЕР, DK, ВЕСТЕРГОР МАЙКЕН, DK, ХАНСЕН ХЕНРІК ФРЮДЕНЛУНД, DK, ТРУ ШАРЛОТ АЛЬБЕК, DK (73) САНТАРІС ФАРМА А/С, DK (56) WO03085110 A, 16.10.03. US2004220393 A, 04.11.04. WO2004042024 A, 21.05.04. SHATROV V.A. ET AL.: "Oxidized low-density lipoprotein (oxLDL) triggers hypoxia-inducible factor1alpha (HIF-1alpha) accumulation via redoxdependent mechanism" BLOOD, vol. 101, no. 12, 15 June 2003 (2003-06-15), pages 4847-4971. PAUL S.A.M. ET AL.: "HIF at the crossroads between ischemia and carcinogenesis" JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY, vol. 200, no. 1, July 2004 (2004-07), pages 20-30. POULAKI V. ET AL.: "Insulin-like growth factor-I plays a pathogenetic role in diabetic retinopathy" AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY, vol. 165, no. 2, August 2004 (2004-08), pages 457-469. DISTLER J.H.W. ET AL.: "Physiologic response to hypoxia and implications for hypoxia-inducible factors 2 (19) 1 3 93188 4 2. Кон'югат, який містить олігонуклеотид LNA за п. 1 і щонайменше одну ненуклеотидну або неполінуклеотидну молекулу, ковалентно зв'язану з вказаним олігонуклеотидом LNA. 3. Фармацевтична композиція, яка містить олігонуклеотид LNA, як визначено в п. 1, або кон'югат, як визначено в п. 2, і фармацевтично прийнятний розріджувач, носій або ад'ювант. 4. Фармацевтична композиція за п. 3, яка містить водний носій, що складається з буфера для підтримки значення рН в діапазоні 4,0-8,5, і що має іонну силу 20-2000 мМ. 5. Фармацевтична композиція за п. 3 або 4, яка адаптована для внутрішньоочного введення. 6. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 3-5, яка додатково містить щонайменше один хіміотерапевтичний агент. 7. Спосіб (і) лікування захворювання, вибраного з групи, яка складається з раку, атеросклерозу, псоріазу, діабетичної ретинопатії, дегенерації жовтої плями, ревматоїдного артриту, астми, запального захворювання кишечнику, бородавок, алергічного дерматиту, запалення і шкірного запалення; або (іі) лікування ссавця, що страждає від або схильного до захворювання, викликаного аномальним ангіогенезом; або (ііi) інгібування ангеогенезу; або (iv) індукції клітинного апоптозу; або (v) попередження клітинної проліферації; або (vi) лікування ангіогенного захворювання, при якому інгібується ангіогенез, викликаний ангіогенним захворюванням, де вказаний спосіб включає введення в організм пацієнта, що потребує цього, олігонуклеотиду LNA, як визначено в п. 1, або кон'югата, як визначено в пункті 2, або фармацевтичної композиції, як визначено в будь-якому з пп. 3-6. 8. Спосіб за п. 7, де захворювання являє собою рак, вибраний з групи, яка складається з гепатоми, раку області голови та шиї, множинної мієломи, раку нирки, раку шийки матки, раку товстої кишки, раку головного мозку та раку молочної залози. 9. Спосіб за п. 7, де спосіб призначений для лікування ангіогенного захворювання, вибраного з групи, яка складається з діабетичної ретинопатії, дегенерації жовтої плями та запальних захворювань. 10. Спосіб за п. 9, де ангіогенним захворюванням є запальне захворювання, вибране з запального захворювання кишечнику, псоріазу та ревматоїдного артриту. Даний винахід належить до композицій і способів для модулювання експресії HIF-1α. Зокрема, даний винахід належить до олігонуклеотидів LNA, які специфічно гібридизуються з нуклеїновими кислотами, що кодують HIF-1α. Олігонуклеотиди LNA виявляють здатність модулювати експресію HIF-1α і розкриті їх фармацевтичні препарати і їх застосування при лікуванні онкологічних захворювань, запальних захворювань і очних захворювань. Для росту солідних пухлин понад декілька міліметрів необхідний розвиток кровопостачання і посилення метаболізму глюкози. Центральним питанням біології раку є визначення того, як солідні пухлини сприймають гіпоксію і відповідають за допомогою активування індукованих гіпоксією генів і секретуванням ангіогенних факторів для утворення кровоносної системи. Багато які пухлини містять гіпоксичні мікрооточння, які пов'язані з прогресуванням злоякісного процесу, метастазами і стійкістю до променевої терапії і хіміотерапії. Відкриття індукованого гіпоксією фактора - 1 (HIF-1) сприяло розумінню регуляції генів, індукованих гіпоксією (патент США US 5882914 і WO 96/39426; WO 99/48916). HIF-1 складається з двох субодиниць HIF-1α (HIF-1 альфа; позначувана тут як «HIF-1α») і HIF-1β, і зв'язує елементи, чутливі до гіпоксії (HRE) в енхансерах генів, що кодують такі ангіогенні фактори, як VEGF і білки, пов'язані з гліколізом, наприклад гліколітичні ферменти і переносник глюкози 1 і 3 (GLU-1 і 3). Показано, що сконструйований супресуючий ефект HIF-1α за допомогою передачі всередину пухлини гена антисмислової HIF-1α плазміди приводить до пригнічення VEGA і зменшення щільності судин в пухлині (WO 00/76497, Sun X et аl., Gene Therapy (2001) 8, 638-645). Дана плазміда містила фрагмент кДНК довжиною 320п.н., який кодує 5'-кінець HIF-1α (нуклеотиди 152-454; Genebank AF003698). У міжнародній публікації WO 2003/085110 описані антисмислові олігонуклеотиди LNA, які здійснюють супресуючий ефект на експресію HIF-1α людини. Одна сполука позначена CUR813 (SEQ ID №11). У даному винаході розкриті олігонуклеотиди LNA, які є більш ефективними, ніж CUR813 (SEQ ID №11). Також, згідно з даним винаходом, конкретні олігонуклеотиди LNA індукують апоптоз і інгібують проліферацію. Також, олігонуклеотди LNA, що мають послідовності, ідентичні на 100% послідовності HIF-1α миші, здійснюють супресуючий ефект на експресію HIF-1α в печінці, кишечнику і нирках миші. Даний винахід забезпечує композиції і способи модулювання експресії HIF-1α. Зокрема, даний винахід належить до олігонуклеотидів LNA, націлених на 2 специфічних мотиви HIF-1α. Ці мотиви розкриті як послідовності SEQ ID №№3 і 4. Зокрема переважними олігонуклеотидами LNA є SEQ ID №1 і SEQ ID №2. Нуклеотиди LNA за даним винаходом є ефективними інгібіторами експресії мРНК HIF-1α і рівнів білка. Конкретніше, даний винахід забезпечує олігонуклеотид LNA, що складається з послідовності, вибраної з групи, яка складається з 5 5'-(Tx)GxGxcsasasgscsastscscsTxGx(T)-3' (SEQ ID №3) і 5'-(Gx)TxTxascstsgscscststscsTxTx(A)-3' (SEQ ID №4), де заголовними буквами позначений аналог нуклеотиду бета-D-окси-LNA, малими буквами позначений 2-дезоксинуклеотид, підкресленням позначений або аналог нуклеотиду бета-D-оксиLNA, або 2-дезоксинуклеотид, підрядковим індексом «s» позначений фосфоротіоатний зв’язок між сусідніми нуклеотидами/аналогами нуклеотиду LNA, і підрядковим індексом «х» позначений або фосфоротіоатний зв'язок, або фосфодіефірний зв'язок між сусідніми нуклеотидами/аналогами нуклеотиду LNA, і де нуклеотидні одиниці в дужках (Тх), (Т) або (Gx), (А), відповідно, являють собою необов'язкові одиниці, і де послідовність при бажанні збільшена за допомогою додавання до п'яти 2дезоксинуклеотидних одиниць. Також забезпечені фармацевтичні композиції, які містять олігонуклеотиди LNA за даним винаходом. Додатково забезпечені способи модулювання експресії HIF-1α в клітинах або тканинах, які включають контактування вказаних клітин або тканин з одним або декількома олігонуклеотидами LNA або композиціями за даним винаходом. Також розкриті способи лікування тварини або людини, у якої підозрюють наявність або схильність до захворювання або стану, пов'язаного з експресією HIF-1α, за допомогою введення терапевтично або профілактично ефективної кількості одного або декількох олігонуклеотидів LNA або композицій за даним винаходом. Крім того, забезпечені способи застосування олігонуклеотидів LNA для інгібування експресії HIF-1α і для лікування захворювань, пов'язаних з активністю HIF-1α. На Фіг.1А показана підвищена стабільність послідовності SEQ ID №1 і SEQ ID №5 в плазмі крові щура (самці NtacSD, Li-гепарин (Taconic, M&B)), в порівнянні з послідовністю SEQ ID №6. Олігонуклеотиди в концентраціях 20мкМ інкубували при 37°С протягом 0, 4, або 24 годин. Ніяких фрагментів деградації послідовності SEQ ID №1 не виявлено навіть після 24 годин розщеплення. На Фіг.1В показана стабільність повнорозмірної послідовності SEQ ID №1 і послідовності SEQ ID №13, яка є фосфоротіоатною і ізопослідовною послідовності SEQ ID №1, в плазмі крові щура і людини. Олігонуклеотиди додавали в плазму кров людини або щура в кінцевій концентрації 20мкМ. На даній фігурі представлена стабільність олігонуклеотиду LNA аж до 1-96 годин, в плазмі крові людини і щура, відповідно, при 37°С. Для плазми крові щура, на другій панелі Фіг.1В показана стабільна активність ферменту навіть після 48 годин і 96 годин. Друга панель виконує функцію негативного контролю і демонструє відсутність деградації послідовностей SEQ ID №1 і SEQ ID №13 при інкубуванні при 37°С без додавання плазми крові. На Фіг.1С представлена надзвичайно тривала стабільність послідовності SEQ ID №1 в плазмі крові людини і щура. Олігонуклеотид інкубували в плазмі крові людини або щура протягом 1-96 го 93188 6 дин, і піддавали електрофорезу в денатуруючому гелі. Після фарбування за допомогою SyBr gold визначали кількість повнорозмірного продукту з використанням фосфорімаджера, і зображували залежність від часу. На Фіг.2А показаний супресуючий ефект на білок HIF-1α в клітинах U373, трансфекованих олігонуклеотидами LNA. Клітини U373 трансфекували з використанням 2 або 10нМ сполуки або трансфекували плацебо, інкубували в умовах гіпоксії, і за допомогою вестерн-блотингу проводили аналіз супресуючого ефекту на білок HIF-1α. Як контроль рівного навантаження аналізували експресію тубуліну. На Фіг.2В представлений супресуючий ефект на білок HIF-1 альфа після обробки послідовністю SEQ ID №1 в клітинних лініях гліобластоми U373. Як контроль рівного навантаження аналізували експресію пан-актину. Клітини трансфекували 0, 2, 1 і 10нМ послідовності SEQ ID №1, або послідовності SEQ ID №10, яка на 2п.о. відмінна від SEQ ID №1. На нижній панелі представлена кількісна оцінка гелю. На Фіг.2С представлений супресуючий ефект на експресію HIF-1α через 24 години після обробки олігонуклеотидом LNA, націленим на HIF-1α, SEQ ID №1, і LNA, яка містить змішаний контрольний олігонуклеотид SEQ ID №8, в клітинах U373. Експресію HIF порівнювали або з GAPDH, або з бетаактином і відповідним нетрансфекованим контролем (плацебо). Після очищення РНК, експресію мРНК кількісно визначали за допомогою QPCR. На Фіг.3А і 3В показана індукція апоптозу, визначена як кінетичний параметр індукованої активності каспази 3/7 після 24-72 годин обробки олігонуклеотидами LNA клітинної лінії гліобластоми U373 в умовах з нормальним вмістом кисню або гіпоксії. Показано, що послідовність SEQ ID №1 є ефективним індуктором раннього апоптозу. Фіг.4А: індукція ранньої стадії апоптозу клітин, виміряна за допомогою аналізу проточної цитометрії анексин V-FITC і РІ через 48 годин. Клітини U373, оброблені олігонуклеотидом LNA SEQ ID №1, класифікували як більш «ранні апоптотичні» в порівнянні з клітинами, обробленими плацебо і SEQ ID №12. ФІГ.4В: кількісне визначення індукції раннього апоптозу в клітинах U373 після обробки послідовністю SEQ ID №1. Процентний вміст клітин, залучених в ранній апоптоз після 48 годин обробки послідовністю SEQ ID №1 в різних дозах. Клітини U373 трансфекували послідовністю SEQ ID №1 або двома різними змішаними контрольними олігонуклеотидами SEQ ID №8 і SEQ ID №12. Після збору і інкубування з анексином V аb і РІ кількість клітин в ранньому апоптозі визначали за допомогою методу проточної цитометрії. На Фіг.5А і 5В представлені сполуки, які трансфекували клітинні лінії гліобластоми U373, через 24-72 години після трансфекції і інкубування або в умовах гіпоксії, або в умовах нормоксії. Показано, що послідовність SEQ ID №1 є ефективним інгібітором проліферації, як визначено в аналізі MTS. На Фіг.6А і 6В показаний ендогенний направлений супресуючий ефект двох режимів введення 7 послідовності SEQ ID №1 в печінці in vivo. Визначення рівнів мРНК НІF-1α, а також даунстрим (що знаходиться в 5'-3' напрямі) мішені, VEGF, показує, що послідовність SEQ ID №1 також є ефективним інгібітором вказаної мішені. Фіг.6А: щоденні внутрішньочеревинні ін'єкції мишам hairy протягом 14 днів. Фіг.6В: внутрішньочеревинні ін'єкції мишам hairy два рази на тиждень протягом 14 днів. На Фіг.6С представлений in vivo супресуючий ефект на ендогенний HIF-1α нирок після введення мишам hairy послідовності SEQ ID №1 за допомогою щоденних внутрішньочеревинних ін'єкцій протягом 14 днів. На Фіг.7А показано, що послідовність SEQ ID №1 є ефективним інгібітором, що визначено за супресуючим ефектом на експресію in vivo HIF-1α в печінці, після введення послідовності SEQ ID №1. Різні тіоловані варіанти послідовності SEQ ID №1 (SEQ ID №5 і SEQ ID №6) і послідовність SEQ ID №ι, відповідно, вводили мишам hairy в дозі 18 або 3,6мг/кг, щодня протягом 14 днів, потім тварин умертвляли. Експресію HIF-1α визначали за рівнем мРНК за допомогою QPCR і нормалізували до бета-актину, як описано в М&М. На Фіг.7В показано, що послідовність SEQ ID №1 також є ефективним інгібітором, що визначено за супресуючим ефектом на експресію HIF-1α in vivo в печінці, після введення послідовності SEQ ID №1. Різні тіоловані варіанти послідовності SEQ ID №1 (SEQ ID №5 і SEQ ID №6) і послідовність SEQ ID №і, відповідно, вводили мишам hairy в дозі 50, 10 або 2мг/кг, два рази на тиждень протягом 14 днів, потім тварин умертвляли. Експресію HIF-1α визначали за рівнем мРНК за допомогою QPCR і нормалізували до бета-актину. На Фіг.7С представлений супресуючий ефект на експресію HIF-1α in vivo в нирках, після введення послідовності SEQ ID №1. Різні тіоловані варіанти послідовності SEQ ID №1 (SEQ ID №5 і SEQ ID №6) і послідовність SEQ ID №1, відповідно, вводили мишам hairy в дозі 18 або 3,6мг/кг, щодня протягом 14 днів, потім тварин умертвляли. Експресію HIF-1α визначали за рівнем мРНК за допомогою QPCR і нормалізували до бета-актину. На Фіг.8А показана перевага ефективності in vivo при використанні послідовності SEQ ID №1 в порівнянні з послідовностями SEQ ID №11 і SEQ ID №12 (змішаний контроль), визначена за масою пухлин U373 в ксенотрансплантаті. Послідовності SEQ ID №1, SEQ ID №11 і SEQ ID №12 вводили два рази на тиждень протягом одного тижня в дозі 50мг/кг в ксенотрансплантат U373 миші, імплантований в яєчники. Через 2 дні після введення останньої дози тварин умертвляли. При умертвінні пухлини зважували, до індивідуальної пухлинної маси додавали середню пухлинну масу (червоний), обчислювали і наносили на діаграму. Статистично значуща відмінність (Р=0,005) виявлена між контрольною групою (змішаний контроль SEQ ID №12) і мишами, обробленими послідовністю SEQ ID №1. На Фіг.8В показана щільність судин в пухлинах U373 в ксенотрансплантаті, обробленому послідовністю SEQ ID №1. Послідовність SEQ ID №1 вводили в дозі 50мг/кг два рази на тиждень протягом 93188 8 одного тижня в ксенотрансплантат U373 миші, імплантований в яєчники. Через 2 дні після введення останньої дози тварин умертвляли. Щільність судин обчислювали після CD31 фарбування і визначали співвідношення із загальною площею. Статистично значуща відмінність (Р=0,005) виявлена між групою, обробленою фізіологічним розчином, і мишами, обробленими змішаним контролем (SEQ ID №12). На Фіг.8С показане CD31 фарбування зрізів пухлин U373, імплантованих в яєчники, і оброблених послідовністю SEQ ID №1, як описано для Фіг.8В. На Фіг.8D представлена експресія HIF-1α, кількісно визначена за допомогою ПЛР в режимі реального часу і нормалізована до GAPDH, в пухлинах U373, імплантованих в яєчники і оброблених послідовностями SEQ ID №1, SEQ ID №11, SEQ ID №12 і PBS, як описано для Фіг.8В. На Фіг.9А показане поглинання in vivo (в мкг на грам тканини) і направлений супресуючий ефект (% інгібування експресії мРНК HIF-1α, співвіднесений з експресією β-актину) у мишей hairy після одного внутрішньовенного введення послідовності SEQ ID №1 в дозі 25мг/кг. Час напівжиття послідовності SEQ ID №1 складає приблизно 46 годин в нирках і 66 годин в печінці. На верхній панелі Фіг.9В показана сполука по послідовності SEQ ID №1, введена мишам hairy в дозі 50мг/кг внутрішньочеревинно однократно. П'ять тварин, оброблених послідовністю SEQ ID №1 в дозуванні 50мг/кг, умертвляли через 1, 3, 4, 5 і 8 днів після обробки, експресію HIF-1α аналізували і нормалізували до бета-актину. Експресію HIF-1α визначали за рівнем мРНК за допомогою QPCR і нормалізували до бета-актину, як описано в прикладі 8. На нижній панелі показане введення мишам hairy послідовності SEQ ID №1 в дозах 25 або 50мг/кг внутрішньовенно, однократно. П'ять тварин, оброблених послідовністю SEQ ID №1 в дозах 25 або 50мг/кг, умертвляли через 1, 2, 3, 4, 5 і 8 днів після обробки, і проводили аналіз повнорозмірної послідовності SEQ ID №1, використовуючи способи ВЕРХ, як описано в прикладі 13. Результати представлені в мкг послідовності SEQ ID №1/грам тканини. На Фіг.9С показана експресія HIF-1α, визначена кількісно за допомогою ПЛР в режимі реального часу, і приведена до GAPDH, в печінці мишей, що одержували внутрішньочеревинно однократну дозу 50мг/кг послідовності SEQ ID №1 і SEQ ID №16, і умертвлених на 1 і 10 день. На Фіг.10А показана тривалість інгібуючої дії послідовності SEQ ID №1 на експресію HIF-1α у мишей з ксенотрансплантатом, що одержували сполуку в дозі 25мг/кг протягом 7 днів, і умертвлених через 1 або 5'днів після введення останньої дози. На Фіг.10В показане поглинання fam-міченого варіанта послідовності SEQ ID №1 (SEQ ID №7) in vivo в печінці, шкірній пухлині і нирках, який вводиться в дозі 25мг/кг/день протягом семи днів, після чого тварин умертвляли через 5 днів після введення останньої дози. На Фіг.10С показаний направлений супресуючий ефект (% інгібування експресії мРНК HIF-1α, 9 співвіднесений з експресією GAPDH) і in vivo поглинання (в мкг на грам тканини) послідовності SEQ ID №7 в печінці мишей з ксенотрансплантатом, що одержували 5мг/кг/день послідовності SEQ ID №7, змішаного контролю SEQ ID №20 або фізіологічний розчин, внутрішньочеревинно, на 7, 10, 13 і 17 день після трансплантації, як описано в прикладі 17. На Фіг.10D показаний