Спосіб збільшення часу розвитку захворювання або виживаності у ракових пацієнтів

1. Спосіб збільшення часу розвитку захворювання (ТТР) або виживаності у пацієнта, хворого на рак, що включає введення пацієнтові інгібітора димеризації HER, що являє собою антитіло, яке зв'язує Домен II зовнішньоклітинного домену HER2 та інгібує димеризацію HER2 або гетеродимеризацію HER, в кількості, яка збільшує ТТР або виживаність пацієнта, де рак пацієнта вибирають з групи, що складається з раку яєчників, очеревинного раку, раку фаллопієвих труб, метастатичного раку молочної залози (МВС), недрібноклітинного раку легенів (NSCLC), раку простати, колоректального раку та раку шлунка. 2. Спосіб згідно з пунктом 1, де HER антитіло містить варіабельну легку і варіабельну важку амінокислотні послідовності в SEQ ID NO: 3 і 4, відповідно. 3. Спосіб згідно з пунктом 2, де інгібітором димеризації HER є пертузумаб. 4. Спосіб згідно з пунктом 2 або 3, де HER антитілом є оголене антитіло. 5. Спосіб згідно з будь-яким з пунктів з 2 по 4, де HER антитілом є інтактне антитіло. 6. Спосіб згідно з будь-яким з пунктів з 2 по 4, де HER антитілом є фрагмент антитіла, що містить антигензв'язувальний регіон. 7. Спосіб згідно з пунктом 1, де раком є рак яєчників, очеревини або рак фаллопієвих труб. 8. Спосіб згідно з пунктом 1, де раком є прогресуючий, важковиліковний або рецидивний рак яєчників. 9. Спосіб згідно з будь-яким з попередніх пунктів, де інгібітор димеризації HER вводять як єдиний протираковий агент. 10. Спосіб згідно з будь-яким з пунктів 1-8, що включає введення пацієнтові другого терапевтичного агента. 11. Спосіб згідно з пунктом 10, де другий терапевтичний агент вибирають з групи, що включає хіміотерапевтичний агент, HER антитіло, антитіло спрямоване проти пухлинопов'язаного антигену, антигормональну сполуку, кардіопротекторний засіб, цитокін, EGFR-націлений лікарський засіб, UA (21) a200710403 (22) 21.02.2006 (24) 26.09.2011 (86) PCT/US2006/006334, 21.02.2006 (31) 60/655,277 (32) 23.02.2005 (33) US (46) 26.09.2011, Бюл.№ 18, 2011 р. (72) ДЕРІНК МІКА К., US, КЕЛСІ СТІВЕН М., US (73) ДЖЕНЕНТЕК, ІНК., US (56) AGUS ET AL.: "Clinical activity in a phase I trial of HER-2-targeted rhum 2C4 (pertuzumab) in patients with advanced solid malignancies (AST)" PROC AM SCO CLIN ONCOL, vol. 22, 2003, page ABS 771, XP009070506 VALLE J W ET AL: "287 A phase Ib study of pertuzumab (P), a recombinant humanized antibody to HER2, and capecitabine (C) in patients with advanced solid tumors" EUROPEAN JOURNAL OF CANCER. SUPPLEMENT, PERGAMON, OXFORD, GB, vol. 2, no. 8, September 2004 (2004-09), page 88, XP004639731 ISSN: 1359-6349 FRIESS, T. ET AL.: "Additive antitumor activity by combined treatment with recombinant humanized monoclonal antibody 2C4 and standard chemotherapeutic agents in NSCLC xenografts is independent of HER2 overexpression" PROC AM SOC CLIN ONCOL, vol. 22, 2003, page ABS 953, XP009070507 ARPINO G ET AL: "Complete disappearance of ER+/HER2+breast cancer xenografts with the combination of gefitinib, trastuzumab, and pertuzumab to block HER2 cross-talk with ER and restore tamoxifen inhibition" BREAST CANCER RESEARCH AND TREATMENT, vol. 88, no. Suppl. 1, 2004, page S15, XP002393210 & 27TH ANNUAL CHARLES A COLTMAN SAN ANTONIO BREAST CANCER SYMPOSIUM; SAN ANTONIO, TX, USA; DECEMBER 08 -11, 2004 WO 2004/008099 A, 22.01.2004 NAHTA R ET AL: "The HER-2-targeting antibodies trastuzumab and pertuzumab synergistically inhibit the survival of breast cancer cells" CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, BALTIMORE, MD, US, vol. 2 (19) 1 3 95902 4 антиангіогенний агент, інгібітор тирозинкінази, інгібітор СОХ, нестероїдний протизапальний лікарський засіб, інгібітор фарнезилтрансферази, антитіло, що зв'язує карциноембріональний протеїн СА 125, HER2 вакцину, HER націлену терапію, інгібітор Raf або Ras, ліпосомальний доксорубіцин, топотекан, таксан, подвійний інгібітор тирозинкінази, TLK286, EMD-7200, медикамент для лікування нудоти, медикамент для попередження або лікування висипів на шкірі або стандартного лікування акне, медикамент для попередження або лікування діареї, медикамент для зниження температури тіла і гематопоетичний фактор росту. 12. Спосіб згідно з пунктом 11, де другим терапевтичним агентом є хіміотерапевтичний агент. 13. Спосіб згідно з пунктом 12, де хіміотерапевтичним агентом є антиметаболічний хіміотерапевтичний агент. 14. Спосіб згідно з пунктом 13, де антиметаболічним хіміотерапевтичним агентом є гемцитабін. 15. Спосіб згідно з пунктом 10, де другим терапевтичним агентом є трастузумаб, ерлотиніб або бевацизумаб. 16. Спосіб згідно з будь-яким з попередніх пунктів, де час розвитку захворювання (ТТР) збільшується. 17. Спосіб згідно з будь-яким з попередніх пунктів, де збільшується виживання. 18. Спосіб згідно з будь-яким з попередніх пунктів, де введення інгібітора димеризації HER збільшує ТТР або виживаність на принаймні приблизно 20 % порівняно з ТТР або виживаністю, що досягається при введенні пацієнту, що страждає на рак, схваленого протиракового агента. 19. Спосіб збільшення часу розвитку захворювання (ТТР) або виживаності у пацієнта з раком яєчників, раком очеревини або раком фаллопієвих труб, що включає введення пертузумабу пацієнтові в кількості, яка збільшує ТТР або виживаність пацієнта, де рак пацієнта проявляється у активуванні HER2. 20. Спосіб згідно з пунктом 19, де пацієнт має рак яєчників. 21. Спосіб згідно з пунктом 19 або пунктом 20, де пацієнт має прогресуючий, важковиліковний або рецидивний рак. 22. Спосіб згідно з будь-яким з пунктів 19-21, де введення пертузумабу пацієнтові збільшує ТТР або виживаність на принаймні приблизно 20 % порівняно з ТТР або виживаністю, що досягається при введенні пацієнтові топотекану або ліпосомального доксорубіцину. 