направлений супресуючий ефект (% інгібування експресії мРНК HIF-1α співвіднесений з експресією β-актину), після обробки послідовністю SEQ ID №7 або змішаним контролем SEQ ID №20, і in vivo поглинання (в мкг на грам тканини) послідовності SEQ ID №7, в товстій кишці мишей, оброблених, як описано в прикладі 17. На Фіг.10Е показане поглинання послідовності SEQ ID №7 in vivo (в мкг на грам тканини) в ксенотрансплантатах пухлин НТ29 і РС3, оброблених як описано в прикладі 17. На Фіг.11 показаний in vivo направлений ендогенний супресуючий ефект на мРНК HIF-1α і VEGF в печінці, після введення кожний 3-ій день 5 доз по 30мг/кг послідовності SEQ ID №1, в порівнянні з одним несумісним контролем SEQ ID №9. На Фіг.12А, Фіг.12В, Фіг.12С і Фіг.12D показана експресія VEGFA і ММР-2 в клітинах U373 після обробки націленим на HIF-1α олігонуклеотидом LNA, послідовністю SEQ ID №1, і змішаним контролем SEQ ID №8. Дозозалежний супресуючий ефект на експресію VEGFA і ММР-2 (секреція) в клітинах U373 спостерігали через 48 годин після обробки послідовністю SEQ ID №1 або змішаним контролем (SEQ ID №8). Експресія VEGFA (Фіг.12А, 12В і 12С) і ММР-2 (Фіг.12D і 12Е) пов'язана з кількістю клітин і співвіднесена з плацебо. На Фіг.12А, 12С і 12D експресія VEGFA і ММР-2 виміряна через 48 годин після обробки, тоді як на Фіг.12В і 12Е секреція VEGFA і ММР-2 кількісно визначена через 24-120 годин після трансфекції. На Фіг.13 показаний супресуючий ефект на білок HIF-1α, визначений за допомогою вестернблотингу, і порушення утворення трубок в клітинах HUVEC, оброблених послідовністю SEQ ID №1 в дозі 1 і 5нМ в порівнянні з послідовністю SEQ ID №8 і необробленим контролем. На Фіг.14А представлені радіолюмінограми всього тіла, що демонструють розподіл радіоактивності через 5 хвилин а), 4 години b), 24 години с) і 18 днів d) після однократного внутрішньовенного введення 3H-міченої послідовності SEQ ID №1 у самиць пігментованих мишей. На Фіг.14В представлений розподіл радіоактивності через 5 хвилин і 7 днів, і показано, що дуже сильне утримання 3H-міченої послідовності SEQ ID №1 виявлене через 7 днів в кістковому мозку, нирках, печінці, легенях, шкірі, селезінці, сечі, слизовій оболонці шлунка, лімфатичному вузлі, судинній оболонці ока і матці. На Фіг.15 представлене поглинання FAMміченого варіанта послідовності SEQ ID №1 (SEQ ID №7) різними типами клітин в кістковому мозку, селезінці і периферичній крові через 1 годину після введення послідовності SEQ ID №7, в порів 93188 10 нянні з необробленими клітинами, виміряне за допомогою аналізу FACS. На Фіг.16А показана експресія HIF-1α, визначена за допомогою ПЛР в режимі реального часу і приведена до 18S РНК, в печінці і нирках людиноподібних мавп, оброблених 40, 10 і 6мг/кг послідовності SEQ ID №1 два рази на тиждень протягом 4 тижнів. На Фіг.16В показане поглинання послідовності SEQ ID №1 в печінці і нирках людиноподібних мавп, через один день після введення останньої дози, або через 4 тижні після введення останньої дози (тварини, що видужали), оброблених як описано вище, разом з даними про тварин (R), що видужали, яких залишили без обробки протягом 4 тижнів після закінчення лікування. У даному винаході використовуються специфічні олігонуклеотиди LNA, а саме олігонуклеотиди LNA, що містять послідовність SEQ ID №3 і SEQ ID №4, для модулювання функції молекул нуклеїнових кислот, які кодують HIF-1α. Модулювання, в результаті, являє собою зміну кількості виробленого HIF-1α. У одному варіанті здійснення це досягається за допомогою забезпечення антисмислових олігонуклеотидів LNA, які специфічно гібридизуються з нуклеїновими кислотами, що кодують HIF-1α. Дане модулювання переважно являє собою інгібування експресії HIF-1α, що приводить до зменшення кількості функціональних білків HIF-1α, що виробляються. Олігонуклеотиди LNA Конкретніше, даний винахід забезпечує олігонуклеотид LNA, що складається з послідовності, вибраної з групи, яка складається з 5'-(Tx)GxGxcsasasgscsastscscsTxGx(T)-3' (SEQ ID №з) і 5'-(Gx)TxTxascstsgscscststscsTxTx(A)-3' (SEQ ID №4), де заголовними буквами позначений аналог нуклеотиду бета-D-окси-LNA, малими буквами позначений 2-дезоксинуклеотид, підкресленням позначений або аналог нуклеотиду бета-D-оксиLNA, або 2-дезоксинуклеотид, підрядковим індексом «s» позначений фосфоротіоатний зв'язок між сусідніми нуклеотидами/аналогами нуклеотиду LNA, і підрядковим індексом «х» позначений або фосфоротіоатний зв'язок, або фосфодіефірний зв'язок між сусідніми нуклеотидами/аналогами нуклеотиду LNA, і де нуклеотидні одиниці в дужках (Тх), (Т) або (Gx), (А), відповідно, являють собою необов'язкові одиниці, і де послідовність необов'язково збільшена за допомогою додавання до п'яти 2дезоксинуклеотидних одиниць. Терміни «олігонуклеотид LNA, визначений тут», «олїгонуклеотид LNA за даним винаходом», і тому подібне, належать до «олігонуклеотиду LNA», визначеного вище, а також до втілень, варіантів, проліків і тому подібного, описаних нижче. Визначені вище олігонуклеотиди LNA, засновані на послідовностях SEQ ID №3 і SEQ ID №4, мають довжину 13-20 нуклеотидних одиниць. Послідовність з мінімальною довжиною 13 нуклеотидів одержують, якщо відсутні нуклеотидні одиниці в дужках, (Тх), (Т) або (Gx), (А), відповідно, і послідо 11 вність з максимальною довжиною в 20 нуклеотидів одержують, якщо нуклеотидні одиниці в дужках (Тх), (Т) або (Gx), (А), відповідно, є в наявності, і якщо послідовність SEQ ID №3 або SEQ ID №4 збільшена на п'ять 2-дезоксинуклеотидних одиниць. У одному варіанті здійснення, нуклеотидні одиниці в дужках, (Тх), (Т) або (Gх), (А), відповідно, відсутні, і в іншому, в цей час більш переважному, варіанті здійснення, нуклеотидні одиниці в дужках, (Тх), (Т) або (Gx), (А), відповідно, є в наявності. Також представляють інтерес варіанти здійснення, в яких є в наявності 5'-кінцева необов'язкова одиниця (Тх) або (Gx), відповідно, і в яких 3'-кінцева необов'язкова одиниця (Т) або (А), відповідно, відсутня, і варіанти здійснення, в яких відсутня 5'кінцева необов'язкова одиниця (Тх) або (Gx), відповідно, і в яких 3'-кінцева необов'язкова одиниця (Т) або (А), відповідно, є в наявності. Мабуть, вибір аналога нуклеотиду бета-Dокси-LNA або 2-дезоксинуклеотиду для підкреслених нуклеотидних одиниць у вищезгаданих послідовностях SEQ ID №3 і SEQ ID №4, є менш критичним. Проте, в одному варіанті здійснення, обидві підкреслені нуклеотидні одиниці означають 2дезоксинуклеотид. У іншому, в цей час більш переважному, варіанті здійснення одна або обидві підкреслені нуклеотидні одиниці означають аналог нуклеотиду бета-D-окси-LNA. У одному варіанті, 5'-кінцева нуклеотидна одиниця в дужках, (Tx) або (Gx), відповідно, відсутня, і 3'-кінцева інша підкреслена нуклеотидна одиниця, (Т) або (А), відповідно, означає 2дезоксинуклеотид, або більш переважно, аналог нуклеотиду бета-D-окси-LNA. У іншому варіанті, 5'-кінцева нуклеотидна одиниця в дужках, (Тх) або (Gx), відповідно, означає 2дезоксинуклеотид, або більш переважно, аналог нуклеотиду бета-D-окси-LNA, і 3'-кінцева інша підкреслена нуклеотидна одиниця, (Т) або (А), відповідно, відсутня. У іншому варіанті, нуклеотидні одиниці в дужках присутні, і одна або обидві підкреслені нуклеотидні одиниці означають аналог нуклеотиду бетаD-окси-LNA, тобто (і) 5'-кінцевий підкреслений нуклеотид означає аналог нуклеотиду бета-D-оксиLNA і 3'-кінцева підкреслена нуклеотидна одиниця означає 2-дезоксинуклеотид, або (іі) З'-кінцевий підкреслений нуклеотид означає аналог нуклеотиду бета-D-окси-LNA і 5'-кінцева підкреслена нуклеотидна одиниця означає 2-дезоксинуклеотид, або (ііі) 3'-кінцевий, а також 5'-кінцевий підкреслені нуклеотиди означають аналог нуклеотиду бета-Dокси-LNA. У ще одному варіанті, нуклеотидні одиниці в дужках, (Тх) або (Gx), відповідно, є в наявності, і обидві підкреслені нуклеотидні одиниці означають 2-дезоксинуклеотид. Незважаючи на те, що послідовності, позначувані SEQ ID №3 і SEQ ID №4 (і конкретніше, послідовності, позначувані як SEQ ID №1 і SEQ ID №2 (див. далі нижче)), як вважають, по суті представляють повну сукупність певних олігонуклеотидів LNA, подовження послідовності SEQ ID №3 і SEQ ID №4, за допомогою додавання до п'яти 2 93188 12 дезоксинуклеотидних одиниць, наприклад 1 одиниці, 2 одиниць, 3 одиниць, 4 одиниць або навіть 5 одиниць, як вважають, можливе без негативних впливів на корисні властивості базових послідовностей, SEQ ID №3 і SEQ ID №4. При цьому послідовність може бути подовжена з 3'-кінцевої області, 5'-кінцевої області або з 3'-кінцевої області, також як з 5'-кінцевої області, при умові, що загальне число 2-дезоксинуклеотидних одиниць не перевищує 5. Отже, в одному варіанті здійснення (який може бути об'єднаний з попереднім) олігонуклеотид LNA складається з 15, 16, 17, 18, 19 або 20 нуклеотидних одиниць, вибраних з 2-дезоксинуклеотидів і аналогів нуклеотиду бета-D-окси-LNA, зокрема олігонуклеотид LNA складається з 16 нуклеотидних одиниць, вибраних з 2-дезоксинуклеотидів і аналогів нуклеотиду бета-D-окси-LNA. У інших варіантах здійснення (які можуть бути об'єднані з попереднім) олігонуклеотид LNA складається з 13, 14, 15 або 16 нуклеотидних одиниць, вибраних з 2дезоксинуклеотидів і аналогів нуклеотиду бета-Dокси-LNA, зокрема, олігонуклеотид LNA складається з 14 або 15 нуклеотидних одиниць, вибраних з 2-дезоксинуклеотидів і аналогів нуклеотиду бетаD-окси-LNA. Щонайменше для зручності одержання олігонуклеотидів LNA, часто переважно, щоб послідовність була подовжена на одну 2дезоксинуклеотидну одиницю з 3'-кінця, порівняймо, наприклад, послідовність SEQ ID №1 і SEQ ID №2, нижче. Найбільш переважно, послідовність SEQ ID №3 подовжена за допомогою додавання аденозин 2-дезоксинуклеотидної одиниці до 3'кінця, а послідовність SEQ ID №4 подовжена за допомогою додавання цитозин 2дезоксинуклеотидної одиниці до 3'-кінця. Як указано вище, підрядковим індексом «s» позначений фосфоротіоатний зв'язок (-O-P(O,S)O-) між сусідніми нуклеотидами/аналогами нуклеотиду LNA, і підрядковим індексом «х» позначений або фосфоротіоатний зв'язок (-O-P(O,S)-O-), або фосфодіефірний зв’язок (-О-Р(О)2-О-) між сусідніми нуклеотидами/аналогами нуклеотиду LNA. З цього випливає, що будь-які 2-дезоксинуклеотиди, за допомогою яких подовжують послідовність, можуть бути зв'язані за допомогою або фосфоротіоатного зв'язку (-O-P(O,S)-O-), або за допомогою фосфодіефірного зв'язку (-О-Р(О)2-О-). Констатували, що субпослідовність csasasgscsastscscsT послідовності SEQ ID №3 і субпослідовність ascstsgscscststscsT послідовності SEQ ID №4 є повністю фосфоротіомованими, порівняймо підрядковий індекс «s». Хоч в цей час і не є переважним, вважається, що один, також можливо два, фосфоротіоатні зв'язки можуть бути замінені іншими зв'язками, зокрема фосфодіефірними зв'язками, без серйозної загрози стабільності олігонуклеотиду LNA. Таким чином, такі варіанти, в яких один або два фосфоротіоатні зв'язки замінені, наприклад, фосфодіефірними зв'язками, також попадають в передбачуваний об'єм даного винаходу. У одному переважному в цей час варіанті здійснення, проте, всі нуклеотидні одиниці в даній 13 послідовності сполучаються за допомогою фосфоротіоатної групи. 93188 14 Одна підгрупа олігонуклеотидів LNA, що представляють надзвичайний інтерес, вибрана з групи, яка складається з і в цей час найбільш переважна. Інша підгрупа, олігонуклеотидів LNA, що представляють надзвичайний інтерес, вибрана з групи, яка складається з і Серед них в цей час найбільш переважна. У даному контексті, термін «нуклеозид» використовується в його звичайному значенні, тобто він містить одиницю 2-дезоксирибози або рибози, яка зв'язана через свій перший вуглецевий атом з однією з азотистих основ аденін (А), цитозин (С), тимін (Т), урацил (U) або гуанін (G). Аналогічним чином, термін «нуклеотид» означає одиницю 2-дезоксирибози або рибози, яка зв'язана через свій перший вуглецевий атом з однією з азотистих основ аденін (А), цитозин (С), тимін (Т), урацил (U) або гуанін (G), і яка зв'язана через свій п'ятий вуглецевий атом з міжнуклеозидною фосфатною групою, або з кінцевою групою. Термін «нуклеїнова кислота» означає молекулу, утворену за допомогою ковалентного зв'язування двох або більше нуклеотидів. Терміни «нуклеїнова кислота» і «полінуклеотид» використовуються тут як взаємозамінні. Термін «аналог нуклеїнової кислоти» належить до неприродної сполуки, яка зв'язує нуклеїнову кислоту. Термін «мономер LNA» звичайно належить до біциклічного нуклеозидного аналога, як описано в міжнародній заявці на патент WO 99/14226 і подальших заявках, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250 і WO 03/006475, всі включені тут за допомогою посилання. Бета-D-окси-LNA являє собою аналог нуклеотиду LNA, який використовується в олігонуклеотидах LNA за даним винаходом, і дана мономерна структура (нуклеозид) зображена на Схемі 1. Бета-D-окси-LNA Схема 1 На Схемі 1, Z* і Ζ означають положення міжнуклеотидного зв'язку з сусіднім нуклеозидом або кінцевою групою (а саме, або 5'-кінцевою групою, або 3'-кінцевою групою). Одним конкретним прикладом мономера бетаD-окси-LNA є тимідин LNA мономер (нуклеозидний аналог LNA) (18,ЗК.4К,78)-7-гідрокси-1гідроксиметил-5-метил-3-(тимін-1-іл)-2,5діоксабіцикло[2:2: 1]гептан, а саме Т-бета-D-оксиLNA. Термін «олігнуклеотид» означає, в контексті даного винаходу, олігомер (також званий оліго) або полімер нуклеїнової кислоти (наприклад, рибонуклеїнової кислоти (РНК) або дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК)) або аналог нуклеїнової кислоти, відомої в рівні техніки, переважно, замкнену нуклеїнову кислоту LNA (Locked Nucleic Acid), або їх суміш. Цей термін охоплює олігонуклеотиди, що складаються з природних нуклеїнових основ, цукру і міжнуклеозидних зв'язків (кістяк), а також олігонуклеотиди, що мають ділянки штучного походження, які функціонують схожим чином, або мають специфічно поліпшені функції. Повністю або частково модифіковані або заміщені олігонуклеотиди часто більш переважні, ніж нативні форми, через деякі бажані властивості таких олігонуклеотидів, як наприклад, здатність проникати через клітинну мембрану, хороша стійкість до дії 15 поза- і внутрішньоклітинних нуклеаз, висока афінність і специфічність до цільової нуклеїнової кислоти (мішені). Олігонуклеотиди LNA за даним винаходом виявляють вищезгадані властивості. Під термінами «одиниця» і «нуклеотидна одиниця» розуміють мономер, а саме 2дезоксинуклеотид або аналог нуклеотиду бета-Dокси-LNA. Термін «щонайменше один» охоплює цілі числа, які більше або дорівнюють 1, а саме 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 і так далі. Форма однини, застосовувана у відношенні нуклеозиду, аналога нуклеозиду, послідовності SEQ ID №, і тому подібного, призначена для визначення одного або декількох. Зокрема, вираз «компонент (наприклад, нуклеозид, аналог нуклеозиду, послідовність SEQ ID № або тому подібне), вибраний з групи, що складається з...» означає, що можуть бути вибрані один або декілька із згаданих компонентів. Таким чином, вираз «компонент, вибраний з групи, що складається з А, В і С» призначений включати всі комбінації А, В і С, а саме А, В, С, А+В, А+С, В+С і А+В+С. По всьому тексту даного опису, словосполучення «включати», або такі варіанти як «включає», «який включає» означає залучення заявленого елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій, але не виключає будь-який інший елемент, ціле число або стадію, або групу елементів, цілих чисел або стадій. Одержання олігонуклеотидів LNA Структурні одиниці аналога даного нуклеотиду LNA (β-D-окси-LNA) можуть бути одержані на основі наступних опублікованих процедур і посилань, наведених там, дивись наприклад, WO 03/095467 А1; D.S. Pedersen, С. Rosenbohm, Т. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808; і WO 2004/069991 A2. Олігонуклеотиди LNA можуть бути одержані, як описано в Прикладах даної заявки і в публікаціях WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250 і WO 03/006475. Таким чином, олігонуклеотиди LNA можуть бути одержані з використанням технологій олігомеризації хімії нуклеїнових кислот, добре відомих фахівцеві в галузі органічної хімії. Як правило, застосовують стандартні цикли олігомеризації фосфорамідитного методу (S.L. Beaucage and R.P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S.L. Beaucage and R.P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223), але також можна використовувати, наприклад, хімію Н-фосфонатів і хімію фосфотриефірів. Для деяких мономерів може бути необхідний або благотворний більш тривалий час зв'язування, і/або повторюваного зв'язування, і/або використання більш концентрованих зв'язуючих реагентів. Використовувані фосфорамідити звичайно зв'язують із задовільним ступеневим виходом продукту >95%. Окислення фосфору (III) до фосфору (V) звичайно здійснюють, наприклад, з використанням йод/піридин/Н2О. Після зняття захисних груп це приводить до утворення чистого фосфодіефірного міжнуклеозидного зв'язку. У випадку, коли одержаний фосфоротіоатний міжнуклеозид 93188 16 ний зв'язок, проводять стадію тіолування за допомогою заміни нормального, наприклад йод/піридин/Н2О, окислення, що використовується при синтезі фосфородіефірних міжнуклеозидних зв'язків, на окислення, з використанням реагенту ADTT (гідрид ксантану (0,01Μ в ацетонітрил:піридин 9:1, об./об.)). Також можливе застосування інших реагентів для тіолування, наприклад Beaucage і PADS. Фосфоротіоатні олігонуклеотиди LNA були ефективно синтезовані з постадійним виходом утворення пар >=98%. Очищення олігонуклеотидів LNA може бути здійснене з використанням одноразових картриджів для очищення із оберненою фазою, і/або оберненофазовою ВЕРХ, і/або осадження з етанолу або бутанолу. Для підтвердження чистоти синтезованих олігонуклеотидів LNA використовували капілярний гель-електрофорез, оберненофазову ВЕРХ, мас-спектрометрію з лазерною іонізацією і десорбцією з матриці (MALDI-MS), і тандемну мас-спектрометрію з іонізацією електророзпилюванням (ESI-MS). Солі Олігонуклеотид LNA може бути використаний в цілому ряді фармацевтично прийнятних солей. Як використовується тут, даний термін означає солі, які зберігають необхідну біологічну активність олігонуклеотиду LNA і виявляють мінімальні небажані токсичні ефекти. Необмежувальні приклади таких солей можуть бути утворені з органічними амінокислотами і основними адитивними солями, утвореними з катіонами металів, таких як цинк, кальцій, вісмут, барій, магній, алюміній, мідь, кобальт, нікель, кадмій, натрій, калій і тому подібне, або з катіонами, утвореними з аміаку, Ν,Νдибензилетилендіаміну, D-глюкозаміну, тетраетиламонію або етилендіаміну; або комбінації, наприклад, танат цинкової солі або що-небудь подібне. Такі солі утворені з олігонуклеотиду LNA, в якому є фосфодіефірна група і/або фосфоротіоатна групи, і являють собою, наприклад, солі з придатними основами. Ці солі включають, наприклад, нетоксичні солі металів, які утворені з металами груп Іа, Іb, llа і llb періодичної системи елементів, зокрема придатні солі лужних металів, наприклад, солі літію, натрію або калію, або солі лужноземельних металів, наприклад, солі магнію або кальцію. Крім того, вони включають солі цинку і амонію, а також солі, які утворені з придатними органічними амінами, такими як незаміщені або гідроксилзаміщені моно-, ди- або триалкіламіни, зокрема, моно-, ди- або триалкіламіни, або з четвертинними сполуками амонію, наприклад, з N-метил-Nетиламіном, диетиламіном, триетиламіном, моно-, біс- або трис-(2-гідроксинижчий алкіл)амінами, як наприклад, моно-, бісабо трис-(2гідроксіетил)амін, 2-гідрокси-трет-бутиламін або трис(гідроксиметил)метиламін, Ν,Ν-динижчий алкіл-N-(гідроксинижчий алкіл)аміни,як наприклад Ν,Ν-диметил-N-(2-гідроксіетил)-амін або три-(2гідроксіетил)амін, або N-метил-D-глюкамін, або четвертинні сполуки амонію, наприклад солі тетрабутиламонію. Переважними є солі літію, солі натрію, солі магнію, солі цинку або солі калію, особливо переважні солі натрію. 17 Проліки У одному варіанті, олігонуклеотид LNA може бути у формі проліків. Олігонуклеотиди існують завдяки негативно зарядженим іонам. Внаслідок ліпофільної природи клітинних мембран, клітинне поглинання олігонуклеотидів знижене в порівнянні з нейтральними або ліпофільними еквівалентами. Цієї «перешкоди» полярності можна уникнути, використовуючи принцип проліків (див., наприклад Crooke, R.M. (1998) in Crooke, S.T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol.131, pp.103-140). В цьому способі, олігонуклеотиди LNA одержані в захищеній манері, таким чином, що олігонуклеотиди LNA залишаються нейтральними при їх введенні. Ці захисні групи сконструйовані таким чином, що вони можуть бути видалені після того, як олігонуклеотид LNA поглинений клітиною. Прикладами таких захисних груп є S-ацетилтіоетил (SATE) або Sпівалоїлтіоетил (і-бутил-SATE). Ці захисні групи є стійкими до нуклеаз і внутрішньоклітинно селективно видаляються. Кон'югати Ще один аспект даного винаходу належить до кон'югата, що містить олігонуклеотид LNA, визначений тут, і щонайменше одну ненуклеотидну або неполінуклеотидну молекулу, ковалентно зв'язану з вказаним олігонуклеотидом LNA. У пов'язаному аспекті даного винаходу, олігонуклеотид LNA за даним винаходом зв'язаний з лігандами з тим, щоб утворити кон'югат, вказані ліганди призначені для підвищення клітинного поглинання кон'югата відносно антисмислових олігонуклеотидів. У даному контексті, термін «кон'югат» призначений для позначення гетерогенної молекули, утвореної за допомогою ковалентного зв'язування описаного тут олігонуклеотиду LNA (наприклад, олігонуклеотиду LNA, що містить послідовність нуклеозидів і аналогів нуклеозидів LNA) з однією або декількома ненуклеотидними або неполінуклеотидними молекулами. Таким чином, олігонуклеотиди LNA можуть, наприклад, бути кон'юговані або утворювати химери з ненуклеотидними або неполінуклеотидними молекулами, в тому числі Пептидними Нуклеїновими Кислотами (ПНК), білками (наприклад, антитіла до білка-мішені), макромолекулами, низькомолекулярними лікарськими речовинами, ланцюгами жирних кислот, залишками цукрів, глікопротеїдами, полімерами (наприклад, поліетиленгліколь), міцелеутворювальними групами, антитілами, вуглеводнями, рецепторзв'язувальними групами, стероїдами, такими як холестерин, поліпептидами, інтеркалюючими агентами, такими як похідне акридину, довголанцюговим спиртом, дендримером, фосфоліпідом і іншими ліпофільними групами або їх комбінаціями, і тому подібне, точно так само олігонуклеотиди LNA можуть бути розташовані в димерних або дендритних структурах. Олігонуклеотиди LNA або кон'югати за даним винаходом також можуть бути кон'юговані або додатково кон'юговані з діючими лікарськими речовинами, наприклад, аспірином, ібупрофеном, сірковмісним лікарським засобом, 93188 18 протидіабетичним, антибактеріальним агентом, хіміотерапевтичним агентом або антибіотиком. Кон'югування подібним чином може додавати корисні властивості відносно фармакокінетичних характеристик олігонуклеотидів LNA. Зокрема, кон'югуванням таким способом можна досягнути збільшеного клітинного поглинання. У одному варіанті здійснення олігонуклеотид LNA зв'язаний з лігандами таким чином, щоб утворити кон'югат, де вказані ліганди призначені для підвищення клітинного поглинання кон'югата в порівнянні з антисмисловими олігонуклеотидами LNA. Це кон'югування може відбуватися в 5'/3'-ОН кінцевому положенні, але ліганди також можуть знаходитися в цукрах і/або основах. Зокрема, фактор росту, з яким може бути кон'югований антисмисловий олігонуклеотид LNA, може містити трансферин або фолат. Трансферин-полілізинолігонуклеотидні комплекси або фолат-полілізинолігонуклеотидні комплекси можуть бути одержані для поглинання клітинами, які експресують високі рівні трансферинового або фолатного рецептора. Іншими прикладами кон'югатів/лігандів є молекули холестерину, дуплексні інтеркалятори, такі як акридин, полі-L-лізин, з блокуванням кінцевих груп однією або декількома стійкими до нуклеаз групами зчеплення, такою як фосфоромонотіоат і тому подібне. Одержання трансферинових комплексів як переносників олігонуклеотидів всередину клітин описане у Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Клітинна доставка фолатмакромолекулярних кон'югатів за допомогою ендоцитозу за участі фолатного рецептора, в тому числі доставка антисмислового олігонуклеотиду, описана у Low et al., в патенті США 5108921. Також див., Leamon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5572 (1991). Фармацевтична композиція У надзвичайно цікавому аспекті даний винахід належить до фармацевтичної композиції, що містить визначений тут олігонуклеотид LNA, або визначений тут кон'югат, і фармацевтично прийнятний розріджувач, носій або ад'ювант. Фармацевтична композиція переважно придатна для ін'єкції, для місцевого застосування, або для внутрішньоочного введення (див. далі нижче). Інструкції по приготуванню фармацевтичних композицій можна знайти в «Remington: The Science and Practice of Pharmacy» by Alfonso R. Gennaro, і надалі. Фармацевтично прийнятні розріджувачі, носії або ад'юванти є частиною фармацевтичної композиції. Капсули, таблетки і пілюлі, і тому подібне, можуть містити, наприклад, наступні сполуки: мікрокристалічну целюлозу, камедь або желатин як зв'язуючі речовини; крохмаль або лактозу як інертні наповнювачі; стеарати як ковзні речовини; різні підсолоджувальні або ароматизуючі речовини. Для капсул лікарська форма може містити рідкий носій, подібний жирним маслам. Схожим чином шари цукру або агенти, що розпадаються в кишечнику, можуть бути частиною лікарської форми. Фармацевтична композиція також може бути емульсією діючих фармацевтичних інгредієнтів (в тому числі, 19 олігонуклеотид LNA) і ліпіду, що створює міцелярну емульсію. Олігонуклеотид LNA може бути змішаний з будь-якою речовиною, яка не ослабляє бажану дію, або з речовиною, яка розширює бажану дію. Ці речовини можуть включати інші лікарські засоби, в тому числі інші сполуки олігонуклеотидів. Композиція для парентерального, підшкірного, внутрішньошкірного або місцевого введення може включати стерильний розріджувач (наприклад, воду), буфер(и), регулятори тонічності і іонної сили і антибактеріальні агенти. Діючий олігонуклеотид LNA може бути приготований з носіями, які полегшують поглинання, захищають від розщеплення або захищають від негайного виведення з організму, в тому числі з імплантами або мікрокапсулами, які мають властивості контрольованого вивільнення. Для внутрішньовенного введення переважними носіями є фізіологічний розчин (0,9%) або забуферений фізіологічний розчин (наприклад, фізіологічний розчин з фосфатним буфером). У переважному варіанті здійснення ін'єкції або інфузії олігонуклеотидів LNA проводять в або біля ділянки утворення нових судин. Наприклад, олігонуклеотиди LNA за даним винаходом, можуть бути доставлені в ретинально-пігментні епітеліальні клітини ока. Переважно, олігонуклеотиди LNA вводять місцево в око, наприклад в рідкій формі або в формі гелю, на нижню повіку ока або в склепіння кон'юнктиви, як відомо фахівцеві в даній галузі (див., наприклад, Acheampong AA et al, 2002, Drug Metabol. and Disposition 30: 421-429, повний опис якого наведений тут як посилання). Фармацевтичні композиції за даним винаходом можуть бути введені різними способами, в залежності від того, яке лікування необхідне - місцеве або системне, і від області, яка піддається лікуванню. Введення може бути (а) пероральним, (b) легеневим, наприклад, за допомогою інгаляції або інсуфляції порошків або аерозолів, в тому числі за допомогою небулайзера; інтратрахеальним, інтраназальним, (с) місцевим, в тому числі епідермальним, трансдермальним, очним і в мембрани слизової оболонки, в тому числі вагінальна або ректальна доставка; або (d) парентеральним, в тому числі внутрішньовенна, внутрішньоартеріальна, підшкірна, внутрішньочеревинна або внутрішньом'язова ін'єкція або інфузія; або внутрішньочерепним, наприклад, підоболонкове або внутрішньошлуночкове введення. У одному варіанті здійснення, активний олігонуклеотид LNA вводиться внутрішньовенно, внутрішньочеревинно, перорально, місцево або у вигляді болюсного вливання, або вводиться безпосередньо в органмішень. У цей час вважається, що найбільш придатним способом введення є внутрішньовенні інфузії або пероральне введення. Фармацевтичні композиції і склади для місцевого застосування можуть включати трансдермальні пластири, мазі, лосьйони, креми, гелі, краплі, спреї, супозиторії, рідини або порошки. Звичайні фармацевтичні носії, водні, порошкові або масляні основи, загусники і тому подібне, можуть бути необхідні або бажані. Також можна використати пре 93188 20 зервативи з покриттям, рукавички і тому подібне. Переважні композиції для місцевого введення включають ті, в яких до олігонуклеотидів за даним винаходом підмішаний агент для місцевої доставки, як наприклад, ліпіди, ліпосоми, жирні кислоти, ефіри жирних кислот, стероїди, хелатуючі агенти і поверхнево-активні речовини. Композиції і склади для перорального застосування включають, але не обмежуються, порошки або гранули, мікрочастинки, наночастинки, суспензії або розчини у воді або неводних середовищах, капсули, гелеві капсули, саше, таблетки або міні-таблетки. Композиції і склади для парентерального, підоболонкового або внутрішньошлуночкового введення можуть включати стерильні водні розчини, які також можуть містити буфери, розріджувачі або інші придатні допоміжні речовини, такі як, але, не обмежуючись, речовини, сприяючі проникненню, сполуки-носії і інші фармацевтично прийнятні носії або інертні наповнювачі. Фармацевтичні композиції за даним винаходом включають, але не обмежуються, розчини, емульсії і склади, що містять ліпосоми. Ці композиції можуть бути складені з різних компонентів, які включають, але не обмежуються, преформовані рідини, самоемульгувальні тверді частинки і самоемульгувальні напівтверді частинки. Доставка лікарського засобу в тканину пухлини може бути посилена за допомогою доставки, опосередкованої носіями, що включають, але, не обмежуючись, катіонні ліпосоми, циклодекстрини, похідні порфірину, дендримери з розгалуженими ланцюгами, полімери поліетиленімінів, наночастинки і мікросфери (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):327). Надзвичайно переважним парентеральним шляхом введення є внутрішньоочне введення. Зрозуміло, що внутрішньоочне введення даних олігонуклеотидів LNA може бути виконане за допомогою ін'єкції або прямого (наприклад, місцевого) введення в око, доти, поки даний шлях введення дозволяє проникнути олігонуклеотидам LNA в око. У доповнення до місцевого способу введення в око, описаного вище, придатні внутрішньоочні шляхи введення включають інтравітреальний, інтраретинальний, субретинальний, субтеноновий, пери- і ретроорбітальний, трансрогівковий і транссклеральний шлях введення. Для внутрішньоочного введення фармацевтична композиція може бути введена місцево, наприклад, за допомогою пластиру або прямим введенням в око, або за допомогою іонофорезу. Мазі, спреї або призначені для закапування рідини можуть бути доставлені за допомогою офтальмологічних систем доставки, відомих в даній галузі, наприклад за допомогою аплікаторів або очних піпеток. Композиції можна вводити безпосередньо на поверхню ока або на внутрішню поверхню повіки. Такі композиції можуть включати мукоміметики, такі як гіалуронова кислота, хондроїтин сульфат, гідроксипропілметилцелюлоза або полівініловий спирт, консерванти, такі як сорбінова кислота, ЕДТО або хлорид бензилхрому, і звичайні кількості розріджувачів і/або носіїв. 21 Олігонуклеотиди LNA за даним винаходом можуть входити до складу композицій з уповільненим вивільненням, як ті, які описані, наприклад, в патентах США №№5672659 і 5595760. Застосування композицій негайного або уповільненого вивільнення залежить від природи стану, відносно якого проводиться лікування. Якщо стан належить до гострого або надгострого захворювання, лікування з використанням форми негайного вивільнення переважніше композиції з уповільненою дією. Альтернативно, для деяких профілактичних або тривалих лікувальних схем придатним може бути застосування композиції уповільненого вивільнення. Олігонуклеотид LNA може бути введений за допомогою ін'єкції всередину ока, наприклад за допомогою голки або іншого засобу доставки. У одному варіанті здійснення, фармацевтичні композиції містять олігонуклеотид LNA за даним винаходом (наприклад, від 0,1 до 90% по вазі) або його фізіологічно прийнятну сіль, змішану з фізіологічно прийнятним середовищем-носієм. Переважними фізіологічно прийнятними середовищами-носіями є вода, буферна вода, нормальний фізіологічний розчин, 0,4% фізіологічний розчин, 0,3% гліцин, гіалуронова кислота і тому подібне. Фармацевтичні композиції за даним винаходом також можуть містити стандартні фармацевтичні інертні наповнювачі і/або допоміжні речовини. Придатні фармацевтичні інертні наповнювачі включають стабілізатори, антиоксиданти, агенти, регулюючі осмоляльність, буфери і агенти, регулюючі рН. Придатні допоміжні речовини включають фізіологічно біосумісні буфери (наприклад, трометамін гідрохлорид), добавки хелантів (такі як, наприклад, DTPA або DTPA-бісамід) або хелатні комплекси кальцію (як, наприклад, кальцій DTPA, CaNaDTPA-бісамід), або, при бажанні, добавки солей кальцію або натрію (наприклад, хлорид кальцію, аскорбат кальцію, глюконат кальцію або лактат кальцію). Фармацевтичні композиції за даним винаходом можуть бути розфасовані для застосування в рідкій формі, або можуть бути ліофілізованими. Для твердих композицій можна використовувати стандартні нетоксичні тверді носії; наприклад, фармацевтичні категорії манітолу, лактози, крохмалю, стеарату магнію, сахарину натрію, тальку, целюлози, глюкози, сахарози, карбонату магнію і тому подібне. Переважно олігонуклеотид LNA входить до складу дозованої композиції, а саме з фармацевтично прийнятним носієм або розріджувачем, в кількості, достатній для доставки пацієнту терапевтично ефективної кількості, не викликаючи серйозних побічних ефектів у пацієнта, який піддається даному лікуванню. Фармацевтичні композиції за даним винаходом, які можуть бути представлені в стандартних лікарських формах, можуть бути одержані згідно із звичайними технологічними прийомами, добре відомими в фармацевтичній промисловості. Такі технологічні прийоми включають етап сполучання діючих інгредієнтів з фармацевтичним носієм (носіями) або інертним наповнювачем (наповнювача 93188 22 ми). Звичайно композиції одержують за допомогою рівномірного і безпосереднього сполучання діючих інгредієнтів з рідкими носіями або дрібноподрібненими твердими носіями, або і тим, і іншим, і потім, при необхідності, надання форми продукту. Композиціям за даним винаходом можна надати будь-якої з множини можливих лікарських форм, як, наприклад, але, не обмежуючись цим, таблетки, капсули, гелеві капсули, рідкі сиропи, м'які гелі і супозиторії. Композиції за даним винаходом також можуть знаходитися у формі суспензій у водному, неводному або змішаному середовищі. Водні суспензії можуть додатково містити речовини, які підвищують в'язкість даної суспензії, в тому числі, наприклад, натрій карбоксиметилцелюлозу, сорбітол і/або декстран. У суспензії також можуть міститися стабілізатори. У переважних варіантах здійснення фармацевтичних композицій, олігонуклеотид LNA приготований у водному носії, зокрема, у водному носії, який містить буфер для підтримки значення рН в діапазоні 4,0-8,5, і має іонну силу 20-2000мМ. Термін «водний носій» означає, що фармацевтична композиція, про яку йде мова, являє собою рідку форму, і що рідкий носій головним чином складається з води, тобто щонайменше на 80% (мас/мас.) або щонайменше на 90% (мас/мас), навіть щонайменше на 95% (мас/мас), даний носій складається з води. Також можна використовувати інші рідкі інгредієнти, наприклад, етиловий спирт, DMSO, етиленгліколь, і тому подібне. Водний носій переважно містить фізіологічний розчин або буфер для підтримки значення рН в діапазоні 4,0-8,5. Переважно, буфер буде підтримувати значення рН в діапазоні 5,0-8,0. наприклад, в діапазоні 6,0-7,5, як наприклад забуферений фізіологічний