23. Спосіб згідно з будь-яким з пунктів 19-22, що також включає введення пацієнтові хіміотерапевтичного агента. 24. Спосіб згідно з пунктом 23, де хіміотерапевтичним агентом є антиметаболічний хіміотерапевтичний агент. 25. Спосіб згідно з пунктом 24, де антиметаболічним хіміотерапевтичним агентом є гемцитабін. Пріоритет цієї заявки заявлений в попередній заявці Сполучених Штатів з серійним № 60/655,277, що подана 23 лютого 2005, опис якої включений сюди як посилання. Представлений винахід стосується збільшення часу розвитку захворювання або виживаності у пацієнтів хворих на рак, де рак пацієнтів виявляється за активацією HER, шляхом лікування пацієнта із застосуванням інгібіторе димеризації HER, такого як пертузумаб. HER рецептори і їх антитіла HER родина рецептора тирозинкіназ є важливим медіатором росту, диференціації і виживання клітин. Родина рецептора включає чотири окремі члени, що включає рецептор фактора росту епідермісу (EGFR, ErbB1 або HER1), HER2 (ЕrbВ2 або neu р185 ), HER3 (ЕrbВ3) і HER4 (ЕrbВ4 або tyro2). EGFR, що кодується erbB1 геном, втягнутий в утворення злоякісних утворень у людини. Зокрема, підвищення експресії EGFR спостерігається при раку молочних залоз, сечового міхура, легенів, голови, шиї і шлунку, також як гліобластом. Підвищення експресії EGFR рецептора часто пов'язують з підвищенням продукування EGFR ліганду, трансформуючого фактора росту альфа (TGF-α), в тих же самих клітинах пухлини внаслідок активації рецептора через аутокринний стимулюючий шлях. Baselga and Mendelsohn Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994). Були досліджені моноколональні антитіла, що спрямовані проти EGFR або його лігандів, TGF-α і EGF, як терапевтичні агенти при лікуванні таких злоякісних утворень. Дивіться, наприклад, Baselga and Mendelsohn., supra; Masui et al. Cancer Research 44:1002-1007 (1984); і Wu et al. J. Gin. Invest. 95:1897-1905 (1995). neu Другий член HER родини, p185 , був вперше виділений як продукт трансформуючого гена з нейробластом хімічно оброблених щурів. Активована форма neu прото-онкогена одержана точкою мутацією (валін на глютамінову кислоту) в трансмембранному регіоні, що кодує протеїн. Ампліфікація гомолога людини neu спостерігається при раку молочної залози і раку яічників і корелюється з поганими прогнозами (Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707712 (1989); і патент US № 4,968,603). На сьогоднішній день, відсутня інформація про аналоги з точковими мутаціями в neu прото-онкогені для пухлин людини. Також була досліджена надмірна експресія HER2 (часто, але не постійно, внаслідок ампліфікації гена) в інших карциномах, включаючи карциному шлунку, ендометрію, слинної залози, легені, нирки, товстої кишки, щитовидної залози, підшлункової залози і сечового міхура. Дивіться, серед інших, King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al., Lancet: 1:765-767 (1986); Fukushige et al., Моl Cell Biol., 6:955-958 (1986); Guerin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol, 5 38:364 (1990); Weiner et al., Cancer Res., 50:421425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Моl Carcinog., 3:254-257 (1990); Aasland et al., Br. J. Cancer 57:358-363 (1988); Williams et al. Pathobiology 59:46-52 (1991); і McCann et al., Cancer, 65:88-92 (1990). HER2 може надмірно експресуватись в ракові простати (Gu et al. Cancer Lett. 99:185-9 (1996); Ross et al. Hum. Pathol. 28:827-33 (1997); Ross et al. Cancer 79:2162-70 (1997); і Sadasivan et al., J. Urol 150:126-31 (1993)). Були описані антитіла спрямовані проти протеneu їнових продуктів HER2 р185 щура і людини. Drebin і колеги виростили антитіла проти проneu дукту neu гена щура, р185 . Дивіться, наприклад, Drebin et al., Cell 41:695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198:277-290 (1991); і WO 94/22478. Drebin et al. Oncogene 2:273-277 (1988) повідомили, що суміші антитіл реагуючи з двома окремими neu регіонами р185 дають синергічну анти-пухлинну дію на neu-трансформованих NIH-3T3 клітинах імплантованих в голих мишей. Дивіться також патент U.S. 5,824,311 виданий 20 жовтня 1998. Hudziak et al., Моl Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989) описують одержання ряду HER2 антитіл, які були охарактеризовані використовуючи лінію клітин раку молочної залози людини SK-BR-3. Визначали відносну клітинну проліферацію SK-BR-3 клітин після взаємодії з антитілами використовуючи моношари мічені кристалічним фіолетовим після 72 годин. Використовуючи це дослідження одержували максимум інгібування використовуючи антитіло назване 4D5, яке інгібує клітинну проліферацію на 56%. Інші антитіла із ряду зменшують клітинну проліферацію в цьому дослідженні в меншому ступені. Вподальшому було знайдено, що антитіло 4D5, робить чутливим лінії клітин раку молочної залози, що надмірно експресують HER2, до цитотоксичної дії TNF-α Дивіться також патент U.S. № 5,677,171 виданий 14 жовтня 1997. Антитіла HER2 обговорюються Hudziak et al., і характеризуються Fendly et al. Cancer Research 50:15501558 (1990); Kotts et al., In Vitro 26(3):59A (1990); Sarup et al. Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11(3):117-127 (1991); Kumar et al. Моl. Cell. Biol. 11(2):979-986 (1991); Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al. Oncogene 9:18291838 (1994); Vitetta et al. Cancer Research 54:53015309 (1994); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994); Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996); і Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394(1997). Рекомбінантна гуманізована версія 4D5 антитіла HER2 миші (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, трастузумаб або HERCEPTIN®; патент U.S. № 5,821,337) є клінічно активною у пацієнтів з метастатичним раком молочної залози, що надмірно експресує HER2, які отримували екстенсивне протиракове лікування (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)). Трастузумаб, що одержав маркетингове схвалення Адміністрації по контролю за продуктами харчування та ліками 25 вересня 1998 95902 6 для лікування пацієнтів з метастатичним раком молочної залози, при якому пухлини надмірно експресують HER2 протеїн. Інші HER2 антитіла з різними властивостями були описані Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47:933937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4:543-548 (1989); Mnevetal. Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al. Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al. Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); WO 94/00136; Kasprzyk et al. Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock еt al. Cancer Res. 51:4575-4580 (1991); Shawver et al. Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al. Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al. J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); патент U.S. № 5,783,186; і Klapper et al. Oncogene 14:2099-2109 (1997). Дослідження гомології показали ідентичність двох різних членів родини HER рецептора; HER3 (патенти US № 5,183,884 і 5,480,968, також як Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197(1989)) і HER4 (патентна заявка ЕР № 599,274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); і Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)). Обидва з цих рецепторів показують збільшення експресії на принаймні деяких лініях клітин раку молочної залози. HER рецептори загалом знаходять в різних комбінаціях в клітинах і припускають, що гетеродимеризація, збільшує різноманіття клітинних відповідей на різні HER ліганди (Еаrр et al. Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). EGFR зв'язує шість різних лігандів; фактор росту епідермісу (EGF), трансформуючий фактор росту альфа (TGF-α), амфірегулін, гепаринзв'язуючий фактор росту епідермісу (HB-EGF), бетацеллулін і епірегулін (Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994)). Родина протеїнів херегуліну, одержана при альтернативному сплайсингу одного гена, є лігандами HER3 і HER4. Родина херегуліну включає альфа, бета і гама херегуліни (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); патент U.S. № 5,641,869; і Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)); neu фактори диференціації (NDFs), гліальні фактори росту (GGFs); індукуючий активність ацетилхоліновий рецептор (ARIA); і сенсорно і моторно нейроннопохідний фактор (SMDF). Для ознайомлення, дивіться Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262 (1996) і Lee et al. Pharm. Rev. 47:51-85 (1995). Нещодавно були ідентифіковані три додаткові HER ліганди; неурегулін-2 (NRG-2), який як повідомлялось зв'язує і HER3, і HER4 (Chang et al. Nature 387 509-512 (1997); і Carraway et al Nature 387:512-516 (1997)); неурегулін-3, який зв'язує HER4 (Zhang et al. PNAS (USA) 94(18):9562-7 (1997)); і неурегулін-4, який зв'язує HER4 (Harari et al. Oncogene 18:2681-89 (1999)) HB-EGF, бетацеллулін і епірегулін також зв'язує HER4. В той час як EGF і TGFα не зв'язують HER2, EGF стимулює EGFR і HER2 з утворенням гетеродимеру, який активує EGFR і призводить до трансфосфорилювання HER2 в гетеродимері. Димери 7 зація і/або трансфосфорилювання проявляється у активуванні HER2 тирозинкінази. Дивіться Earp et al., supra. Також, коли HER3 співекспресується з HER2, утворюється активний сигнальний комплекс і антитіло, що спрямоване проти HER2, здатне руйнувати цей комплекс (Sliwkowski et al.,J. Biol Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)). Крім того, спорідненість HER3 до херегуліну (HRG) підвищується до вищого стану споріднення, коли співекспресується з HER2. Дивіться також, Levi et al., Journal ofNeuroscience 15:1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 14311435 (1995); і Lewis et al., Cancer Res., 56:14571465 (1996) стосовно HER2-HER3 протеїнового комплексу. HER4, подібно HER3, утворює активний сигнальний комплекс з HER2 (Carraway and Cantley, Cell 78:5-8(1994)). Патентними публікаціями, що стосуються HER антитіл є: US 5,677,171, US 5,720,937, US 5,720,954, US 5,725,856, US 5,770,195, US 5,772,997, US 6,165,464, US 6,387,371, US 6,399,063, US 2002/0192211A1, US 6,015,567, US 6,333,169, US 4,968,603, US 5,821,337, US 6,054,297, US 6,407,213, US 6,719,971, US 6,800,738, US 2004/0236078A1, US 5,648,237, US 6,267,958, US 6,685,940, US 6,821,515, WO 98/17797, US 6,127,526, US 6,333,398, US 6,797,814, US 6,339,142, US 6,417,335, US 6,489,447, WO 99/31140, US 2003/0147884A1, US 2003/0170234A1, US 2005/0002928A1, US 6,573,043, US 2003/0152987A1, WO 99/48527, US 2002/0141993A1, WO 01/00245, US 2003/0086924, US 2004/0013667A1, WO 00/69460, WO 01/00238, WO 01/15730, US 6,627,196B1, US6,632,979B1, WO 01/00244, US 2002/0090662A1, WO 01/89566, US 2002/0064785, US 2003/0134344, WO 04/24866, US 2004/0082047, US 2003/0175845A1, WO 03/087131, US 2003/0228663, WO 2004/008099A2, US 2004/0106161, WO 2004/048525, US 2004/0258685A1, US 5,985,553, US 5,747,261, US 4,935,341, US 5,401,638, US 5,604,107, WO 87/07646, WO 89/10412, WO 91/05264, EP 412,116 B1, EP 494,135 B1, US 5,824,311, EP 444,181 B1, EP 1,006,194 A2, US 2002/0155527A1, WO 91/02062, US 5,571,894, US 5,939,531, EP 502,812 B1, WO 93/03741, EP 554,441 B1, EP 656,367 A1, US 5,288,477, US 5,514,554, US 5,587,458, WO 93/12220, WO 93/16185, US 5,877,305, WO 93/21319, WO 93/21232, US 5,856,089, WO 94/22478, US 5,910,486, US 6,028,059, WO 96/07321, US 5,804,396, US 5,846,749, EP 711,565, WO 96/16673, US 5,783,404, US 5,977,322, US 6,512,097, WO 97/00271, US 6,270,765, US 6,395,272, US 5,837,243, WO 96/40789, US 5,783,186, US 6,458,356, WO 