розчин, наприклад, забуферений фосфатом фізіологічний розчин (PBS). Іонна сила/тонічність фармацевтичної композиції також є важливою. Таким чином, звичайно, рідка композиція має іонну силу в межах 202000мМ, як наприклад, в межах 50-1500мМ або в межах 100-1000мМ. Комбіновані лікарські засоби Повинно бути зрозуміло, що фармацевтична композиція, згідно з даним винаходом, необов'язково містить додаткові антисмислові сполуки, хіміотерапевтичні агенти, протизапальні сполуки, противірусні сполуки, цитостатичні сполуки, антиангіогенні сполуки, антипроліферативні сполуки, проапоптотичні сполуки, модулятори сигнальної трансдукції, інгібітори кінази і/або імуномодулюючі сполуки. У цей час вважається, що надзвичайно цікавими є комбінації олігонуклеотиду LNA з щонайменше одним хіміотерапевтичним агентом. Як указано, фармацевтична композиція за даним винаходом може додатково містити щонайменше один хіміотерапевтичний агент. Хіміотерапевтичний агент, звичайно, вибраний з групи, що містить адренокортикостероїди, наприклад, преднізон, дексаметазон або декадрон; альтретамін (гексален, гексаметилмеламін (НММ)); аміфостин (етіол); аміноглютетимід (цитадрен); амсакрин (MAMSA); анастрозол (аримідекс); андрогени, напри 23 клад тестостерон; аспарагіназу (елспар); Авастин; бацилу Кальмете-Герена; бікалутамід (касодекс); біфосфанат: блеоміцин (бленоксан); бортезоміб; бусульфан (мілеран); карбоплатин (параплатин); кармустин (BCNU, BiCNU); хлорамібуцил (леукеран); хлородезоксіаденозин (2-CDA, кладрибін, леустатин); цисплатин (платинол); циклофосфамід; цитозинарабінозид (цитарабін); дакарбазин (DTIC); дактиноміцин (актиноміцин-D, космеген); даунорубіцин (церубідин); доцетаксель (таксотер); доксорубіцин (адріоміцин); епірубіцин; естрамустин (емцит); естрогени, наприклад, діетилстилбестрол (DES); етопозид (VP-16,вепезид, етопофос); флударабін (флудара); флутамід (еулексин); 5FUDR (флоксуридин); 5-флуорацил (5-FU); гемцитабін (гемзар); госерелін (золадекс); герцептин (трастузумаб); гідроксисечовини (гідреа); ідарубіцин (ідаміцин); іфосфамід; IL-2 (пролейкін, алдеслейкін); інтерферон альфа (інтрон А, роферон А); іринотекан (камптосар); леупролід (лупрон); левамізол (ергамізол); ломустин (CCNU); мехлоратамін (мустарген, азотистий іприт); мелфалан (алкеран); меркаптопурин (пуринетол, 6-МР); метотрексат (мексат); 2-метоксіестрадіол (2МЕ2, Панзем); мітоміцин-С (мутамуцин); мітоксантрон (новантрон); октреотид (сандостатин); пентостатин (2дезоксикоформіцин, ніпент); плікаміцин (мітраміцин, мітрацин); прокарбазин (матулан); стрептозоцин; тамоксифін (нолвадекс); таксол (паклітаксел); теніпозид (вумон, VM-26); Талідомід; тіотепа; топотекан (гікамтин); третиноїн (весаноїд, повністю транс-ретиноєва кислота); вінбластин (валбан); вінкристин (онковін) і вінорелбін (навелбін). Для лікування множинної мієломи, переважними є такі хіміотерапевтичні агенти, як мелфалан, циклофосфамід, преднізон, вінкристин, доксорубіцин, кармустин, дексаметазон, талідомід, бортезоміб і біфосфанат. Для лікування карциноми нирок переважними є такі хіміотерапевтичні агенти, як гемцитабін, 5фторурацил (5-FU), 5-фтордезоксіуридин, паклітаксел, карбоплатин, іфосфамід, доксорубіцин, вінбластин, IFN-альфа і IL-2. У одному варіанті здійснення даний винахід належить до фармацевтичних композицій, що містять (а) один або декілька олігонуклеотидів LNA і (b) один або декілька інших хіміотерапевтичних сполук, механізм дії яких не є антисмисловим. При застосуванні з олігонуклеотидами LNA такі хіміотерапевтичні сполуки можна використовувати індивідуально (наприклад, мітраміцин і олігонуклеотид), послідовно (наприклад, протягом якогось періоду часу мітраміцин і олігонуклеотид, а потім інший агент і олігонуклеотид), або в комбінації з одним або декількома іншими хіміотерапевтичними сполуками, або в комбінації з променевою терапією. Всі хіміотерапевтичні сполуки, відомі в рівні техніки, в тому числі згадані вище, включені тут як комбіноване лікування з олігонуклеотидом відповідно до даного винаходу. У одному варіанті здійснення фармацевтична композиція вводиться в комбінації із сполукою таксану. Термін «сполука таксану» включає паклітаксел (Тахоl®), похідні паклітакселу, доцетаксел, таксо 93188 24 тер, модифіковані таксани і аналоги таксоїдів. Паклітаксел (Тахоl®) являє собою дитерпен, виділений з кори тиса коротколистого (тиса тихоокеанського), Taxus brevifolia і є представником класу терапевтичних агентів, що мають в своїй структурі таксанове кільце. Паклітаксел і його аналоги одержують внаслідок часткового синтезу з 10деацетилбакатину III, попередника, одержаного з голок і гілочок тиса, і внаслідок повного синтезу. Дивись Holton, et al., J. Am. Chem. Soc. 116: 15971601 (1994) I Nicolaou, et al., Nature 367:630 (1994). У клінічних випробуваннях паклітаксел виявив ефективність відносно декількох пухлин людини. Дивись McGuire, et al., Ann. Int. Med. Ill: 237-279 (1989); Holmes, et al., J. Natl. Cancer Inst. 83: 17971805 (1991); Kohn et al, J. Natl. Cancer Inst. 86: 1824 (1994); і Kohn, et al, American Society for Clinical Oncology 12 (1993). Модифікований таксан або аналоги таксоїдів являють собою такі сполуки, які мають таксанове кільце, що несе модифіковані бічні ланцюги. Багато які з цих аналогів мають поліпшені властивості, як наприклад, велика розчинність у воді і стабільність в порівнянні з цими властивостями природного таксану. Ці аналоги відомі фахівцеві в рівні техніки і розкриті, наприклад, в патентах США №№5278324; 5272171; 5254580; 5250683; 5248796; і 5227400, описи яких включені тут за допомогою посилання. Паклітаксел і таксотер можна одержати з використанням способів, описаних в публікаціях WO 93/18210, ЕР 0 253 739, ЕР 0 253 739, і WO 92/09589, описи яких включені тут за допомогою посилання. У конкретних варіантах здійснення сполука таксану являє собою паклітаксел або таксотер. Вагове співвідношення між сполукою (сполуками) таксану і олігонуклеотидом LNA у вказаній композиції звичайно знаходиться в діапазоні від 50:1 до 1:25, наприклад, в діапазоні від 25:1 до 1:25, або в діапазоні від 10:1 до 1:25, або в діапазоні від 1:1 до 1:25, або в діапазоні від 50:1 до 1:10, або в діапазоні від 1:1 до 1:50, або в діапазоні від 25:1 до 1:10. У ще одному варіанті здійснення фармацевтичні композиції за даним винаходом можуть містити один або декілька олігонуклеотидів LNA і одну або декілька додаткових антисмислових сполук, націлених на другу нуклеїнову кислоту-мішень. Дві або більше комбінованих сполук можна використовувати разом або послідовно. Протизапальні лікарські засоби, в тому числі, але не обмежено, нестероїдні протизапальні лікарські засоби і кортикостероїди, противірусні лікарські засоби, і імуномодулюючі лікарські засоби, також можна поєднувати з композицією за даним винаходом. Дві або більше комбінованих сполук можна використовувати разом або послідовно. Крім того, фармацевтичні композиції, що містять олігонуклеотиди LNA, можна використовувати в поєднанні з променевою терапією і тому подібним. Медичне лікування Олігонуклеотиди LNA за даним винаходом використовуються для багатьох терапевтичних застосувань, як указано тут. У більшості випадків, терапевтичні способи за даним винаходом вклю 25 чають введення терапевтично ефективної кількості модифікованого олігонуклеотиду LNA ссавцеві, зокрема людині. Таким чином, даний винахід також належить до олігонуклеотиду LNA, як визначено тут, або до кон'югата, як визначено тут, для використання як лікарського засобу. Дозування залежить від тяжкості і реактивності хворобливого стану, відносно якого проводиться лікування, і курс лікування триває від декількох днів до декількох місяців, або доти, поки лікування ефективне, або досягається зменшення виявів хворобливого стану. Оптимальна схема дозування також може бути визначена за допомогою визначення рівня лікарського засобу в організмі хворого або за допомогою маркерів-імітаторів. Оптимальне дозування може змінюватися в залежності від відносної ефективності окремих олігонуклеотидів. Звичайно, його можна визначити виходячи з ЕС5о, яка визначена як ефективна в експериментальних моделях на тваринних in vitro і in vivo. Звичайно, дозування складає від 0,01мкг до 1г на кг маси тіла, і може вводитися один або декілька разів щодня, щотижня, щомісяця або кожний рік, або навіть один раз кожні 2-10 років, або за допомогою тривалої інфузії протягом годин і до декількох місяців. Частота повторень введення лікарського засобу дозами може бути визначена виходячи з виміряного часу знаходження і концентрацій даного лікарського засобу в рідинах організму або тканинах. Після успішного лікування може бути бажане призначення пацієнту підтримуючої терапії для запобігання рецидиву захворювання. У цей час вважається, що найбільш релевантними є дози від 0,01мг до 100мг, наприклад від 0,1мг до 40мг або від 0,5мг до 10мг, на кг маси тіла. Такі дози можуть бути введені один раз щодня, але більш переважні менш часті, наприклад, 1-3 рази на тиждень, протягом 1-4 тижнів. Підтримуюча терапія може бути тривалою, наприклад, 1-4 рази на місяць або навіть менш часто, наприклад, 1-10 разів на рік. Фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що нуклеотиди LNA можна використовувати для протидії захворюванням, пов'язаним з HIF-1α, за допомогою множини різних принципів, що, таким чином, відповідає ідеї даного винаходу. Як використовується тут, термін «нуклеїнова кислота-мішень» означає ДНК, що кодує HIF-1α, РНК (в тому числі пре-мРНК і мРНК), яка транскрибується з такою ДНК, і також к ДНК, одержана з такою РНК. Як використовується тут, термін «ген» означає ген, включаючи екзони, інтрони, некодуючі 5' і 3' області і регуляторні елементи і всі відомі в цей час їх варіанти, і будь-які додаткові варіанти, які можуть бути виявлені. Як використовується тут, термін «олігонуклеотид LNA» означає олігонуклеотид, який може індукувати необхідний терапевтичний ефект у людини внаслідок, наприклад, прямого зв'язування водневим зв'язком або з геном-мішенню «Chimeraplast» і «TFO», з транскриптом (транскриптами) РНК гена-мішені -«антисмислові інгібітори», «siRNA», «miRNA», «рибозими» і «олігозими», або 93188 26 білком (білками), що кодується геном-мішенню «aptamer», «spiegelmer» або «decoy». Як використовується тут. термін «мРНК» означає відомий в цей час транскрипт(и) РНК генамішені, і будь-які додаткові транскрипти, які можуть бути виявлені. Як використовується тут, термін «модулювання» означає або підвищення (стимулювання), або пониження (інгібування) експресії гена. У даному винаході інгібування є переважною формою модулювання експресії гена і мРНК є переважною мішенню. Як використовується тут, термін «націлювання» анти смислової сполуки на конкретну нуклеїнову кислоту-мішень означає доставку антисмислового олігонуклеотиду в клітину, тварину або людину, таким способом, що антисмислова сполука буде здатна зв'язуватися з і модулювати функцію своєї наміченої мішені. Дані олігонуклеотиди LNA можуть бути сконструйовані як siRNA, які є невеликими дволанцюговими молекулами РНК, що використовуються клітинами для вимикання специфічних ендогенних або екзогенних генів за допомогою поки ще погано зрозумілого механізму, «подібного антисмисловому». Клінічна ефективність антисмислових олігонуклеотидів залежить від значущого діапазону їх фармакокінетики, наприклад всмоктування, розподілу, клітинного поглинання, метаболізму і екскреції. У свою чергу ці параметри значно керовані за допомогою хімії, що лежить в основі, і розміру і трьохмірної структури нуклеотиду. Модулювання фармакокінетичних характеристик олігонуклеотиду LNA за даним винаходом додатково може бути досягнуте внаслідок приєднання множини різних молекул. Наприклад, здатність олігонуклеотидів проходити через клітинну мембрану може бути посилена за допомогою приєднання, наприклад, таких ліпідних молекул, як молекули холестерину, тіоефіру, аліфатичного ланцюга, фосфоліпіду або поліаміну до даного олігонуклеотиду. Схожим чином, поглинання клітинами олігонуклеотидів LNA може бути посилене за допомогою кон'югування молекул з олігонуклеотидом, який взаємодіє з молекулами на мембрані, що опосередковує перенесення в цитоплазму. Фармакодинамічні властивості можуть, згідно з даним винаходом, бути посилені за допомогою груп, які підвищують поглинання олігонуклеотиду LNA, посилюють біостабільність, наприклад, посилюють стійкість олігонуклеотиду LNA до розщеплення, і/або збільшує специфічність і афінність характеристик гібридизації олігонуклеотидів з послідовністю-мішенню, наприклад з послідовністю мРНК. Фармацевтична композиція за даним винаходом може бути використана при лікуванні множини різних захворювань. Подібно проліферуючим раковим клітинам, клітини ендотелію судин є чутливими до супресуючого ефекту на експресію HIF1α. Фармацевтичну композицію за даним винаходом, таким чином, можна використовувати при лікуванні захворювань, які характеризуються патологічним ангіогенезом, що є причиною розвитку 27 захворювання. Прикладами таких захворювань є злоякісні пухлини в цілому і атеросклероз, псоріаз, діабетична ретинопатія, дегенерація жовтої плями, ревматоїдний артрит, астма, запальна хвороба кишечнику, бородавки, алергічний дерматит і саркома Капоши. У загальному вигляді, один аспект даного винаходу належить до способу лікування ссавця, що страждає на або має схильність до захворювання, яке розвивається в результаті патологічного ангіогенезу, який включає введення в організм ссавця терапевтично ефективної кількості олігонуклеотиду LNA або кон'югата, як визначено тут. Крім того, даний винахід також належить до способу інгібування ангіогенезу, який включає введення олігонуклеотиду LNA, як визначено тут, або кон'югата, як визначено тут, або фармацевтичної композиції, як визначено тут. Один цікавий аспект даного винаходу належить до застосування олігонуклеотиду LNA, як визначено тут, або кон'югата, як визначено тут, для приготування лікарського засобу для лікування захворювання, вибраного з атеросклерозу, псоріазу, діабетичної ретинопатії, дегенерації жовтої плями, ревматоїдного артриту, астми, запального захворювання кишечнику, бородавок, алергічного дерматиту, запалення і шкірного запалення, або інших захворювань, які стосуються шкіри. Фармацевтичну композицію за даним винаходом також можна використовувати при лікуванні запального захворювання, запалень, таких як шкірне запалення, або інших шкірних захворювань або порушень, наприклад, псоріазу і ревматоїдного артриту. Подібним чином, інший цікавий аспект даного винаходу належить до способу лікування захворювання, вибраного з групи, яка включає атеросклероз, псоріаз, діабетичну ретинопатію, ревматоїдний артрит, астму, запальне захворювання кишечнику, бородавки, алергічний дерматит, запалення і шкірне запалення, де вказаний спосіб містить введення олігонуклеотиду LNA, як визначено тут, або кон'югата, як визначено тут, або фармацевтичної композиції, як визначено тут, в організм пацієнта, який потребує такого лікування. Надзвичайний інтерес представляють ангіогенні захворювання, в тому числі діабетична ретинопатія, дегенерація жовтої плями, псоріаз, ревматоїдний артрит, запальне захворювання кишечнику, і інші запальні захворювання. Ці захворювання характеризуються руйнуванням нормальної тканини знов утвореними кровоносними судинами в ділянці утворення нових судин. Наприклад, при дегенерації жовтої плями уражається і руйнується капілярами судинна оболонка ока. Руйнування судинної оболонки ока, що спричиняється ангіогенезом, при дегенерації жовтої плями призводить до часткової або повної сліпоти. Способи за даним винаходом переважно використовуються для лікування або профілактики захворювань, викликаних раком, зокрема для лікування раку, який може розвинутися в таких тканинах, як легеня, молочна залоза, товста кишка, передміхурова заліза, підшлункова залоза, печінка, щитовидна залоза, нирки, головна мозок, яєчка, 93188 28 шлунок, кишечник, травний тракт, спинний мозок, синуси, сечовий міхур, сечовивідні шляхи, або рак яєчників. Крім того, описаний тут винахід охоплює спосіб профілактики або лікування раку, який включає введення терапевтично ефективної кількість олігонуклеотиду LNA, що модулює HIF-1α, включаючи, але, не обмежуючись, високі дози даного олігонуклеотиду LNA, в організм людини, яка потребує такого лікування. Даний винахід додатково охоплює використання короткого періоду введення олігонуклеотиду LNA, що модулює HIF1α. Нормальні, неракові клітини, розділені за частотними характеристиками на окремі клітинні типи. Коли клітина трансформується в злоякісну структуру, відбувається неконтрольована клітинна проліферація і знижений клітинний некроз, і, отже, безладний клітинний розподіл або клітинний ріст є відмінною рисою клітини ракового типу. Приклади типів раку включають, але не обмежуються цим, неходжкінску лімфому, лімфому Ходжкіна, лейкемію (наприклад, гостра лейкемія, така як гострий лімфолейкоз, гострий мієлолейкоз, хронічний мієлолейкоз, хронічний лімфолейкоз, множинна мієлома), карцинома товстої кишки, карцинома прямої кишки, рак підшлункової залози, рак молочної залози, рак яєчників, рак передміхурової залози, нирковоклітинний рак, гепатома, карцинома жовчної протоки, хоріокарцинома, рак шийки матки, рак яєчка, рак легені, карцинома сечового міхура, меланома, рак області голови і шиї, рак головного мозку, ракові пухлини невідомого первинного осередку ураження, неоплазми, ракові пухлини периферичної нервової системи, ракові пухлини центральної нервової системи, пухлини (наприклад, фібросаркома, міксосаркома, ліпосаркома, хондросаркома, остеобластична саркома, хондрома, ангіосаркома, ендотеліосаркома, лімфангіосаркома, лімфангіоендотеліосаркома, синовіома, мезотеліома, пухлина Юінга, лейоміосаркома, рабдоміосаркома, плоскоклітинний рак, базаліома, аденокарцинома, карцинома потових залоз, карцинома сальних залоз, папілярна карцинома, папілярна аденокарцинома, цистаденокарцинома, медулярний рак, бронхогенна карцинома, семінома, ембріональний рак, пухлина Вільмса, дрібноклітинний рак легені, епітеліальна