97/20858, WO 97/38731, US 6,214,388, US 5,925,519, WO 98/02463, US 5,922,845, WO 98/18489, WO 98/33914, US 5,994,071, WO 98/45479, US 6,358,682 B1, US 2003/0059790, WO 99/55367, WO 01/20033, US 2002/0076695 A1, WO 00/78347, WO 01/09187, WO 01/21192, WO 01/32155, WO 01/53354, WO 01/56604, WO 01/76630, WO 02/05791, WO 02/11677, US 6,582,919, US 2002/0192652A1, US 2003/0211530A1, WO 02/44413, US 2002/0142328, US 6,602,670 B2, WO 95902 8 02/45653, WO 02/055106, US 2003/0152572, US 2003/0165840, WO 02/087619, WO 03/006509, WO 03/012072, WO 03/028638, US 2003/0068318, WO 03/041736, EP 1,357,132, US 2003/0202973, US 2004/0138160, US 5,705,157, US 6,123,939, EP 616,812 B1, US 2003/0103973, US 2003/0108545, US 6,403,630 B1, WO 00/61145, WO 00/61185, US 6,333,348 B1, WO 01/05425, WO 01/64246, US 2003/0022918, US 2002/0051785 A1, US 6,767,541, WO 01/76586, US 2003/0144252, WO 01/87336, US 2002/0031515 A1, WO 01/87334, WO 02/05791, WO 02/09754, US 2003/0157097, US 2002/0076408, WO 02/055106, WO 02/070008, WO 02/089842 і WO 03/86467. Діагностика Пацієнтів, що лікують із застосуванням HER2 антитіла трастузумабу, вибирають для лікування, що ґрунтується на надмірній експресії/ампліфікації HER2. Дивіться, наприклад, WO 99/31140 (Paton et al), US 2003/0170234A1 (Hellmann, S.), and US 2003/0147884 (Paton et al); також як WO 01/89566, US 2002/0064785 і US 2003/0134344 (Mass et al). Дивіться, також, US 2003/0152987, Cohen et al., що стосується імуногістохімії (ІНС) і флуоресценції in situ гібридизації (FISH) для детектування надмірній експресії і ампліфікації HER2. WO 2004/053497 і US 2004/024815A1 (Bacus et al), також як і US 2003/0190689 (Crosby and Smith), стосуються визначення або прогнозування відповіді на лікування трастузумабом. US 2004/013297А1 (Bacus et al.) стосується визначення або прогнозування відповіді на лікування АВХО303 EGFR антитілом. WO 2004/000094 (Bacus et al.) стосується визначення відповіді на GW572016, низькомолекулярну сполуку, інгібітор EGFR-HER2 тирозинкінази. WO 2004/063709, Amler et al., стосується біомаркерів і способів визначення чутливості до EGFR інгібітора, ерлотиніб НСI. US 2004/0209290, Cobleigh et al., стосується маркерів, що експресуються геном, для прогнозування раку молочної залози. Пацієнти, що лікуються, пертузумабом можна вибирати для лікування ґрунтуючись на активації або димеризації HER. Патентними публікаціями, що стосуються пертузумабу і вибору пацієнтів для їх наступного лікування є: WO 01/00245 (Adams et al); US 2003/0086924 (Sliwkowski, Μ.); US 2004/0013667A1 (Sliwkowski, M.); також як і WO 2004/008099A2 і US 2004/0106161 (Bossenmaier et al). Cronin et al. Am. J. Path. 164(1): 35-42 (2004) описують вимірювання експресії гена в архівних залитих парафіном тканинах. Ma et al. Cancer Cell 5:607-616 (2004) описує дослідження гена за допомогою мікрочіпу олігонуклеотиду гена використовуючи виділену РНК з частин пухлинних тканин відібраних з архівних первинних біопсій. Пертузумаб (також відомий як рекомбінантне моноклолнальне антитіло людини 2С4; OMNITARG™, Genentech, Inc, South San Francisco) представляє перший член в новому класі агентів відомих як інгібітори димеризації HER (HDI) і дія якого полягає у інгібуванні здатності HER2 утворювати активні гетеродимери з іншими HER рецепторами (такими як EGFR/HER1, HER3 і HER4) і є активним незалежно від рівня експресії HER2. Ди 9 віться, наприклад, Harari and Yarden Oncogene 19:6102-14 (2000); Yardenand Sliwkowski. Nat Rev Моl Cell Biol 2:127-37 (2001); Sliwkowski Nat Struct Biol 10:158-9 (2003); Cho et al Nature 421:756-60 (2003); і Malik et al. Pro Am Soc Cancer Res 44:1767 (2003). Блокада пертузумабом утворення HER2-HER3 гетеродимерів в клітинах пухлини проявляється критичним інгібуванням передачі сигналів клітин, що призводить до зменшення проліферації клітин і збільшення виживаності (Agus et al. Cancer Cell 2:127-37 (2002)). Пертузумаб був досліджений як індивідуальний агент в клінічних дослідженнях фази Іа на пацієнтах з раком, що розвивається, і дослідженнях фази II на пацієнтах з раком яічників і раком молочної залози, також як і раком легені і раком простати. На Фазі І досліджень, пацієнтів з невиліковними, локально розташованими, рекурентними або метастатичними солідними пухлинами, що розвивались під час або після стандартного лікування, лікували із застосуванням пертузумабу, який вводили внутіршньовенно кожні 3 тижні. Пертузумаб загалом добре переносився. Регресії пухлини досягали у 3 з 20 пацієнтів придатних для оцінки відповіді. Два пацієнти мали підтверджені часткові відповіді. Стабільне захворювання, що триває більше ніж 2,5 місяців, спостерігали у 6 з 21 пацієнтів (Agus et al. Pro Am Soc Clin Oncol 22:192 (2003)). При дозах 2,0-15 мг/кг, фармакокінетика пертузумабу була лінійною, значення кліренсу знаходилось в інтервалі від 2,69 до 3,74 мл/день/кг і значення кінцевого граничного часу напіврозкладу знаходилось в інтервалі від 15,3 до 27,6 днів. Антитіла на пертузумаб не детектувались (Allison et al. Pro Am Soc Clin Oncol 22:197 (2003)). Представлений винахід забезпечує клінічні дані лікування ракових пацієнтів з використанням інгібітора димеризації HER, пертузумабу. Пацієнтів оцінювали по активації HER, що визначали використовуючи біодослідження фосфо-ELISA. Клінічна користь, як виміряно за часом розвитку захворювання (ТТР) і виживаності, спостерігалась у пацієнтів у вигляді активації HER. Відповідно, винахід забезпечує спосіб збільшення часу розвитку захворювання (ТТР) або виживаності у пацієнта хворого на рак, що включає введення пацієнтові інгібітора димеризації HER в кількості, яка викликає збільшення ТТР або виживаності пацієнта, де рак пацієнта проявляється у активуванні HER. Винахід також стосується способу збільшення часу розвитку захворювання (ТТР) або виживаності пацієнта з раком яічників, раком очеревини або раком фаллопієвих труб, що включає введення пацієнтові пертузумабу в кількості, яка викликає збільшення ТТР або виживаності у пацієнта, де рак пацієнта проявляється у активуванні HER2. На Фіг. 1 показана схематична структура HER2 протеїну і амінокислотні послідовності доменів I-IV (SEQ ID NO 19-22, відповідно) їх зовнішньоклітинних доменів. На Фіг. 2А і 2В зображені порівняння амінокислотних послідовностей змінних легких (Vl) (Фіг. 2А) і змінних важких (VH) (Фіг. 2В) доменів моноклона 95902 10 льного антитіла миші 2С4 (SEQ ID NO 1 і 2, відповідно); VL і VH домени варіанту 574/пертузумаб (SEQ ID NO 3 і 4, відповідно), і VL і VH консенсусних каркасів людини (hum кі, легка капа підгрупа І; humlll, важка підгрупа III) (SEQ ID NO 5 і 6, відповідно). Зірочки вказують різниці між варіабельними доменами пертузумабу і моноклонального антитіла миші 2С4 або між варіабельними доменами пертузумабу і каркасом людини. Гіперваріабельні ділянки (CDR) знаходиться в квадратних дужках. На Фіг. 3А і 3В показана амінокислотні послідовності легкого ланцюга пертузумабу (Фіг. 3А; SEQ ID NO. 13) і важкого ланцюга (Фіг. 3В; SEQ ID NO 14). CDR показані жирним. Розрахована молекулярна маса легкого ланцюга і важкого ланцюга становить 23526,22 Да і 49216,56 Да (цистеїни у відновленій формі). Карбогідратний замісник приєднаний до Asn 299 важкого ланцюга. На Фіг. 4 зображено, схематично, зв'язування 2С4 по гетеродимерному місцю зв'язування HER2, таким чином попереджаючи гетеродимеризацію з активованим EGFR або HER3. На Фіг. 5 зображено шляхи конденсування HER2/HER3 у МАРK і Akt. На Фіг. 6 порівнюються різні активності трастузумабу і пертузумабу. На Фіг. 7А і 7В показано амінокислотні послідовності легкого ланцюга трастузумабу (Фіг. 7А; SEQ ID NO 15) і важкого ланцюга (Фіг. 7В; SEQ ID NO 16), відповідно. На Фіг. 8 А і 8В зображено варіанти послідовності легкого ланцюга пертузумабу (Фіг. 8A; SEQ ID NO 17) і варіанти послідовності важкого ланцюга пертузумабу (Фіг. 8В; SEQ ID NO 18), відповідно. На Фіг. 9 показана базові демографічні дані пацієнтів, що лікували в Прикладі 1. На Фіг. 10 показано всі 3-4 шкідливі проявлення (незалежно від зв'язку з лікуванням). На Фіг. 11 серйозні шкідливі проявлення (незалежно від зв'язку з лікуванням). На Фіг. 12 підсумовано серйозні шкідливі проявлення оцінені відносно до дослідження із застосуванням лікарського засобу до піддослідних. На Фіг. 13 показана інформація по певним шкідливим проявленням. На Фіг. 14 зображено серйозні серцеві шкідливі проявлення і шкідливі проявлення, що потребують негайного повідомлення. На Фіг. 15 підсумовано дієвість результатів для фази II дослідження пертузумабу в Прикладі 1. На Фіг. 16 показаний ефективний час розвитку захворювання (ТТР) для суб'єктів з оцінюваним раком яічників, що лікували використовуючи або низьку дозу (420 мг) або високу дозу (1050 мг) пертузумабу. На Фіг. 17 показана загальна виживаність для суб'єктів з оцінюваним раком яічників, що лікували використовуючи або низьку дозу (420 мг) або високу дозу (1050 мг) пертузумабу. Історично, середнє виживання для суб'єктів з раком яічників, що лікували топотеканом, становило 43 тижні, і що лікували ліпосомальним доксорубіцином становило 36 тижнів. 11 На Фіг. 18 показана СА-125 відповідь для суб'єктів з раком яічників, що лікували або 420 мг, або 1050 мг пертузумабу. На Фіг. 19 показаний статус фосфо-НЕR2 (pHER2), як визначено за ELISA, для суб'єктів з раком яічників, що лікували використовуючи 420 мг пертузумабу. На Фіг. 20 показані ефективні клінічні результати статусу pHER2, як визначено за ELISA, для суб'єктів з раком яічників, що лікували використовуючи 420 мг пертузумабу. На Фіг. 21 показаний статус pHER2, як визначено за ELISA, для суб'єктів з раком яічників, що лікували використовуючи 420 мг пертузумабу, що проявляє очевидну активність (часткова відповідь, PR, або стабільне захворювання, SD, протягом більше ніж 18 тижнів). BSLD стосується базисної суми найдовшого діаметру. На Фіг. 22 показана ТТР дія пристатусі pHER2. Суб'єктів з раком яічників лікували використовуючи 420 мг пертузумабу. Загальний ТТР становив 6,6 тижнів; ТТР у pHER позитивних суб'єктів становив 20,9 тижні; ТТР у pHER2 негативних суб'єктів становив 6,0 тижні; і ТТР у суб'єктів з невідомим статусом pHER2 становив 9,1 тижні. На Фіг. 23 зображено загальна виживаність при статусі pHER2 суб'єктів з раком яічників лікували використовуючи 420 мг пертузумабу. Історично, середнє виживання для суб'єктів з раком яічників, що лікували топотеканом, становило 43 тижні, і що лікували ліпосомальним доксорубіцином становило 36 тижнів. Детальний опис переважних втілень І. Визначення Тут "час розвитку захворювання" або "ТТР" стосується часу, загалом вимірюваного у тижнях або місяцях, від часу початку лікування (наприклад, з використанням інгібітора димеризації HER, такого як пертузумаб), до розвитку або погіршення раку. Такий розвиток може оцінити кваліфікований клініцист. У випадку раку яічників, наприклад, розвиток можна оцінити використовуючи RECIST (дивіться, наприклад, Therasse et al., J. Nat. Cancer Inst. 92(3): 205-216 (2000)). Вираз "збільшення ТТР" означає збільшення часу розвитку захворювання у пацієнта, що лікується, порівняно з пацієнтом, що не лікується (наприклад, відносно пацієнта, що не лікується із застосуванням інгібітора димеризації HER, такого пертузумаб), або відносно пацієнта, у якого не проявляється активування HER, і/або відносно пацієнта, якого лікують з використанням не схваленого протипухлинного агента (такого як топотекан або ліпосомальний доксорубіцин, де раком є рак яічників). Вираз "виживання" стосується пацієнта, що залишається жити, і включає загальне виживання, також як і розвиток вільного виживання. Вираз "загальне виживання" стосується пацієнта, що залишається жити, на певний період часу, такий як 1 рік, 5 років і т.