карцинома, гліома, астроцитома, медулобластома, краніофарингіома, епендимома, пінеалома, гемангіобластома, акустична невринома, олігодендрогліома, менінгіома, нейробластома і ретинобластома), хвороба важких ланцюгів, метастази, або будь-яке інше захворювання або порушення, що характеризується неконтрольованим або аномальним клітинним ростом. Термін «карцинома» призначений позначати злоякісну пухлину епітеліального походження. Епітеліальна тканина покриває або вистилає внутрішні і зовнішні поверхні тіла. Прикладами епітеліальної тканини є шкіра, слизова оболонка і серозна оболонка, які вистилають порожнини тіла і внутрішні органи, такі як кишечник, сечовий міхур, матка і тому подібне. Епітеліальна тканина також може тягнутися в більш глибокі шари тканин для утворення залоз, наприклад, залоз, секретуючих слиз. 29 Термін «саркома» призначений позначати злоякісну пухлину, що виросла із з'єднувальної тканини, як наприклад хрящ, жир, м'язи, сухожилля і кістки. Термін «гліома», як використовується тут, призначений позначати злоякісну пухлину, що походить з гліальних клітин. При використанні олігонуклеотиду LNA за даним винаходом або кон'югата за даним винаходом для виробництва лікарського засобу для лікування раку, вказаний рак відповідно може являти собою солідну пухлину. Крім того, вказаний рак також відповідає карциномі. Дана карцинома звичайно вибрана з групи, яка включає злоякісну меланому, базаліому, карциному яєчників, карциному молочної залози, недрібноклітинний рак легень, нирковоклітинний рак, карциному сечового міхура, рецидивуючий поверхневий рак сечового міхура, карциному шлунка, карциному передміхурової залози, карциному підшлункової залози, карциному легені, карциному шийки матки, дисплазію шийки матки, ларингеальний папіломатоз, карциному товстої кишки, колоректальну карциному і карциноїдні пухлини. Більш типово, вказана карцинома відібрана з групи, яка включає злоякісну меланому, недрібноклітинний рак легені, рак молочної залози, рак товстої кишки і нирковоклітинний рак. Злоякісна меланома звичайно відібрана з групи, яка включає поверхневу велику меланому, вузликову меланому, лентиго злоякісну меланому, акральну меланому, амелонотичну меланому і десмопластичну меланому. Альтернативно, рак може являти собою саркому. Форма саркоми звичайно вибрана з групи, яка включає остеосаркому, саркому Юінга, хондросаркому, злоякісну фіброзну гістіоцитому, фібросаркому і саркому Капоши. Альтернативно рак може являти собою гліому. Також вважається, що олігонуклеотиди LNA і кон'югати, визначені тут, особливо корисні при лікуванні злоякісного новоутворення, вибраного з групи, яка включає множинну мієлому, рак нирки, рак шийки матки, рак головного мозку і рак молочної залози. Даний винахід також належить до способу лікування раку, який включає введення олігонуклеотиду LNA, як визначено тут, або кон'югата, як визначено тут, або фармацевтичної композиції, як визначено тут, в організм хворого, який потребує такого лікування. У одному варіанті, злоякісне новоутворення знаходиться в формі солідної пухлини. Солідним раком може бути карцинома або саркома, або гліома, як обговорювалося вище. Відповідно, ще один аспект даного винаходу належить до використання олігонуклеотиду LNA, як визначено тут, або кон'югата, як визначено тут, при виробництві лікарського засобу для лікування раку, де вказаний лікарський засіб додатково містить хіміотерапевтичний агент, вибраний з тих, які вище визначені в розділі «Комбіновані лікарські засоби». Відповідно, додатковий хіміотерапевтичний агент вибраний з таксанів, таких як Таксол, Паклітаксел або Доцетаксел. Альтернативно заявлено, даний винахід додатково належить до способу лікування раку, який 93188 30 включає введення олігонуклеотиду LNA, як визначено тут, або кон'югата, як визначено тут, або фармацевтичної композиції, як визначено тут, в організм хворого, який потребує такого лікування, і додатково включає введення додаткового хіміотерапевтичного агента. Вказане додаткове введення може бути таким, що даний додатковий хіміотерапевтичний агент є кон'югованим з олігонуклеотидом LNA за даним винаходом, входить до складу фармацевтичної композиції або застосовується в окремій композиції. У переважному варіанті здійснення, даний винахід належить до фармацевтичних композицій, які містять (а) одну або декілька антисмислових сполук, (b) один або декілька інших хіміотерапевтичних агентів, які запобігають деполімеризації мікротрубочок і формування натягнення в центромерах сестринських хроматид, але не прикріплення мікротрубочок до центромерів. Такі хіміотерапевтичні агенти включають таксани, як визначено вище, зокрема, Таксол, Паклітаксел і Доцетаксел. При використанні з олігонуклеотидами LNA за даним винаходом, такі хіміотерапевтичні агенти потрібно застосовувати послідовно з лікуванням олігонуклеотидом протягом періоду часу, в якому відбувається сенсибілізація клітин-мішеней до подальшого спільного лікування за допомогою хіміотерапевтичного агента, за допомогою зниження рівня білка HIF-lct в пухлинних клітинах і проліферуючих ендотеліальних клітин судинної системи пухлини. У іншому переважному варіанті здійснення, лікування з використанням олігонуклеотиду LNA за даним винаходом поєднується з променевою терапією. При використанні з нуклеотидами LNA за даним винаходом, променеву терапію потрібно застосовувати послідовно з лікуванням олігонуклеотидом протягом періоду часу, в якому відбувається сенсибілізація клітин-мішеней до подальшої додаткової променевої терапії, за допомогою зниження рівня білка HIF-1α в пухлинних клітинах і проліферуючих ендотеліальних клітин судинної системи пухлини. Олігонуклеотиди LNA за даним винаходом також можна застосовувати як експериментальні реагенти для діагностики, лікування і профілактики. При дослідженні дані антисмислові олігонуклеотиди можна використовувати для специфічного інгібування синтезу генів HIF-1α в клітинах і у експериментальних тварин, таким чином, полегшуючи функціональний аналіз мішені або оцінку її придатності як мішені для терапевтичного впливу. У діагностичних цілях антисмислові олігонуклеотиди можна використовувати для визначення і проведення кількісного аналізу експресії HIF-1α в клітині і тканинах за допомогою нозерн-блотингу, гібридизації in situ або подібних технологічних прийомів. Для терапевтичних цілей, тварину або людину, у якої передбачається наявність захворювання або порушення, яке можна лікувати за допомогою модулювання експресії HIF-1α, лікують за допомогою застосування антисмислового олігонуклеотиду LNA за даним винаходом. Додатково забезпечені способи лікування тварин, зокрема мишей і щурів, і лікування людини, у якої підозрюється наявність 31 або схильність до захворювання або стану, пов'язаного з експресією HIF-1а, за допомогою введення терапевтично або профілактично ефективної кількості одного або декількох антисмислових олігонуклеотидів LNA або кон'югатів, або фармацевтичних композицій за даним винаходом. Ще один аспект даного винаходу належить до способу індукції апоптозу, який включає введення олігонуклеотиду LNA, як визначено тут, кон'югата, як визначено тут, або фармацевтичної композиції, як визначено тут. Індукція апоптозу може бути in vitro або in vivo. Індукція може бути виконана в клітинному аналізі або в зразку тканини, або організмі живого ссавця. Пов'язаний аспект даного винаходу належить до способу запобігання клітинній проліферації, який включає введення олігонуклеотиду LNA, як визначено тут, або кон'югата, як визначено тут, або фармацевтичної композиції, як визначено тут. Запобігання проліферації може бути in vitro або in vivo. Запобігання може бути виконане в клітинному аналізі або в зразку тканини, або організмі живого ссавця. Більше того, даний винахід також належить до способу лікування ангіогенного захворювання, який включає введення олігонуклеотиду LNA, як визначено тут, або кон'югата, як визначено тут, або фармацевтичної композиції, як визначено тут, так що інгібується ангіогенез, пов'язаний з ангіогенним захворюванням. У одному варіанті здійснення ангіогенне захворювання включає пухлину, викликану раком; також дивись вище. Рак переважно вибраний з групи, яка включає рак молочної залози, рак легені, рак області голови і шиї, рак головного мозку, абдомінальний рак, рак товстої кишки, колоректальний рак, рак стравоходу, гастроінтестинальний рак, гліому, рак печінки, рак язика, нейробластому, остеосаркому, рак яєчника, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, ретинобластому, пухлину Вільмса, множинну мієлому, рак шкіри, лімфому і рак крові. Альтернативно, рак вибраний з групи, яка включає множинну мієлому, рак нирки, рак шийки матки, рак товстої кишки, рак головного мозку і рак молочної залози. Ангіогенне захворювання також може бути вибране з групи, яка включає діабетичну ретинопатію, дегенерацію жовтої плями і запальні захворювання. Зокрема, ангіогенне захворювання являє собою запальне захворювання, вибране із запального захворювання кишечнику, псоріазу і ревматоїдного артриту. Вважається, що лікування дегенерації жовтої плями є надзвичайно доречним з використанням олігонуклеотидів за даним винаходом. Набори Якщо є небезпека піддати фармацевтичну композицію в рідкій формі умовам, при яких ставиться під загрозу стабільність олігонуклеотиду LNA, може бути переважне виробництво готового продукту, який містить олігонуклеотид LNA в твердій формі, наприклад у вигляді ліофілізованої речовини, і зберігати продукт в такій твердій формі. Потім продукт перед введенням може бути відно 93188 32 влений (наприклад, розчинений або суспендований) в фізіологічному розчині або в забуференому фізіологічному розчині, і готовий для використання. Таким чином, даний винахід також належить до набору, який містить (a) перший компонент, що містить олігонуклеотид LNA або кон'югат, як указано вище, в твердій формі, і (b) другий компонент, що містить фізіологічний розчин або буферний розчин (наприклад, забуферений фізіологічний розчин), адаптований для відновлення (наприклад, розчинення або суспендування) вказаного олігонуклеотиду LNA. Переважно, вказаний фізіологічний розчин або забуферений фізіологічний розчин має значення рН в діапазоні 4,0-8,5, і моляльність 20-2000мМ. У переважному варіанті здійснення фізіологічний розчин або забуферений фізіологічний розчин має значення рН в діапазоні 6,0-8,0, і моляльність 100500мМ. У найбільш переважному варіанті здійснення фізіологічний розчин або забуферений фізіологічний розчин має значення рН в діапазоні 7,08,0, і моляльність 120-250мМ. Для такого набору олігонуклеотид LNA переважно вибраний з групи, яка містить послідовності SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №15, SEQ ID №16, SEQ ID №17 і SEQ ID №18. Конкретніше, олігонуклеотид LNA вибраний з групи, яка містить послідовності SEQ ID №1 і SEQ ID №2. Даний винахід далі ілюструється в необмежувальній манері наступними прикладами. Експериментальна частина Приклад 1: синтез мономера Елементарні ланки мономера LNA і його похідні одержували, додержуючись опублікованих технологічних процедур і рекомендацій, процитованих там, дивись, наприклад, WO 03/095467 А1 і D.S. Pedersen, С. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808. Приклад 2: синтез олігонуклеотиду Олігонуклеотиди синтезували, використовуючи фосфорамідитний спосіб, на синтезаторі Expedite 8900/MOSS (Multiple Oligonucleotide Synthesis System) на рівні 1ммоль або 15ммоль. Для синтезу великого розміру використовували Akta Oligo Pilot. По закінченні синтезу (DMT-on), олігонуклеотиди відщеплювали з твердофазної підкладки, використовуючи водний розчин аміаку, протягом 1-2 годин при кімнатній температурі, і далі знімали захисні групи протягом 4 годин при 65°С. Олігонуклеотиди очищали за допомогою ВЕРХ з оберненою фазою (RP-HPLC). Після видалення DMT-груп, одержували характеристики олігонуклеотидів за допомогою AE-HPLC, RP-HPLC, і CGE, і молекулярну масу додатково вивіряли за допомогою мас-спектрометрії і іонізацією розпиленням (ESI-MS). Більш детально дивись нижче. Підготовка LNA-твердофазної підкладки: Одержання сукциніл напівефіру LNA Мономер 5'-O-Dmt-3'-гідpокси-LNA (500мг), янтарний ангідрид (1,2 грам-еквівалент) і DMAP (1,2 грам-еквівалент) розчиняли в DCM (35мл). Реакційну суміш перемішували при кімнатній темпера 33 турі протягом ночі. Після екстрагування з використанням NaH2PO4 0,1Μ рΗ5,5 (2х) і сольового розчину (1х), органічний шар потім висушували з використанням безводного Na2SO4, фільтрували і випаровували. Похідну сполуку напівефіру одержували з виходом 95% і використовували без будь-якого подальшого очищення. Одержання підкладки LNA Одержану вище похідну сполуку напівефіру (90мкмоль) розчиняли в мінімальній кількості DMF, додавали DIEA і руВОР (90мкмоль), перемішували разом протягом 1хв. Цю передактивізовану суміш з'єднували з LCAA-CPG (500 А, розмір комірки 80120, 300мг) в ручному синтезаторі і перемішували. Після 1,5 годин при кімнатній температурі, дану підкладку фільтрували і відмивали, використовуючи DMF, DCM і МеОН. Після висушування навантаження визначали рівною 57 мкмоль/г (див. Tom Brown, Dorcas J.S. Brown. Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis. In: F.Eckstein, editor. Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991: 13-14). Подовження олігонуклеотиду Сполучання фосфорамідитів (A(bz), G(ibu), 5метил-С(bz)) або Τ-β-ціаноетилфосфорамідит) здійснювали, використовуючи 0,1Μ розчин 5'-ODMT-захищеного амідиту в ацетонітрилі і DCI (4,5диціаноімідазол) в ацетонітрилі (0,25М) як актива 93188 34 тор. Тіолування проводили, використовуючи ксантан хлорид (0,01Μ в ацетонітрилі: піридин 10%). Інші реагенти такі, які звичайно використовуються для синтезу олігонуклеотидів. Протокол, передбачений постачальником, був оптимізований. Очищення за допомогою ВЕРХ з оберненою фазою: колонка: швидкість струму: буфери: Абревіатури DMT: DCI: DMAP: DCM: DMF: THF: DIEA: РуВОР: Βz: Ibu: Xterra RPi8 3мл/хв. 0,1М ацетат амонію рН8 і ацетонітрил диметокситритил 4,5-диціаноімідазол 4-диметиламінопіридин дихлорметан диметилформамід тетрагідрофуран Ν,Ν-діізопропілетиламін бензотриазол-1-ілокси-триспіролідинофосфоній гексафторфосфат бензоїл ізобутирил Приклад 3: конструкція олігонуклеотидів LNA 35 93188 36 У Таблиці 1 заголовними буквами позначений аналог нуклеотиду β-D-окси-LNA (β-D-окси-LNA), малими буквами позначені 2-дезоксинуклеотиди, підкресленням позначений або аналог нуклеотиду бета-D-окси-LNA, або 2-дезоксинуклеотид, підрядковим індексом «s» позначений фосфоротіоатний зв'язок між сусідніми нуклеотидами/аналогами нуклеотиду LNA, відсутність підрядкового індексу між сусідніми нуклеотидами/аналогами нуклеотиду LNA означає фосфодіефірний зв'язок, і підрядковим індексом «х» позначений або фосфоротіоатний зв'язок, або фосфодіефірний зв'язок між сусідніми нуклеотидами/аналогами нуклеотиду LNA, і де нуклеотидні одиниці в дужках (Тх), (Т) або (Gx), (А), відповідно, являють собою необов'язкові одиниці. Всі мономери C-LNA є 5-метил-С (МеС). Обчислення температури плавлення (Тm) сполук: Змішували 3мкМ розчину сполуки по послідовності SEQ ID №1 в 10мМ фосфаті натрію/100мМ NaCl/0,1нМ ЕДТО, рН7,0 з 3мкМ його комплементу ДНК/РНК в 10мМ фосфаті натрію/100мМ NaCl/0,1нМ ЕДТО, рН7,0 при 90°С протягом хвилини і охолоджували при кімнатній температурі. Потім визначали Тm даного дуплекса по підвищенню температури на 1°С/хв. від 25 до 95°С. Тm сполуки по послідовності SEQ ID №1 представлена в Таблиці 2 нижче: Приклад 4: стабільність олігонуклеотидів LNA в плазмі крові людини або щура Стабільність олігонуклеотиду LNA перевіряли в плазмі крові людини або щурів (також може бути плазма крові миші, мавпи або собаки). До 45мкл плазми кров додавали 5мкл олігонуклеотиду LNA (кінцева концентрація 20мкМ). Дані олігонуклеотиди LNA інкубували в плазмі крові протягом часового діапазону від 0 до 96 годин при 37°С (дану плазму перевіряли на нуклеазну активність аж до 96 годин і не виявлено ніякої відмінності в характері розщеплення нуклеазами). У вказаний час зразки миттєво заморожували в рідкому азоті. 2мкл (еквівалент 40пмоль) олігонуклеотиду LNA в плазмі розбавляли додаванням 15мкл води і 3мкл 6кратного навантажувального барвника (Invitrogen). Як маркер молекулярної ваги використовували 10 bp ladder (In vitrogen 10821-015). До 1мкл маркера молекулярної ваги додавали 1мкл 6-кратного барвника і 4мкл води. Дані зразки змішували, витримували при 65°С протягом 10хв. і наносили на передстартовий гель (16% акриламід, 7Μ сечовина, їх ТВЕ, заздалегідь піддавали електрофорезу при 50Ват протягом 1год.) і проводили електрофорез при 50-60 Ват протягом 21/2 годин. Потім гель забарвлювали з використанням 1-кратного SyBR gold (молекулярні зонди) в 1-кратному ТВЕ протягом 15хв. Смуги візуалізували, використовуючи фосфоімаджер фірми Biorad (див. Фіг.1А для плазми крові щура і Фіг.1В для плазми крові людини і щура). Стабільність олігонуклеотиду LNA перевіряли в плазмі крові людини (також може бути плазма крові щура, миші, мавпи або собаки). Олігонуклеотид LNA в кінцевій концентрації 20мкМ (між 1 і 5мкл) додавали до загального об'єму 20мкл плазми крові і інкубували протягом часового діапазону від 0 до 24 годин (можна інкубувати до 72 годин дану плазму перевіряли на нуклеазну активність аж до 72 годин і не виявлено ніякої відмінності в характері розщеплення нуклеазами). У вказаний час дані зразки зберігали при -80°С. 1мкл (еквіва лент 20пмоль) олігонуклеотиду LNA в плазмі крові розбавляли в 10 разів водою і проводили електрофорез в гелі, що містить 16% акриламід, 7Μ сечовину з маркером молекулярної ваги 10 bp ladder (виробник In vitrogen (каталожний №10821015)). Гель піддавали електрофорезу при приблизно 40 Ватах протягом 2-3 годин, а потім забарвлювали за допомогою 1-кратного SyBR gold (молекулярні зонди) в 1-кратному ТВЕ протягом 15 хвилин. Смуги візуалізували, використовуючи фосфоімаджер фірми Biorad (див. Фіг.1). Приклад 5: Модель In vitro: клітинна культура Дія олігонуклеотидів LNA на експресію нуклеїнової кислоти-мішені можна перевірити на різноманітних клітинних типах, тільки при умові наявності рівнів нуклеїнової кислоти-мішені, що піддаються вимірюванню. Мішень може бути експресована ендогенно або за допомогою тимчасової або стабільної трансфекції нуклеїнової кислоти, що кодує вказану нуклеїнову кислоту. Рівень експресії нуклеїнової кислоти-мішені можна визначити звичайним способом, використовуючи, наприклад, нозерн-блотинг, кількісну ПЛР, аналіз із захистом від рибонуклеаз. Наступні клітинні типи наведені з метою ілюстрації, але інші клітинні типи можна використовувати в звичайному способі, тільки при умові, що дана мішень експресується вибраним клітинним типом. Клітини культивували у відповідному середовищі, як описано нижче, і підтримували при 37°С, при вологості 95-98% і 5% СО2. Коли культивували в умовах гіпоксії або аноксії рівні О2 підтримували на 1-2% або 0-0,5%, відповідно. Клітини звичайним способом пасирували 2-3 рази щотижня. 