і. від часу діагностування або лікування. Вираз "розвиток вільного виживання" стосується пацієнта, що залишається жити, без розвитку раку або набуття погіршання. 95902 12 Вираз "збільшення виживання" означає збільшення загального або розвиток вільного виживання у пацієнта, що лікується, порівняно з пацієнтом, що не лікуються (наприклад, відносно пацієнта, що не лікується з використанням інгібітора димеризації HER, такого як пертузумаб), або відносно пацієнта, у якого не проявляється активування HER, і/або відносно пацієнта, якого лікують з використанням схваленого протипухлинного агента (такого як топотекан або ліпосомальний доксорубіцин, де раком є рак яічників) Вираз "об'єктивна відповідь" стосується вимірюваної відповіді, включаючи повну відповідь (CR) або часткову відповідь (PR). Вираз "повна відповідь" або "CR" призначений для позначення зникнення всіх ознак раку у відповідь на лікування. Це не завжди означає виліковування від раку. Вираз "часткова відповідь" або "PR" стосується зменшення розміру однієї або більшої кількості пухлин або уражень, або розповсюдження раку в тілі, у відповідь на лікування. Вираз "HER рецептор" є рецептором протеїну тирозинкінази, який належить до родини HER рецептора і включає EGFR, HER2, HER3 і HER4 рецептори. HER рецептор буде загалом включати зовнішньоклітинний домен, який може зв'язувати HER ліганд і/або димеризуватись з іншою молекулою HER рецептора; ліпофільний трансмембранний домен; консервативний внутрішньоклітинний тирозинкіназовий домен; і карбокси-термінальний сигнальний домен, що приховує декілька тирозинових залишків, які можуть бути фосфорильовані. HER рецептор може мати "нативну послідовність" HER рецептора або її "варіант амінокислотної послідовності". Переважно HER рецептор є HER рецептором людини з нативною послідовністю. Терміни "ErbB1", "HER1", "рецептор фактора росту епідермісу" і "EGFR" використовуються тут поперемінно і стосуються EGFR, як описано, наприклад, в Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), включаючи його мутантні форми, що зустрічаються у природі (наприклад, делеційний мутант EGFR, як описано в Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)). erbB1 стосується гена, що кодує протеїновий продукт EGFR. Вирази "ЕrbВ2" і "HER2" використовуються тут поперемінно і стосуються HER2 протеїну людини описаного, наприклад, в Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) і Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986) (Інвентарний номер в банку генів Х03363). Термін АеrbВ2" стосується гена, що кодує ЕrbВ2 людини і "neu" стосується гена, що neu кодує р185 щура. Переважним HER2 є нативна послідовність HER2 людини. Тут, "зовнішньоклітинний домен HER2" або "HER2 ECD" стосується домену HER2, що знаходиться поза межами клітини, або прикріплений до мембрани клітини, або перебуває в циркуляції, включаючи його фрагменти. В одному з втілень, зовнішньоклітинний домен HER2 може включати чотири домени: "Домен І" (амінокислотні залишки приблизно 1-195; SEQ ID NO:19), "Домен II" (амінокислотні залишки приблизно 196-319; SEQ ID NO:20), "Домен III" (амінокислотні залишки приб 13 лизно 320-488: SEQ ID NO:21), і "Домен IV" (амінокислотні залишки приблизно 489-630; SEQ ID NO:22) (залишок пронумерований без сигнального пептиду). Дивіться Garrett et al. Моl Cell. 11: 495505 (2003), Cho et al. Nature 421: 756-760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004), and Plowman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993), також як і Фіг. 1, тут. "ЕrbВ3" і "HER3" стосується рецептора - поліпептиду, як описано, наприклад, в патенті US № 5,183,884 і 5,480,968 також як і Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989). Терміни "ErbB4" і "HER4", тут, стосуються рецептора - поліпептиду, як описано, наприклад, в патентній заявці ЕР № 599,274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); і Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), включаючи його ізоформи, наприклад, як описано в WO 99/19488, що опублікована 22 квітня 1999. Вираз "HER ліганд" означає поліпептид, який зв'язує і/або активує HER рецептор. Особливо цікавим тут HER лігандом є HER ліганд людини з нативною послідовністю, такий як фактор росту епідермісу (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)); трансформуючий фактор росту альфа (TGF-α) (Marquardt et al., Science 223:1079-1082(1984)); амфірегулін, також відомий як шванома або кератиноцит аутокринний фактор росту (Shoyab et al. Science 243:1074-1076 (1989); Kimura et al., Nature 348:257-260 (1990); і Cook et al. Моl Cell. Biol 11:2547-2557 (1991)); бетацелулін (Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993); і Sasada et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)); гепарин-зв'язуючий фактор росту епідермісу (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)); епірегулін (Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270:7495-7500(1995); і Komurasaki et al. Oncogene 15:2841-2848 (1997)); херегулін (дивіться нижче); неурегулін-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)); неурегулін-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad Sci. 94:9562-9567 (1997)); неурегулін-4 (NRG-4)(Harari et al. Oncogene 18:2681-89(1999)); і крипто (СR-1) (Kаnnаn еt аl. J Biol. Chem. 272(6):3330-3335 (1997)). HER ліганди, які зв'язують EGFR, включають EGF, TGF-α, амфірегулін, бетацелулін, HBEGF і епірегулін. HER ліганди, які зв'язують HER3, включають херегуліни. HER ліганди, що здатні зв'язувати HER4, включають бетацеллулін, епірегулін, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 і херегуліни. "Херегулін" (HRG), коли тут використовується, стосується поліпептиду, що кодується херегуліновим геном, як описано в патенті U.S. № 5,641,869, або Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993). Прикладами херегулінів є херегулін-α, херегулінβ1, херегулін-β2 і херегулін-β3 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); і патент U.S. № 5,641,869); nеu диференційований фактор (NDF) (Peles et al. Cell 69:205-216(1992)); індукуючий активність ацетилхоліновий рецептор (ARIA) (Falls et al. Cell 72:801-815 (1993)); гліальні фактори росту (GGFs) (Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)); сенсорно і моторно нейроннопохідний фактор (SMDF) (Ho et al. J. Biol. Chem. 270:14523 95902 14 14532 (1995)); γ-херегулін (Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394(1997)). "HER димер", тут, є нековалентно зв'язаним димером, що містить, принаймні, два HER рецептори. Такі комплекси можуть утворюватись, коли клітини, які експресують два або більшу кількість HER рецепторів, контактують з HER лігандом і можуть бути виділені за допомогою імуноосадження і проаналізовані з використанням SDS-PAGE, як описано, наприклад, в Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994). Інші протеши, такі як субодиниця рецептора цитокіну (наприклад, gp130) може бути зв'язана з димером. Переважно, HER димер включає HER2. "HER гетеро димер" тут є ковалентно зв'язаним гетеродимером, що включає принаймні два різні HER рецептори, такі як EGFR-HER2, HER2HER3 або HER2-HER4 гетеродимери. "HER інгібітор" є агентом, який перешкоджає активації або функціонуванню HER. Прикладами HER інгібіторів є HER антитіла (наприклад, EGFR, HER2, HER3 або HER4 антитіла); EGFR-націлені лікарські засоби; низькомолекулярні антагоністи HER; інгібітори HER тирозинкінази; подвійні інгібітори HER2 і EGFR тирозинкінази, такі як лапатініб/GW572016; анти смислові молекули (дивіться, наприклад, WO 2004/87207); і/або агенти, що зв'язують або перешкоджають функціонуванню даунстрім сигнальних молекул, такі як МАРK або Akt (дивіться Фіг. 5). Переважно, HER інгібітором є антитіло або низькомолекулярна молекула, що зв'язує HER рецептор. "Інгібітором димеризації HER" є агент, який інгібує утворення HER димеру або HER гетеродимеру. Переважно, інгібітором димеризації HER є антитіло, наприклад, антитіло, яке зв'язує HER2 по його гетеродимерному сайту зв'язування. Найбільш переважним інгібітором димеризації HER тут є пертузумаб або МАb 2С4. Зв'язування 2С4 з гетеродимерним сайтом зв'язування HER2 показано на Фіг. 4. Іншими прикладами інгібітора димеризації HER є антитіла, які зв'язують EGFR і інгібують його димеризацію з одним або більшою кількістю інших HER рецепторів (наприклад, моноклональне антитіло EGFR 806, МАb 806, яке зв'язує активований або "неприв'язаний" EGFR; дивіться Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):3037530384 (2004)); антитіла, які зв'язують HER3 і інгібують його димеризацію з одним або більшою кількістю інших HER рецепторів; антитіла, які зв'язують HER4 і інгібіують його димеризацію з одним або більшою кількістю інших HER рецепторів; інгібітори димеризації пептиду (патент US № 6,417,168); інгібітори димеризації анти смислових послідовностей; і т.і. "Інгібітором димеризації HER2" є агент, що інгібіує утворення димеру або гетеродимеру, включаючи HER2. "HER антитілом" є антитіло, що зв'язує HER рецептор. Необов'язково, HER антитіло також перешкоджає активації або функціонуванню HER. Переважно, HER антитіло зв'язує HER2 рецептор. Особливо цікавим тут HER2 антитілом є пертузумаб. Іншим прикладом HER2 антитіла є трастузу 15 маб. Прикладами EGFR антитіл є цетуксимаб і АВХО303. Вираз "активація HER" стосується активації або фосфорилювання будь-якого одного або більшої кількості HER рецепторів. Загалом, активація HER призводить до передачи сигналу (наприклад, що викликається внутрішньоклітинним доменом кінази HER рецептора, який фосфорилює залишки тирозину HER рецептора або поліпептиду субстрату). Активація HER може бути опосередкована зв'язуванням HER ліганду з HER димером, що містить цікавий HER рецептор. HER ліганд, що зв'язує HER димер, може активувати домен кінази одного або більшої кількості HER рецепторів в димері і таким чином викликати фосфорилювання тирозинових залишків в одному або більшій кількості HER рецепторів і/або фосфорилювання тирозинових залишків в додатковому поліпептидному субстраті(ах), таких як внутрішньоклітинні кінази Akt або МАРK, дивіться, наприклад, Фіг. 5. Вираз "фосфорилювання" стосується додавання одного або більшої кількості фосфатних груп(и) до протеїну, такого як HER рецептор або його субстрат. Антитілом, яке "інгібує димеризацію HER" є антитіло, яке інгібує або перешкоджає утворенню HER димеру. Переважно, таке антитіло зв'язує HER2 по його гетеродимерному сайту зв'язування. Найбільш переважним антитілом, яке інгібує димеризацію HER, тут є пертузумаб або MAb 2C4. Зв'язування 2С4 з гетеродимерним сайтом зв'язування HER2 показано на Фіг. 4. Іншими прикладами антитіл, які інгібують димеризацію HER, є антитіла, які зв'язують EGFR і інгібують його димеризацію з одним або більшою кількістю інших HER рецепторів (наприклад, моноклональне антитіло EGFR 806, МАb 806, яке зв'язує активований або "неприв'язаний" EGFR; дивіться Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)); антитіла, які зв'язують HER3 і інгібують його димеризацію з одним або більшою кількістю інших HER рецепторів; антитіла, які зв'язують HER4 і інгібують його димеризацію з одним або більшою кількістю інших HER рецепторів. Антитілом, яке "блокує активацію ліганду HER рецептора більш ефективно ніж трастузумаб" є антитіло, яке зменшує або виключає активацію HER лігандом HER рецептора(ів) або HER димера(ів) більш ефективно (наприклад, принаймні, приблизно в 2-рази більш ефективно) ніж трастузумаб. Переважно, таке антитіло блокує активацію HER лігандом HER рецептора, принаймні, приблизно так само ефективно як моноклональне антитіло миші 2С4 або його фрагмент Fab, або як пертузумаб або його фрагмент Fab. Можна оцінити здатність антитіла блокувати активацію лігандом HER рецептора шляхом дослідження безпосередньо HER димерів, або шляхом оцінки активації HER, або даунстрім сигналізуванням, яке є наслідком HER димеризації, і/або шляхом оцінки сайту зв'язування антитіло-HER2, і т.