15РС3: Клітинна лінія раку передміхурової залози людини 15РС3 була люб'язно надана лікарем F. Baas, Neurozintuigen Laboratory, AMC, The Netherlands, і була культивована в DMEM (Sigma) +10% ембріональна бичача сироватка (FBS) +Глутамакс І +гентаміцин. РС3: Клітинну лінію раку передміхурової залози людини РСЗ, придбану у АТСС, інкубували в 37 середовищі F12 Куна з глутаміном (Gibco) +10% FBS +гентаміцин. 518A2: Клітинна лінія меланоми людини 518А2 люб'язно надана лікарем В. Jansen, Section of experimental Oncology, Molecular Pharmacology, Department of Clinical Pharmacology, University of Vienna, була культивована в DMEM (Sigma) +10% ембріональна бичача сироватка (FBS) +Глутамакс І +гентаміцин. U373: Клітини гліобластоми U373 культивували в ЕМЕМ (Sigma), що містить 10% ембріональну бичачу сироватку плюс Глутамакс І, NEAA, піруват натрію і гентаміцин, при 37°С, вологість 95% і 5% СО2. HeLa: Клітинну лінію карциноми шийки матки HeLa культивували в MEM (Sigma), що містить 10% ембріональну бичачу сироватку плюс гентаміцин, при 37°С, вологість 95% і 5% СО2. МРС-11: Клітинну лінію множинної мієломи мишоподібних МРС-11, куплену у АТСС, підтримували в DMEM з 4мМ Глутамакс +10% сироватки коня. DU-145: Клітинну лінію раку передміхурової залози людини DU-145, куплену у АТСС, підтримували в RPMI з Глутамакс +10% FBS. RCC-4+/-VHL: Клітинну лінію раку нирки людини RCC4 стабільно трансфековану плазмідою, що експресує VHL або пустою плазмідою, куплену у ЕСАСС, підтримували відповідно до інструкцій фірми-виробника. 786-0: Клітинну лінію нирковоклітинного раку людини 786-0, куплену у АТСС, підтримували відповідно до інструкцій фірми-виробника. HUVEC: Клітинну лінію ендотелію пупкової вени людини HUVEC, куплену у Camcrex, підтримували в середовищі EGM-2. K562: Клітинну лінію хронічної мієломної лейкемії людини K562, куплену у ЕСАСС, підтримували в RPMI з Глутамакс +10% FBS. U87MG: Клітинну лінію гліобластоми людини U87MG, куплену у АТСС. підтримували відповідно до інструкцій фірми-виробника. В16: Клітинну лінію меланоми В16 мишоподібних, куплену у АТСС, підтримували відповідно до інструкцій фірми-виробника. LNCap: Клітинну лінію раку передміхурової залози людини LNCap, куплену у АТСС, підтримували в RPMI з Глутамакс +10% FBS Приклад 6: Модель In vitro: обробка антисмисловим олігонуклеотидом Вирощування клітин і трансфекції: клітини U373 або HeLa висівали на 12-ямкові планшети при 37°С, (5% СО2) в середовище для вирощування D, доповнене 10% FBS, Глутамаксом І і гентаміцином. Коли клітини були конфлюентними на 6070%, їх трансфекували в двох екземплярах олігонуклеотидами в різних концентраціях (0,2-100нМ), використовуючи Ліпофектамін 2000 (2,5-5мкг/мл). Трансфекції проводили по суті, як описано у Dean et al. (1994, JBC 269: 16416-16424). Коротко, клітини інкубували протягом 10хв. з Ліпофектаміном в OptiMEM, з подальшим додаванням олігонуклеотиду до загального об'єму трансфекційної суміші 0,5мл на ямку. Через 4 години дану трансфекційну суміш видаляли, клітини відмивали і вирощували 93188 38 при 37°С протягом приблизно 20 годин (аналіз мРНК і білковий аналіз) в умовах або нормального вмісту кисню, або в умовах гіпоксії, у відповідному середовищі для вирощування. Потім клітини збирали для білкового аналізу і аналізу РНК. Приклад 7: Модель in vitro: Виділення РНК і синтез кДНК Виділення загальної РНК Тотальну РНК виділяли або використовуючи міні-набір RNeasy (Qiagen, каталожний №74104), або використовуючи реагент тризол (Life technologies, каталожний №15596). Для виділення тотальної РНК, з використанням міні-набору RNeasy (Qiagen), клітини відмивали за допомогою PBS, і додавали буфер для лізису клітин (RTL, Qiagen), доповнений 1% меркаптоетанолом, прямо в ямки. Через декілька хвилин зразки обробляли згідно з інструкціями виробника. Зразки тканин гомогенізували, використовуючи гомогенізатор Retsch 300ММ, і тотальну РНК виділяли, використовуючи реагент тризол або мінінабір RNeasy, як описано виробником. Синтез першого ланцюга Синтез першого ланцюга здійснювали, використовуючи або набір із зворотною транскриптазою OmniScript, або зворотну транскриптазу MMLV (по суті описано виробником (Ambion)) згідно з інструкціями виробника (Qiagen). Коли використовували зворотну транскриптазу OmniScript, 0,5мкг тотальної РНК кожного зразка доводили до 12мкл і змішували з 0,2мкл полі(dT)12-18 (0,5мкг/мкл) (Life Technologies), 2мкл суміші dNTP (5мМ кожного), 2мкл 10-кратного буфера RT, 0,5мкл інгібітора РНкази RNAguard™ (33одиниці/мл, Amersham) і 1мкл зворотної транскриптази OmniScript, з подальшим інкубуванням при 37°С протягом 60хв. і інактивацією нагріванням до 93°С протягом 5хв. Коли синтез першого ланцюга здійснювали з використанням довільних декамерів і зворотної транскриптази M-MLV (по суті описано виробником (Ambion)) 0,25мкг тотальної РНК кожного зразка доводили до 10,8мкл в Н2О. Додавали 2мкл декамерів і 2мкл суміші dNTP (2,5мМ кожного). Зразки витримували при 70°С протягом 3хв., миттєво охолоджували в льодяній воді і додавали 3,25мкл суміші, що містить 2мкл 10-кратного буфера RT; 1мкл зворотної транскриптази M-MLV; 0,25мкл інгібітора RNAase. Синтезували кДНК при 42°С протягом 60хв., з подальшим етапом інактивації нагріванням при 95°С протягом 10хв. і на закінчення охолоджували до 4°С. Приклад 8: моделі in vitro і in vivo: Аналіз інгібування олігонуклеотидом експресії HIF-1α за допомогою ПЛР в режимі реального часу Антисмислову модуляцію експресії HIF-1α можна дослідити з використанням множини способів, відомих в рівні техніки. Так, кількісний аналіз рівнів мРНК HIF-1α можна провести, наприклад, за допомогою нозерн-блотингу, конкурентної полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), аналізу за допомогою захисту від рибонуклеаз (RPA) або ПЛР в режимі реального часу. Кількісна ПЛР в режимі реального часу на цей час переважна. Аналіз РНК 39 можна здійснити в тотальній клітинній РНК або в мРНК. Способи виділення РНК і аналізу РНК, наприклад нозерн-блотинг, є звичайними в рівні техніки, і описані, наприклад, в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons. Кількісну ПЛР в режимі реального часу можна виконати, використовуючи комерційно доступну систему виявлення iQ Multi-Color Real Time PCR, що є в наявності у фірми BioRAD. Аналіз рівнів мРНК HIF-1α за допомогою кількісної ПЛР в режимі реального часу Кількісна оцінка рівнів мРНК проводилася за допомогою кількісної ПЛР в режимі реального часу, з використанням системи виявлення iQ MultiColor Real Time PCR Detection System (BioRAD), згідно з інструкціями виробника. Кількісна ПЛР в режимі реального часу є добре відомою в рівні техніки методикою і описана, наприклад у Heid et al. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6:986-994. 2-кратна базова ПЛР суміш Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG була придбана у Invitrogen каталожний №11730. Праймери і зонди TaqMan® були придбані у MWG-Biotech AG, Ebersberg, Germany. Кількість гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази (GAPDH), 18S РНК або мРНК β-актину використовували як ендогенний контроль для нормалізації будь-яких відхилень при одержанні зразка. Вміст мРНК GAPDH людини в даному зразку кількісно визначали, використовуючи реагент human GAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay (Applied Biosystems каталожний №4310884E), згідно з інструкціями виробника. ПЛР-праймери для HIF-1α людини були наступні: прямий праймер: 5'CTCATCCAAGAAGCCCTAACGTGTT-3' (SEQ ID №21) (кінцева концентрація в пробі 0,9мкМ) зворотний праймер: 5'GCTTTCTCTGAGCATTCTGCAAAGC-3' (SEQ ID №22) (кінцева концентрація в пробі 0,9мкМ) і ПЛРзонд був: 5'FАМCCTCAGGAACTGTAGTTCTTTGACTCAAAGCGAC A-TAMRA 3' (SEQ ID №23) (кінцева концентрація в пробі 0,1мкМ). Для HIF-1α людиноподібних мавп, ПЛРпраймери були: І прямий праймер: 5'GCTTACCATCAGCTATTTGCGTGTG-3' (кінцева концентрація в пробі 0,9мкМ) (SEQ ID №24) зворотний праймер: 5'GAACCATAACAAAACCATCCAAGGC-3' (SEQ ID №25) (кінцева концентрація в пробі 0,9мкМ) і ПЛРзонд був: 5'FАМTCATCTTCAATATCCAAATCACCAGCATCCAGAAG -TAMRA 3' (SEQ ID №26) (кінцева концентрація в пробі 0,1мкМ). 93188 40 Для кількісного визначення 18S рибосомальної РНК, використовували ендогенний контрольний реагент TaqMan Eukaryotic 18S rRNA, (PART №4310875, Applied Biosystems), згідно з інструкціями виробника. Для кількісного визначення мРНК GAPDH миші сконструювали наступні праймери і зонди: Прямий праймер 5'AAGGCTGTGGGCAAGGTCATC-3' (SEQ ID №27) (кінцева концентрація 0,3мкМ), Зворотний праймер 5'GTCAGATCCACGACGGACACATT-3' (SEQ ID №28) (кінцева концентрація 0,6мкМ), Зонд TaqMan 5'-FAMGAAGCTCACTGGCATGGCATGGCCTTCCGTGTTC -TAMRA-3' (SEQ ID №29) (кінцева концентрація 0,2мкМ). ПЛР в режимі реального часу з використанням зондів TaqMan кДНК синтезованого першого ланцюга, одержану, як описано в прикладі 6, розбавляли в 2-20 разів, і аналізували, використовуючи кількісну ПЛР в режимі реального часу. Дані праймери і зонд змішували с 2-кратною сумішшю Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG (каталожний №11730, Invitrogen) і додавали до 3,3мкл кДНК до кінцевого об'єму 25мкл. Кожний зразок аналізували три рази. Аналізуючи 2-кратні розбавлення кДНК, одержаної з матеріалу, очищеного з клітинної лінії, що експресує РНК, яка представляє інтерес, одержували калібрувальну криву для даних аналізів. Як контрольну матрицю замість кДНК використовували стерильну Н2О. Програма ПЛР: 50°С протягом 2 хвилин, 95°С протягом 10 хвилин, з подальшими 40 циклами 95°С, 15 секунд, 60°С, 1 хвилина. Відносні величини послідовності мРНК-мішени визначали виходячи з вирахуваного порогового циклу, використовуючи програмне забезпечення iCycler iQ Real-time Detection System (див. Фіг.2). ПЛР в режимі реального часу SyBR Green Для визначення відносного рівня мРНК HIF-1α миші використовували кДНК в кількісному ПЛР аналізі, із застосуванням iCycler фірми BioRad. До 8мкл кДНК, розведеної в 5 разів, додавали 52мкл суміші, що містить 29,5мкл Platinum qPCR, Supermix-UDG (in-vitrogen), 1030нМ кожного праймеру, 0,57 X SYBR Green (молекулярні зонди) і 11,4нМ флуоресцину (молекулярні зонди). Для Q-PCR використовували дублікати проб по 25мкл: 50°С протягом 120сек., 95°С протягом 120сек. і 40 циклів [95°С протягом 30сек. і 60°С протягом 60сек.]. Експресію мРНК HIF1α нормалізували по мРНК β-актину миші, яка була схожим чином кількісно визначена, використовуючи Q-PCR. 41 Для одержання калібрувальної кривої в аналізі використовували 2-кратне розведення кДНК, синтезованої з необроблених фібробластів мишей (клітини Ltk) (розведені в 5 разів і експресуючі і HIF1α, і β-актин). Відносні кількості мРНК HIF1α визначали виходячи з обчисленого порогового циклу, використовуючи програмне забезпечення iCycler iQ Real Time Detection System. Приклад 9: Аналіз in vitro: аналіз рівнів білка HIF-1α з використанням вестерн-блотингу Дію олігонуклеотидів LNA in vitro гена HIF-1α на рівні білка HIF-1α в трансфекованих клітинах визначали за допомогою вестерн-блотингу. Клітини збирали і лізували, використовуючи 50мМ Тріс-НСІ рН6,8, 10% гліцерол, 2,5% SDS, 5мМ DTT і 6Μ сечовину, з додаванням суміші інгібіторів протеаз (Roche). Концентрації загального білка вимірювали, використовуючи набір для білкового аналізу БСА (Pierce). Проводили електрофорез 20-100мкг загального білка в 10-12% бістрис гелях в буфері MOPS або в 3-8% трисацетатних гелях, і робили відбитки на мембранах PVDF, згідно з інструкціями виробника (Invitrogen). Після інкубування протягом ночі в блокувальному буфері (PBS-T, доповнений 5% молочним порошком з низьким вмістом жиру), дані мембрани інкубували протягом ночі з антитілом проти HIF-1α, антитілом проти Всl-2, антитілом проти VEGF або антитілами, що виявляють інші 5'-3' напрями HIF1α. Як контроль навантаження визначали тубулін або актин, використовуючи моноклональні антитіла, одержані у Neomarker. Потім мембрани інкубували з вторинними антитілами і візуалізували HIF1α, використовуючи набір для хромогенного імуноаналізу (Invitrogen) або набір для виявлення хемілюмінесценції ECL+ (Amersham) (див. Фіг.2А і Фіг.2В). Приклад 10: Аналіз in vitro: антисмислове інгібування експресії HIF-1α людини, з використанням антисмислових олігонуклеотидів і їх дія на мішені в 5'-3' напрямі VEGFA і ММР-2 Олігонуклеотиди LNA дійсно здійснюють дію на мішені в 5'-3' напрямі VEGFA і ММР-2 в середовищі, одержаному від клітин U373. Клітини U373 щільністю 0,3×106 клітин висівали у флакони Т25 (аналіз часових характеристик) або 0,6×106 клітин у флакони Т80 (48-часовий аналіз концентрацій). Клітини U373 при 37°С (5% СО2) помішували в середовище для вирощування, доповнене 10% FBS, Глутамаксом І і гентаміцином. На наступний день після висівання клітини трансфекували оліго 93188 42 нуклеотидами LNA в двох або трьох екземплярах, використовуючи різні концентрації олігонуклеотидів (0,2-10нМ), за допомогою Ліпофектаміну 2000 (2,5мкг/мл). Трансфекції проводили по суті як описано у Dean et al. (1994, JBC 269: 16416-16424). Коротко, клітини інкубували протягом 10хв. з Ліпофектаміном в OptiMEM, з подальшим додаванням олігонуклеотиду. Через 4 години дану трансфекційну суміш видаляли, клітини відмивали і вирощували при 37°С протягом приблизно 20 годин (аналіз мРНК і білковий аналіз) в умовах або з нормальним вмістом кисню, або в умовах гіпоксії, у відповідному середовищі для вирощування. Супернатанти від клітин збирали у визначений час. Додаткові інгібітори протеаз додавали перед поміщенням на зберігання при -80°С. Застосовували ELISA VEGFA людини (каталожний №DVE-00) і ELISA ММР-2 (каталожний №DMP-200) від RD systems, згідно з інструкціями виробника. У залежності від часу збору, супернатант розбавляли в 550 разів перед вимірюванням. Див. Фіг.12А- Е. Приклад 11: індукція апоптозу за допомогою олігонуклеотидів LNA Вирощування клітин Клітинну лінію гліобластоми U373 (АТСС) вирощували в MEM (Sigma), доповненій 10% ембріональною бичачою сироваткою, Глутамаксом І, NEAA, піруватом натрію і гентаміцином, при 37°С, вологість 95% і 5% СО2. Коли клітини досягали 6070% злиття, клітини трансфекували, використовуючи Ліпофектамін 2000 (2,5мкг/мл). Клітинну лінію раку шийки матки HeLa вирощували в MEM (Sigma), що містить 10% ембріональну бичачу сироватку, гентаміцин, при 37°С, вологість 95% і 5% СО2. Коли клітини досягали 6070% злиття, клітини трансфекували, використовуючи Ліпофектамін 2000 (5мкг/мл). Вимірювання активності активної каспази 3/7 У день перед трансфекцією клітини U373 висівали зі щільністю 7000 клітин на ямку в білий 96ямковий планшет (Nunc 136101) в повну MEM. На наступний день клітини один раз відмивали заздалегідь нагрітою OptiMEM з подальшим додаванням 72мкл OptiMEM, що містить 2,5мкг/мл Ліпофектаміну 2000 (In vitrogen). Клітини інкубували протягом 7хв. перед додаванням 18мкл олігонуклеотидів, розбавлених за допомогою OptiMEM. Кінцева концентрація олігонуклеотиду складала від 0,2нМ до 100нМ. Після 6 годин обробки клітини відмивали за допомогою OptiMEM, і додавали 100мкл DMEM, що містить сироватку. Схожим чи 43 ном 96-ямкові планшети з обробленими клітинами U373 культивували в умовах з нормальним вмістом кисню або в умовах гіпоксія/аноксія, за допомогою поміщення даних 96-ямкових планшетів в мішок для культивування без повітря (Merck) до моменту збирання. У визначений час планшети врівноважували до кімнатної температури протягом часу. Додавали 100мкл реагенту високочутливої каспази 3/7-GIoTM (Promega) прямо до клітин в 96-ямковий планшет і планшети інкубували протягом 1 години перед визначенням люмінесценції (активність люциферази) за допомогою інструмента Luminoskan Ascent фірми Thermo Labsystems після додаткового лаг-періоду 1хв. Активність люциферази вимірювали у відносних одиницях освітленості за секунду (RLU/c). Дані обробляли з використанням програмного забезпечення Ascent software 2.4.2. і будували графіки залежності кратності індукції відносно плацебо в програмі Excel. Трансфековані клітини, інкубовані з інгібітором каспази 3/7, який блокує активність активної каспази 3/7, використовували для демонстрації специфічності апоптотичної реакції. Крім того, клітини, індуковані стауроспорином, камптотецином або таксолом, служили як позитивний контроль (див. Фіг.3А і Фіг.3В.). Аналіз анексин V-FITC з використанням проточної цитометрії Клітини HeLa щільністю 1×106 висівали у флакони Т75 за день до трансфекції. У день проведення трансфекції, клітини відмивали один раз за допомогою 37°С OptiMEM, з подальшим додаванням 7мл OptiMEM, що містить 2,5мкг/мл Ліпофектаміну 2000 (In vitrogen). Клітини інкубували протягом 7хв. перед додаванням 1700мкл олігонуклеотидів, розбавлених за допомогою OptiMEM до кінцевої концентрації 1-25нМ. Клітини, трансфековані плацебо, служили як контроль. Після 4 годин обробки, клітини відмивали за допомогою OptiMEM і додавали 10мл середовища для культивування. Після обробки олігонуклеотидами клітини залишали відновлюватися протягом 24-72 годин до моменту збирання за допомогою зскрібання, і відмивали двічі з використанням PBS. Клітини щільністю 2×105 інкубували з 5мкл анексину V-FITC і 10мкл пропідіум йодиду (РІ-10мг/мл), і інкубували протягом 15хв. при кімнатній температурі в темряві. Інкубування трансфекованих клітин з очищеним рекомбінантним анексином V (10мкг) перед додаванням анексину V-FITC використовували для демонстрації специфічності і селективності фарбування. Крім того, клітини HeLa (0,5мкг/мл), індуковані за допомогою TRAIL (Apo2L), використовували як позитивний контроль. Клітини U373 щільністю 0,6×106 висівали у флакони Т75 за один день перед проведенням трансфекції. У день проведення трансфекції, дані клітини один раз відмивали 37°С OptiMEM, потім додавшій 7мл OptiMEM, що містить 2,5мкг/мл Ліпофектаміну 2000 (In vitrogen). Клітини інкубували протягом 7хв. перед додаванням 1700мкл олігонуклеотидів, розбавлених за допомогою OptiMEM до кінцевої концентрації 1-25нМ. Клітини, трансфековані плацебо, використовували як контроль. Після 6 годин обробки, клітини відмивали за допомогою 93188 44 OptiMEM і додавали 10мл середовища для культивування. Після обробки олігонуклеотидами клітини залишали відновлюватися протягом 24-48 годин до моменту збирання за допомогою зскрібання, і відмивали двічі з використанням PBS. Клітини щільністю 2×105 інкубували з 5мкл анексину V-FITC і 10мкл пропідіум йодиду (РІ-10мг/мл) і інкубували протягом 15хв. при кімнатній температурі в темряві. Інкубування трансфекованих клітин з очищеним рекомбінантним анексином V (10мкг) перед додаванням анексину V-FITC використовували для демонстрації специфічності і селективності фарбування. Крім того, клітини U373, індуковані стауроспорином (0,2мкМ), використовували як позитивний контроль (див. Фіг.4А і 4В.). Приклад 12: Інгібування проліферації за допомогою олігонуклеотидів LNA Клітини обробляли згідно з прикладом 11. Визначення проліферації життєздатних клітин (аналіз MTS) Клітини U373 за день перед трансфекцією, висівали зі щільністю 7000 клітин на ямку в чистий 96-ямковий планшет (Scientific Orange №1472030100) в DMEM. На наступний день клітини відмивали один раз заздалегідь зігрітою OptiMEM, з подальшим додаванням 72мкл OptiMEM, що містить 2,5мкг/мл Ліпофектаміну 2000 (Invitrogen). Клітини інкубували протягом 7 хвилин перед додаванням 18мкл олігонуклеотидів, розбавлених за допомогою OptiMEM. Кінцева концентрація олігонуклеотиду складала від 5нМ до 100нМ. Після 6 годин обробки, клітини відмивали за допомогою OptiMEM, і додавали DMEM, що містить 100мкл сироватки. Схожим чином 96ямкові планшети з обробленими клітинами U373, культивували в умовах з нормальним вмістом кисню, або в умовах гіпоксії/аноксії, за допомогою поміщення цих 96-ямкових планшетів в мішки для культивування без повітря (Merck) до моменту збирання. Життєздатні клітини визначали у визначений момент часу за допомогою додавання 20мкл сполуки тетразолію [3-(4,5-диметил-2-іл)-5(3-карбоксиметоксифеніл)-2-(4-сульфофеніл)-2Нтетразолій, внутрішня сіль; MTS] і реагенту електронного перенесення (феназин етосульфат; PES) (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega). Життєздатні клітини визначали при 490нм і 650нм на Powerwave (Biotek Instruments). Інгібування швидкості росту AOD (490650нм)/год. в залежності від концентрації олігонуклеотиду LNA відносно плацебо, якому надавали значення 100% (див. Фіг.5А і 5В). Приклад 13: поглинання in-vivo і направлений супресуючий ефект олігонуклеотидів LNA Мишей hairy обробляли або щодня, або два рази на тиждень (5 разів) протягом 14 днів з використанням внутрішньочеревинних ін'єкцій фізіологічного розчину або сполуки по послідовності SEQ ID №1 і різних тіолованих її варіантів. Сполука по послідовності SEQ ID №5 є частково тіолованою (в гепі), в той час як сполука по послідовності SEQ ID №6 має фосфодіефірний кістяк. Мишей обробляли тотальними дозами 10мг/кг/14 днів, 50мг/кг/14 днів, 45 93188 46 або 250мг/кг/14 днів, які вводили або щодня, або двічі на тиждень. Очищення РНК з синтез кДНК з тканини Приблизно 10мг тканини гомогенізували в 400мкл буфера RTL (Qiagen), доповненого 1% маркаптоетанолом. Тотальну РНК виділяли, використовуючи міні-набір RNeasy (Qiagen), згідно з інструкціями виробника. Синтез першого ланцюга здійснювали, використовуючи довільні декамери і зворотну транскриптазу M-MLV (по суті як описано виробником (Ambion)). Для кожного зразка, 0,25мкг тотальної РНК доводили до 10,8мкл в Н2О. Додавали 2мкл декамерів і 2мкл суміші dNTP (2,5мМ кожного). Зразки витримували при 70°С протягом 3хв., миттєво охолоджували в льодяній водіі додавали 3,25мкл суміші, що містить 2мкл 10-кратного буфера RT; 1мкл зворотної транскриптази M-MLV; 0,25мкл інгібітора RNAase. кДНК синтезували при 42°С протягом 60хв., з подальшим етапом інакти вації нагріванням при 95°С протягом 10хв. і на закінчення охолоджували до 4°С. Кількісна ПЛР в режимі реального часу Для визначення відносного рівня мРНК HIF1α миші в оброблених і необроблених зразках, використовували утворену кДНК в кількісній ПЛР, за допомогою iCycler фірми BioRad. До 8мкл розбавленої в 5 разів кДНК додавали 52мкл суміші, що містить 29,5мкл Platinum qPCR, Supermix-UDG (in-vitrogen), 1030нМ кожного праймеру, 0,57 X SYBR Green (молекулярні зонди) і 11,4нМ флуоресцеїну (молекулярні зонди). У Q-PCR використовували дуплікати по 25мкл: 50°С протягом 120сек., 95°С протягом 120сек. і 40 циклів [95°С протягом 30сек. і 60°С протягом 60сек.]. Експресію мРНК HIF1α нормалізували по мРНК β-актину і/або Gapdh миші, яка була схожим чином кількісно визначена, використовуючи QPCR. Для одержання калібрувальної кривої в аналізі використовували 2-кратне розведення кДНК, синтезованої з необроблених фібробластів мишей (клітини Ltk) (розведені в 5 разів і експресуючі і HIF1α, і β-актин). Відносні кількості мРНК HIF1α визначали виходячи з обчисленого порогового циклу, використовуючи програмне забезпечення iCycler iQ Real Time Detection System. Екстракція олігонуклеотиду LNA з тканини Приблизно 100мг тканини механічно гомогенізували в 500мкл буфера для екстракції (0,5% Ігепал СА-630, 25мМ Тріс рН8,0, 25мМ ЕДТО, 100мМ NaCl, що містить 1мг/мл RNAse А) і інкубували при 37°С протягом ночі. 500мл скріпляли з вихідним олігонуклеотидом і екстрагували за допомогою додавання 1мл суміші фенол-ізоаміл-хлороформ (25:1:24(об./об./об.)). Водну фазу переносили в нову пробірку і екстрагували знов. При необхідності одержаний екстракт був ліофілізований. Аналіз одержаних олігонуклеотидів LNA, з використанням способу ВЕРХ ІЕХ Зразок об'ємом 50мкл розділяли на колонці DNAPac PA-100 (2×250мм, Dionex), обладнаній обмежувальною колонкою DNAPac PA-100 (2×50мм, Dionex). Дані колонки нагрівали до 40°С. Швидкість струму становила 0,25мл/хв. і довжина хвилі визначення становила 260нм. Градієнт пересувної фази А: Тріс (20мМ), ЕДТО (1мМ) і перхло рат натрію (10мМ) рН: 7,6, В: Тріс (20мМ), ЕДТО (1мМ) і перхлорат натрію (1М) рН: 7,6, (0-13хв., А: 20%, В: 20%; 14-18хв., А: 40%, В: 60%; 22-28хв., А 0%, В: 100%; 33-38хв., А: 80%, В: 20%). На Фіг.6А і Фіг.6В показане поглинання in vivo (в мкг на грам тканини) і направлений супресуючий ефект (% інгібування експресії мРНК HIF-1α, приведеної до експресії β-актину, відносно мишей, оброблених фізіологічним розчином, після внутрішньочеревинного введення сполуки по послідовності SEQ ID №1 або щодня, або два рази на тиждень протягом 14 днів (як описано вище)). На Фіг.6С представлений супресуючий ефект на ендогенний HIF-1? нирок in vivo після введення мишам hairy з'єднання по послідовності SEQ ID №1 за допомогою щоденних внутрішньочеревинних ін'єкцій протягом 14 днів. На Фіг.7А показано, що сполука по послідовності SEQ ID №1 є потужним інгібітором експресії HIF-1α в печінці в умовах щоденного введення, що виміряно за допомогою Q-PCR. На Фіг.7В показано, що сполука по послідовності SEQ ID №1 також є потужним інгібітором експресії HIF-1α в печінці в умовах введення два рази на тиждень, що виміряно за допомогою QPCR. На Фіг.7С показано, що сполука по послідовності SEQ ID №1 є потужним інгібітором експресії 47 HIF-1α в нирках в умовах щоденного введення, що виміряно за допомогою Q-PCR. Приклад 14: ефективність послідовності SEQ ID №1 in vivo у мишей, що несуть ксенотрансплантат пухлин U373 Дія обробки олігонуклеотидом на ріст пухлинного ксенотрансплантата мишей nude можна виміряти, використовуючи різні клітинні лінії пухлин. Прикладами таких клітинних ліній є клітинні лінії пухлин людини U87 (гліобластома), U373 (гліобластома), 15РС3 (рак передміхурової залози), РС3 (рак передміхурової залози), DU145 (рак передміхурової залози), LNCap (рак передміхурової залози), і клітинна линія пухлини мишоподібних В16 (меланома). Обробка ксенотрансплантата підшкірної пухлини мишей nude, з використанням олігонуклеотидів LNA. Клітини пухлини імплантували під шкіру, потім періодично пересівали за допомогою трьох послідовних трансплантацій. Фрагменти пухлини розміром 1мМ імплантували під шкіру мишам NMRI nude за допомогою голки трокара. Альтернативно, ракові клітини, звичайно від 10Е6 до 10Е7 клітин, суспендували в 300мкл матригелю (BD Bioscience), вводили за допомогою ін'єкції під шкіру в бік мишей NMRI: nude. Миші піддавалися обробці за допомогою внутрішньочеревинних ін'єкцій 5мг/кг/день. Кожну конкретну обробку мишей починали, коли об'єм пухлини досягав 50мм3. Обробку з використанням PBS починали, коли середній об'єм пухлини в контрольній групі (обробка з використанням фізіологічного розчину) досягала 50мм3. Експеримент закінчувався, коли пухлини в будь-якій групі досягали гранично допустимих розмірів. Розміри пухлин всіх мишей вимірювали щодня за допомогою кавернометрії. Ефект обробки визначали по розміру пухлини і швидкості росту пухлини. У іншому дослідженні з використанням послідовності SEQ ID №1, життєздатні шматочки пухлини донора мишачої лінії U373, трансплантували в жирову тканину яєчників мишей nude (день 0). На четвертий і дев'ятий день після трансплантації мишей обробляли олігонуклеотидом LNA в дозуванні 50мг/кг (внутрішньочеревинно). Мишей умертвляли через 2 дні після введення останньої дози (день 11), пухлини зважували і забарвлювали з використанням CD-31 ab (див. Фіг.8А і 8С). На Фіг.8В і 8С представлена щільність судин в пухлинах U373 від ксенотрансплантантів, оброблених сполукою по послідовності SEQ ID №1. На Фіг.10D представлена експресія мРНК HIF-1α в пухлинах U373, визначена за допомогою QPCR. Сполуку по послідовності SEQ ID №1 вводили в дозі 50мг/кг два рази на тиждень протягом одного тижня в ксенотрансплантат мишей U373, імплантований в яєчники. Через два дні після введення останньої дози тварин умертвляли. Щільність судин визначали відносно загальної площі, після фарбування з CD31. Статистично значущу відмінність (Р=0,005) виявили між групою, обробленою фізіологічним розчином, і мишами, обробленими змішаним контролем (SEQ ID №12). Приклад 15: час напівжиття і направлений супресуючий ефект SEQ ID №1 в печінці і нирках 93188 48 60 самиць мишей NMRI (приблизно 25г) розбивали на групи по 5 і вводили їм внутрішньочеревинно послідовність SEQ ID №1 в дозі 30мг/кг (10мл/кг 2,5мг/мл) в день 0, 3, 7, 10 і 14. Тварин з даних груп умертвляли на день 14. Контрольним групам вводили 0,9% фізіологічний розчин. Брали зразки тканин і обробляли реагентом RNA-later. На Фіг.11 представлене поглинання in vivo (в мкг на грам тканини) і направлений супресуючий ефект (% інгібування експресії мРНК HIF-1α і VEGF, приведеної до експресії β-актину) мишей, після 5 внутрішньочеревинних введень сполуки по послідовності SEQ ID №1 в дозі 30мг/кг. Приклад 16: Тривалість дії і поглинання олігонуклеотиду LNA in vivo Тривалість дії: 20 самиць мишей Balb/cA-nu (приблизно по 25г) клітинної лінії раку передміхурової залози РСЗ (ЕСАСС №90112714), розбивали на групи по 5 і їм вводили внутрішньочеревинно сполуку по послідовності SEQ ID №7 в дозі 25мг/кг (10мл/кг 2,5мг/мл), кожний день з дня 7 по день 13. Тварин з даних груп умертвляли в перший і 5 день після введення доз. Контрольним групам вводили 0,9% фізіологічний розчин. Брали зразки тканин і обробляли реагентом RNA-later. На Фіг.10А представлена тривалість дії на експресію мРНК на день 1 і 5 після обробки. Поглинання олігонуклеотиду LNA: після фіксації в формаліні, дані тканини заливали парафіном. Дані тканини поміщували на ніч в розчин Хольта (30г сахарози, 1г аравійської камеді, 15мг тимолу, дистильована вода до об'єму 100мл) і заморожували. Зрізи із заморожених тканин товщиною 4 мікрона фіксували на склі із захисним покриттям і поміщували в розчин DAPI. Флуорохром візуалізували за допомогою флуоресцентного мікроскопа. На Фіг.10В представлені результати гістологічного аналізу в тканині печінки, нирок і пухлини мишей, оброблених fam-міченим варіантом послідовності SEQ ID №1 в дозі 25мг/кг/день протягом семи днів, і умертвлених через 5 днів після останньої обробки. Картина препаратів шкіри мишей, оброблених таким же способом, але умертвлених на наступний день після останньої обробки, і переекспоновані для того, щоб бачити найслабший контраст базальних клітин шкіри (нижня блакитна лінія). Ці результати дозволяють передбачити наступне: Печінка: фарбування гепатоцитів в основному локалізованих в цитоплазмі. Нирки: дуже інтенсивне фарбування проксимальних канальців і менш інтенсивне фарбування дистальних канальців. Пухлина: ендотеліальна клітина, макрофаги (мишачі клітини). Шкіра: інтенсивне фарбування дерми (ендотеліальні клітини і макрофаги) і цитоплазми базального шару епідермісу. Приклад 17: поглинання і ефективність олігонуклеотиду LNA in vivo У день 0 3×10-6 клітин (РСЗ і НТ29) змішували з 300мкл матриксгелю і імплантували самицям мишей Balb/cA-nu, (приблизно по 25г). На день 7, 10, 13, 17 мишей обробляли за допомогою внутрішньочеревинного введення 5мг/кг/день або фізіологічного розчину, або fam міченого варіанта пос 49 лідовності SEQ ID №1 (SEQ ID №7), fam міченого варіанта послідовності SEQ ID №8 (SEQ ID №20). Через три дні (день 20) або 10 днів (день 27) після введення останньої дози, тварин умертвляли. Контрольну групу обробляли 0,9% фізіологічним розчином. Одержували зразки тканин і зберігали в реагенті RNA-later до моменту визначення вмісту олігонуклеотиду LNA за допомогою ВЕРХ або аналізу даун-регуляції мРНК НIF-1α (див. Фіг.10C). Візуалізація поглинання олігонуклеотиду LNA: після фіксації в формаліні, дані тканини заливали парафіном. Дані тканини поміщували на ніч в розчин Хольта (30г сахарози, 1г аравійської камеді, 15мг тимолу, дистильована вода до об'єму 100мл) і заморожували. Зрізи із заморожених тканин товщиною 4 мікрона фіксували на склі із захисним покриттям і поміщували в розчин DAPI. Флуорохром візуалізували за допомогою флуоресцентного мікроскопа (результати демонструють таке ж біорозподілення як на Фіг.10В - дані не показані). Приклад 18: in vivo вивчення специфічності олігонуклеотиду LNA для HIF-1α i VEGF Дослідження несумісності: 15 самиць мишей NMRJ (приблизно по 25г) розбивали на групи по 5 і вводили їм внутрішньочеревинно протягом 30сек. 30мг/кг сполуки по послідовності SEQ ID №1 або SEQ ID №9 (10мл/кг, 3,0мг/мл) в день 0, 3, 7, 10, 14. Контрольній групі вводили 0,9% фізіологічний розчин. Тварин з даних груп умертвляли через 3-4 години після останньої ін'єкції. Одержували зразки тканин і обробляли реагентом для зберігання зразків RNA-later. На Фіг.11 показаний in vivo направлений ендогенний супресуючий ефект на мРНК HIF-1α і VEGF в печінці, після введення кожний 3-ій день 5 доз по 30мг/кг сполуки по послідовності SEQ ID №1 в порівнянні з одним несумісним контролем SEQ ID №9. Приклад 19: ефективність in vivo 14-мірного варіанта послідовності SEQ ID №1. Самиць мишей NMRI (0,025кг) обробляли за допомогою внутрішньочеревинних ін'єкцій сполуки по послідовності SEQ ID №1, 5мг/кг/день. Тварини, що одержували обробку 0,9% фізіологічним розчином, представлені як контрольні тварини. П'ять тварин умертвляли через 1 або 10 днів після введення препарату. Одержували зразки тканин і зберігали в реагенті RNA-later до моменту визначення експресії мРНК HIF-1α і нормалізовані по бетаактину, як описано в М&М. Приклад 20: одержання тривимірних культур аортальних кілець Ангіогенез вивчали за допомогою культивування кілець аорти миші в тривимірних колагенових гелях, використовуючи спосіб, спочатку описаний для аорти щурів, з деякими модифікаціями (Masson et al., 2002 Biol Preoced Online 4(1) p.2431). Мишей hairy обробляли однократно за допомогою внутрішньочеревинного введення олігонуклеотиду LNA в діапазоні доз від 10мг/кг до 50мг/кг. Через три дні після введення у мишей, умертвлених за допомогою дислокації шийних хребтів, видаляли грудні аорти і негайно помішували в чашку для культивування, яка містить льодяне середовище RPMI (Invitrogen), що містить 10% сироватку 93188 50 ембріонів великої рогатої худоби. Періаортальну фіброзножирову тканину обережно видаляли за допомогою тонких затискачів для мікродисекції, і ножицями проводили іридектомію, звертаючи особливу увагу на те, щоб не пошкодити стінку аорти. Робили зрізи аортальних кілець довжиною один міліметр (приблизно 15 на аорту при максимальній довжині аорти 1,5см), і ретельно промивали в трьох послідовних відмиваннях в середовищі RPMI з FBS. Потім кільцеві експлантати аорти миші в ямках 96-ямкового планшета заливали 60мкл матригелю (BD biosciences - Matrixgel: 356234). Після інсерції аорти додавали ще 40мкл матригелю і залишали при 37°С протягом 10хв. до застигання. У ямки додавали 100мкл EGM2 (Cambrix) з або без факторів росту. Як контроль, кільця аорти додатково покривали середовищем EGM2, що містить 10мкМ цисплатину. Це середовище міняли кожний другий день. Приклад 21: кількісне дослідження ауторадіографії всього тіла у мишей після однократного внутрішньовенного введення 3Н-міченої послідовності SEQ ID №1 Дев'яти самицям мишей C57B1/6J (8 тижнів Taconic, DK) в хвостову вену внутрішньовенно вводили 50мг/кг кожного тестованого зразка, що містить 1,5мКі/кг сполуки по послідовності 3H-SEQ ID №1. Питома активність 3H-SEQ ID №1 становила 155мкКі/мл. Об'єм тестованої композиції, що вводиться кожній тварині, становив 10мл/кг. Окремих мишей умертвляли через 5хв., 15хв., 1 годину, 4 години, 24 години, 2 дні, 4 дні, 7 днів і 18 днів після введення кожного тестованого зразка. Для аутографії . всього тіла мишам давали анестезію за допомогою ізофлурану, а потім негайно занурювали в гексан, охолоджений за допомогою сухого льоду до -80°С, ABR-SOP-0130/04. Дані заморожені тіла фіксували в гелі, що складається з водної карбоксиметилцелюлози (CMC), замороженої в етанолі, охолодженому за допомогою сухого льоду (-80°С), і проводили сагітальні розрізи для аутографії цілого тіла, згідно з стандартним методом, ABR-SOP-0131/04. При температурі близько -20°С за допомогою кріомікротома у кожної тварини на різних рівнях робили зрізи по 20мкм. Одержані зрізи фіксували на плівці (Minnesota Mining and Manufacturing Co., №810) і послідовно нумерували за допомогою радіоактивного чорнила. Після ліофілізації при -20°С протягом приблизно 24 годин, відібрані зрізи покривали тонким шаром порошку тальку і поміщували на сигнальні пластини (Fuji, Japan). Зрізи вибирали для люмінесцентної візуалізації для кращого зображення тканин і органів, що представляють інтерес. Разом з комплектом 3H калібрувальних стандартів дані зрізи покривали тонким шаром порошку тальку і поміщували на сигнальні пластини. Завдяки низькій енергії 3H, порошок тальку використовували замість полімерної плівки для захисту сигнальної пластини. Ці сигнальні пластини експонували протягом 3-7 днів при кімнатній температурі, поміщеними в світлонепроникні касети в коробці зі свинцевим захистом 51 для захисту від радіоактивності оточуючого середовища. Після експонування дані сигнальні пластини сканували при розмірі пікселів 50 мкм, використовуючи BAS 2500 (Fuji Film Sverige AB, Sweden). Дані тканини і органи кількісно визначали, використовуючи AIDA, версія 2.43 (Raytest, Germany). Водорозчинний розчин стандартного зразка 3Н радіоактивності змішували з цільною кров'ю і використовували для одержання калібрувальної шкали. Еталонні серії складалися з 10 розведень від 65,44 до 0,30нКі/мг. Для того щоб провести кількісне визначення, було зроблене припущення про те, що всі тканини мали щільність і характеристики швидкого охолоджування, схожі з такими для цільної крові. Щільність тканини встановлювали до 1г/мл. Межу кількісних показників визначали як середнє значення концентрації у восьми вимірюваннях для фону плюс значення стандартного відхилення для цих вимірювань, помножене на три. Різні тканини і органи визначали або по ауторадіограмам, або по відповідних тканинних зрізах. Термін судинна оболонка ока, що використовується тут, об'єднує в собі пігментний епітелій сітчатки, що представляє сруктури, які містять меланін, хороїд і склеру ока (див. Фіг.14А і 14В). Приклад 22: вестерн-блотинг клітин HUVEC, трансфекованих сполукою по послідовності SEQ ID №1 Клітини нормального ендотелію пупкової вени людини (HUVEC), вирощені в середовищі CambrixEGM2, трансфекували, як описано в прикладі, використовуючи 2 і 5нМ сполуки по послідовності SEQ ID №1 або 5нМ сполуки по послідовності SEQ ID №8. Після трансфекції клітини піддавали умовам гіпоксії (1% кисню) протягом 16 годин. Зібрані клітини відмивали за допомогою PBS і лізували за допомогою SDS, що містить буфер для лізису (як описано в прикладі). 50мкг наносили на трисацетатні гелі і піддавали електрофорезу при 150 В протягом 1 години. Вестерн-блотинг здійснювали, як описано в прикладі, і даний блот інкубували в HIF-1α проти людини (1:500) перед візуалізацією за допомогою посиленої хемілюмінесценції. Видний потужний супресуючий ефект сполуки по послідовності SEQ ID №1, в той час як змішаний контроль по послідовності SEQ ID №8 не здійснює супресуючого ефекту на експресію HIF-1α в клітинах HUVEC. Приклад 23: дослідження in vitro утворення трубок/утворення капіляроподібної структури Індукцію тубулогенезу здійснювали, використовуючи матригель (Venetsanakos Ε, Mirza A, Fanton С et al. Induction of tubulogenesis in telomerase-immortalized human microvascular endothelial cells by glioblastoma cells. Exp Cell Res 2002; 273: 21-33). Матригель розморожували на льоду для запобігання передчасній полімеризації; аліквоти по 50мкл висівали в окремі ямки 96ямкових планшетів для вирощування тканин (Nunc), і витримували для полімеризації при 37°С протягом щонайменше 30 хвилин. Трансфековані клітини HUVEC відділяли за допомогою обробки сумішшю трипсин 0,05%-ЕДТО. Дані клітини від 93188 52 мивали за допомогою середовища, що містить сироватку крові, і потім ресуспендували до 2ХІ0Е5клітин/мл. У кожну ямку з культурою додавали 100мкл суспензії в культуральному середовищі, що містить фактори росту (VEGF, hFGF-B, R3-IGF1, hEGF з FBS (2%)), трансфекованих або нетрансфекованих клітин HUVEC і гепарин (n=10). Як контролі використовували необроблені, трансфековані плацебо, а також клітини HUVEC, трансфековані олігонуклеотидом змішаного контролю (SEQ ID №8). Кількісний аналіз доз контролю або тестованої сполуки визначали в 6-10 окремих ямках, і дані експерименти здійснювали щонайменше три рази. Для кількісного визначення утворення трубок дані ямки фотографували (див. Фіг.13). Приклад 24: FACS аналіз поглинання в клітинах селезінки, кісткового мозку і периферичної крові. Самиць мишей NMRI (0,025кг) обробляли famміченим варіантом сполук по послідовностях SEQ ID №1, SEQ ID №7 (50мг/кг) або еквівалентною кількістю молекул Fam амідиту (3мг/кг) або 0,9% фізіологічним розчином. Тварин умертвляли через 1 годину після ін'єкції і збирали клітини селезінки, периферичної крові (1мл, до якого додали 1мл PBS, що містить 0,1% азиду натрію +50мл сульфату гепарину, зберігали на льоду) або кісткового мозку. Селезінка Помістити селезінку на металеву сітку, змочити за допомогою 1мл R10 (середовище для вирощування культури тканин R10, що містить 10% FCS), що містить азид. Продавити тканину через сітку і промити за допомогою R10 +азид, загальним об'ємом 4мл. Відібрати 0,5мл суспензії тканини і викинути частину, що залишилася. Еритроцити лізувати в суспензії за допомогою додавання 50мл суміші буфера для лізису еритроцитів, і залишити при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Центрифугувати при 2000об./хв. протягом 10 хвилин. При необхідності видалення залишків еритроцитів, повторити цей процес. Підрахувати і заблокувати клітини. Осадити клітини обертанням і ресуспендувати в 1,0мл буфера FACS, що містить азид. Прийняти число клітин для блокування рівним 5x10 клітин на селезінку, і додати CD16/CD32 миші 5мкл на мільйон клітин (додано 25мкл блокувальної системи). Периферична кров Еритроцити лізувати за допомогою додавання 50мл розчину для лізису еритроцитів. Клітини осадити обертанням і при необхідності цей процес повторити. Клітини відмити один раз за допомогою PBS, ресуспендувати і підрахувати. Неспецифічне зв'язування антитіл блокувати за допомогою додавання CD16/CD32 миші в кількості 5мкл на мільйон клітин. Залишити при кімнатній температурі протягом 10хв., потім перейти до забарвлювання ліній клітинного диференціювання. Кістковий мозок Надрізати кістку як можна ближче до кожного кінця, використовуючи стерильні ножиці. Набрати 1мл стерильного PBS- в 1мл шприц, оснащений голкою 25G. Ввести голку в один кінець кістки звичайно простіше усього на згині і промити кістку за 53 93188 допомогою PBS. Повторювати доти, поки кістка не стане чистою. Пропустити кістковий мозок через голку декілька разів для руйнування кісткового мозку. Якщо не упевнені в кількості еритроцитів, можна використовувати етап лізису клітин, як описано вище. Підрахувати і блокувати клітини, як описано вище. На льоду помістити 150000 клітин в стерильну пробірку типу еппендорф для культивування кісткового мозку. Фарбування FACS Фарбування ліній клітинного диференціювання здійснювали, використовуючи специфічні маркери. Як описано: Фарбування 1. CD4 АРС, CD8 РЕ FITC, 7AAD 2. Gr-1 PE, f4/80 APC 3. Gr-1 PE, Mac-1APC 4. CD34 ΡΕ lineage APC 5. B220 APC, CD19PE 6. CD11b PE, CD11c APC Ізотипи 7. IgG1 APC американського хом'ячка 8. IgG2a APC щура 9. IgG2a PE щура 10. rgG2b PE щура Т-клітини нейтрофіли, макрофаги мієломоноцити стовбурові клітини В-клітини дендритні клітини CD11c CD4, B220 cd8a, CD19, CD34 Gr-1 CD11b Ці фарбування здійснювали в 96 ямках, і загальне число 100мкл блокованих клітин були забарвлені за допомогою 100мкл фарбувальної суміші (або контрольні ізотипи, або специфічні маркери ліній клітинного диференціювання). Ці фарбування здійснювали на льоду і залишали на 30 хвилин. Клітини осаджували центрифугуванням протягом 2хв. при 2000об./хв. Супернатант відсмоктували і клітини відмивали за допомогою 200мкл буфера FACS і повторювали етап центрифугування. Всього відмивали три рази. На завершальній стадії дані клітини ресуспендували в 200мкл буфера FACS і додавали в пробірку, в якій вже міститься 200мкл FACS +5мкл 7AAD. Аналіз FACS проводили за допомогою Becton Dickinson FACS Calibur (див. Фіг.15). Ендотеліальні клітини, гранулоцити і CD4+ лімфоцити, і макрофаги периферичної крові, і дендритні клітини, і гранулоцити кісткового мозку, і гранулоцити селезінки забарвлюються позитивно для FAM-мічення після п'яти днів застосування сполуки по послідовності SEQ ID №7. Приклад 25: HIF-1α і вміст олігонуклеотиду по послідовності SEQ ID №1 в тканинах людиноподібних мавп Головним чином для токсикологічного дослідження в тканинах людиноподібних мавп, в тому числі печінки і нирок, зразки миттєво заморожували і зберігали при -70°С для подальшого аналізу (див. Фіг.16А і 16В). Цих мавп обробляли за допомогою внутрішньовенного введення 0, 6, 10 і 40мг/кг/випадок два рази на тиждень протягом чотирьох тижнів. У групах тварин, що одержували 54 0, 10 і 40мг/кг/випадок, деяких тварин залишали без обробки на 4-тижневий період відновлення. РНК виділяли із зразків, як описано в прикладі 13, і вміст мРНК HIF-1α визначали, як описано в прикладі 8 (дивись фігуру 16А). Вміст олігонуклеотиду визначали, як описано нижче (див. Фіг.16В). Приготування зразка: виділення з тканин печінки і нирок Хімічні речовини/реагенти: Протеїназа K (25,1мг/мл): Sigma P4850. Суміш фенол-хлороформ-ізоаміловий спирт (25:24:1 (об./об./об.), насичена 10мМ Тріс, рН: 8,0, 1мМ ЕДТО: Sigma P2069 Ігепал СА-630: Sigma, 18896 Буфер для екстракції: 0,5% Ігепал СА-630, 25мМ Тріс рН8,0, 25мМ ЕДТО, 100мМ NaCl, рН8,0 (доводили за допомогою 1N NaOH). 1мг/мл Протеїнази K в буфері для екстракції: готують перед кожним виділенням. Тканини (~100мг) зважують (тканину зберігають на сухому льоду перед і після зважування). Додають 500мкл буфера для екстракції, що містить протеїназу K (1мг/мл). Дану тканину механічно гомогенізують і гомогенат інкубують при 37°С протягом ночі. Еталонні зразки одержують за допомогою розчинення сполуки по послідовності SEQ ID №2 в буфері для екстракції у відповідному інтервалі концентрації. Зважують рівно 100мг тканини печінки тварин, які не піддавалися обробці (зберігати на сухому льоду перед і після зважування). Буфер для екстракції (з протеїназою K, 1мг/мл), що містить еталонний матеріал, додають до зразків тканини до загального об'єму 0,5 мл. Дану тканину механічно гомогенізують і інкубують при 37°С протягом ночі. Сигнал виявлення сполуки по послідовності SEQ ID №2 в цих зразках використовували для побудови калібрувальної кривої, що перекриває самі низькі і самі високі концентрації, виявлені у тварин, які піддалися обробці. Зразки тканини переносили в мікропробірки об'ємом 2мл, з кришками, що загвинчуються. Додавали 1мл суміші фенол-хлороформ-ізоаміловий спирт (25:24:1 (об./об./об.)), і потім енергійно струшували протягом 5хв. Розділення фаз досягали за допомогою центрифугування протягом 15хв. при 4000об./хв. Водну фазу (верхня фаза) переносили в нову пробірку (аналогічно випаровуванню) і додавали 500мкл мілі-Q-H2O до органічної фази (залишок після першої екстракції). Ці пробірки ще раз енергійно струшували протягом 5хв., потім центрифугували протягом 15хв. при 4000об./хв. (SAN039 в кімнаті 115). Об'єднували водні фази (водна фаза після першої екстракції і відмивальна вода) і випаровували до сухості (80°С, в присутності азоту). Цей залишок відновлювали в 200мкл мілі-Q-води, з подальшим центрифугуванням протягом 15хв. при 4000об./хв. Ці зразки для аналізу переносили у флакони для ВЕРХ. Аналіз олігонуклеотиду за допомогою ВЕРХ в тканинах печінки і нирок: після екстракції сполуку по послідовності SEQ ID №2 аналізують за допомогою іонообмінної ВЕРХ: Колонка: Dionex, DNA рас РА 100: 2×50мм (обмежувальна), 2×250мм (аналітична) Температура колонки: 42°С 55 Об'єм вколювання: 50мкл Відмивання-розчинення: мілі-Q-H2O Очищення-розчинення: мілі-Q-H2O Визначення: УФ, 260нм Розчинники: Буфер А: 1мМ ЕДТО, 20мМ Тріс-Сl, 10мМ NaC104, рН: 7,6 (1N NaOH) Буфер В: 1мМ ЕДТО, 20мМ Тріс-СІ, 1Μ NaC104, рН: 7,6 (1N NaOH) Приклад 26: тривалість дії in vivo обробки, з використанням SEQ ID №1 Мишам hairy вводили однократно внутрішньочеревинну ін'єкцію 50мг/кг сполуки по послідовності SEQ ID №1. П'ять тварин з кожної групи умертвляли через 1 і 10 днів після введення дози (див. Фіг.9С) або через 1, 2, 3, 4, 5 і 10 днів після введення дози (див. Фіг.9В). Експресію мРНК HIF-1α досліджували за допомогою QPCR в режимі реального часу і нормалізували до GAPDH. Приклад 27: модель ураження рогівки ока in vivo Миші і анестезія. Миші BALB/c, вік 6-8 тижнів. Мишам давали анестезію, використовуючи суміш кетаміну і ксилазину (120мг/кг маси тіла і 20мг/кг маси тіла, відповідно). Модель на миші запальної реваскуляризації рогівки, індукованої накладенням шва. Використовували цю модель на миші запальної реваскуляризації рогівки, індукованої накладенням шва (CNV), як раніше описано у Streilein JW, Bradley D, Sano Y, Sonoda Υ. Immunosuppressive properties of tissues obtained from eyes with experimentally manipulated corneas. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996; 37: 413-424. Коротко, трепан для рогівки діаметром 2мм акуратно помішували на центр рогівки анестезованих мишей, лише для того, щоб відмітити центральну ділянку рогівки. Потім внутрішньостромально накладали три нитки 11-0 з двома проникненнями в строму, кожна протяжністю по поверхні рогівки на 120°. Для одержання стандартних ангіогенних реакцій вибрана зовнішня точка накладення шва знаходилася посередині між облямівкою і лінією, наміченою за допомогою 2мм трепану; внутрішня точка накладення шва знаходилася на такій же відстані від лінії, наміченої за допомогою 2мм трепану. Шви залишали на 7 днів. Мишей умертвляли і видаляли рогівку разом з облямівкою і проводили подвійний імуногістохімічний аналіз плоского препарату. Наявність запальних клітин в нормальних рогівках і їх рекрутмент в рогівках через 1 тиждень після накладення шва, кількісно визначали в серійних зрізах рогівок, залитих в пластик, фіксованих в 10% параформальдегіді, забарвлених гематоксиліном і еозином, після видалення ядра. Крім того, для одержання додаткових характеристик запальних клітин, що скупчилися в рогівці, здійснювали подвійний імуногістохімічний аналіз тотальних препаратів рогівки і заморожених зрізів з маркерами макрофагів CD lib. Крім того, ці зрізи забарвлювали на ендотеліальні клітини (судини за допомогою CD31), маркери для VEGF і VEGFR. Приклад 28: дослідження за допомогою способу мікрокарманів в рогівці 93188 56 Дослідження за допомогою способу мікрокарманів в рогівці здійснювали як описано раніше (Cao Y, et al. Vascular endothelial growth factor C induces angiogenesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998; 95: 14389-14394). Коротко, мікрокармани в рогівці формували, використовуючи видозмінений скальпель вон Граєфа, в кожну кишеню імплантували мікропелету (0,4×0,4мм) сахарози сульфату алюмінію, покриту полімером гідрону, що містить 200нг VEGF-A164 (R&D) або 200нг рекомбінантного bfgf (RDI, Flanders, New Jersey, USA). Дану пелету розташовували на відстані 0,60,8мм від облямівки і дану ділянку покривали маззю, що містить антибіотик (еритроміцин), і залишали на 10 днів (n>5-10 мишей кожна). Гемангіогенна і лімфангіогенна відповіді кількісно визначали, як описано вище, використовуючи подвійне імунне фарбування з використанням CD31/LYVE-1. Максимальну протяжність розростання кровоносних судин між нижчележачою облямівкою і пелетою в порівнянні з лімфатичними судинами оцінювали напівкількісно в чотирьох категоріях для обох типів судин: 0, немає розростання; 1, розростання менше ніж 1/3 відстані облямівка-пелета; 2, розростання між 1/3 і 2/3 відстані облямівка-пелета; 3, судина, що досягає пелети. Приклад 29: модель псоріазу in vivo Химера шкіра людини/миші SCID in vivo Ксенотрансплантати шкіри людини ортотопічно трансплантували мишам SCID, у віці 7-8 тижнів (Taconic, DK), додержуючись процедур, раніше описаних Wrone-Smith Τ, Nickoloff BJ: Dermal injection of immunocytes induces psoriasis. J Clin Invest 1996, 98: 1878-1887. Коротко, ксенотрансплантати шкіри людини розміром 1,5×1,5×0,5см пришивали на бік мишей SCID, використовуючи нитку, що розсмоктується, для зшивання 5-0 Vicryl Rapide (Ethicon, Somerville, NJ), і покривали перев'язувальним матеріалом Xeroform (Kendall Co., Mansfield, MA). Пов'язки видаляли через 1 тиждень і тварин протягом всього дослідження тримали в умовах, вільних від патогенних мікроорганізмів. Цих мишей обробляли сполукою по послідовності SEQ ID №1 і SEQ ID №7 в дозі 50мг/кг два рази на тиждень, через один-три тижні після трансплантації. Химер шкіра людини/миші SCID умертвляли після 2-3 тижнів обробки, і з кожного ксенотрансплантата одержували пункційні біоптати розміром 4мм (Baker's Biopsy Punch, Cummins Derm, Miami, FL). Біоптати фіксували в нейтральному буферному формаліні для заливання в парафін і/або закладали в трагакантову камедь (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), миттєво заморожували в рідкому азоті-охолодженому ізопентані, і зберігали при -80°С. Фарбування з використанням імунної мітки Кріостатні зрізи шкіри забарвлювали на відповідні маркери, в тому числі ендотеліальні клітини (CD31/CD34), макрофаги (cd11b) VEGF, VEGFR або HIF-1α. Дані зрізи контр-забарвлювали за допомогою гематоксиліну і еозину (як описано раніше). Всі зрізи досліджували і фотографували. 57 93188 58 59 93188 60