і. Дослідження по визначенню антитіл із здатністю інгібувати активацію лігандом HER рецептора більш ефективно ніж трастузумаб описуються в Agus et al. Cancer Cell 95902 16 2: 127-137 (2002) і WO 01/00245 (Adams et al.). Тільки як приклад, можна привести дослідження: інгібування утворення HER димеру (дивіться, наприклад, Фіг. 1А-В Agus et al. Cancer Cell 2: 127137 (2002); і WO 01/00245); зменшення в клітинах, які експресують HER димери, активації HER лігандом (WO 01/00245 і Фіг. 2А-В Agus et al. Cancer Cell 2:127-137 (2002), наприклад); блокування в клітинах, які експресують HER димери, зв'язування HER лігандом (WO 01/00245, і Фіг. 2Е Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002), наприклад); інгібування росту ракових клітин (наприклад, MCF7, MDA-MD-134, ZR-75-1, MD-MB-175, Т-47D клітин), які експресують HER димери, в присутності (або відсутності) HER ліганду (WO 01/00245 і Фіг. 3A-D Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002), наприклад); інгібування даунстрім сигналізування (наприклад, інгібування HRG-залежного АКТ фосфорилювання або інгібування HRG- або TGFαзалежного МАРK фосфорилювання) (дивіться, WO 01/00245, і Фіг. 2C-D Agus et al. Cancer Cell 2:127137 (2002), наприклад). Також можна оцінити, чи буде антитіло інгібувати димеризацію HER, шляхом дослідження сайту зв'язування антитілоHER2, наприклад, через оцінку структури або моделі, такої як структура кристалу антитіла зв'язаного з HER2 (дивіться, наприклад, Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)). "Сайт зв'язування гетеродимеру" на HER2 стосується регіону в зовнішньоклітинному домені HER2, що контактує або взаємодіє з регіоном в зовнішньоклітинному домені EGFR, HER3 або HER4 при утворенні ними димеру. Регіон знаходиться в Домені IIHER2. Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004). HER2 антитіло може "інгібувати HRG-залежне фосфорилювання АКТ" і/або інгібувати "HRG- або TGFα-залежне МАРK фосфорилювання" більш ефективно (наприклад, принаймні, в 2-рази більш ефективно) ніж трастузумаб (дивіться Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002) і WO 01/00245, тільки як приклад). HER2 антитілом може бути антитіло, яке, подібно пертузумабу, "не інгібує розщеплення ектодомену HER2" (Molina et al. Cancer Res. 61:47444749(2001)). Трастузумаб, з іншого боку, може інгібувати розщеплення ектодомену HER2. HER2 антитіло, що "зв'язує гетеродимерний сайт зв'язування" HER2, зв'язує залишки на домені II (і, необов'язково, також зв'язує залишки в інших доменах зовнішньоклітинного домену HER2, таких як домени І і III), і може стерично утруднювати, принаймні, до деякої міри, утворення HER2-EGFR, HER2-HER3 або HER2-HER4 гетеро димеру. Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004) характеризують кристалічну структуру HER2-пертузумаб, що була депонована до RCSB Protein Data Bank (ID Code IS78), яка ілюструє зразок антитіла, що зв'язується з гетеродимерним сайтом зв'язування HER2. Антитіло, що "зв'язує домен II" HER2, зв'язує залишки на домені II і, необов'язково, залишки на інших доменах(і) HER2, таких як домени І і III. Переважно, антитіло, що зв'язує домен II, зв'язується в місці з'єднання домів І, II і III HER2. 17 Вираз "експресія" протеїну стосується перетворення закодованої в гені інформації в інформаційну РНК (іРНК) і потім у протеїн. Тут, цікавим зразком або клітиною, що "екпресує" протеїн (такий як HER рецептор або HER ліганд) є зразок або клітина, в якій визначається присутність іРНК, що кодує протеїн або протеїн, що включає його фрагменти, в зразку або клітині. Методика "полімеразної ланцюгової реакції" або "PCR", як тут використовується, загалом стосується процедури, при якій мінімальні кількості певного виду нуклеїнової кислоти, РНК і/або ДНК, ампліфікуються як описано в патенті US № 4,683,195, що виданий 28 липня 1987. Загалом, інформаційна послідовність з кінців цікавого регіону або далі обов'язково стає доступною, так що можна створювати олігонуклеотидні праймери; ці праймери будуть ідентичними або подібними послідовності протилежних ланцюгів шаблону, що і ампліфікується. 5 термінальні нуклеотиди двох праймерів можуть співпадати кінцями ампліфкованого матеріалу. PCR може бути використаний для ампліфікації певних послідовностей РНК, певних послідовностей ДНК із загальної геномної ДНК, і кДНК транскрибованої із загальної клітинної РНК, бактеріофагу або послідовностей плазміди, і т.і. Дивіться загалом Mullis et ah, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioh, 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Як тут використовується, PCR розглядається як один, але не тільки, приклад способу полімеразної реакції нуклеїнової кислоти для ампліфікації зразка нуклеїнової кислоти, що тестується, що включає застосування відомої нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) як праймера і застосування полімерази нуклеїнової кислоти для ампліфікації або генерування певного виду нуклеїнової кислоти, який є комплементарним певній нуклеїновій кислоті. "Кількісна полімеразна ланцюгова реакція в режимі реального часу" або "qRT-PCR" стосується форми PCR, в якій кількість PCR продукту вимірюється на кожній стадії PCR реакції. Ця методика була описана в різних публікаціях включаючи Cronin et al., Am. J. Pathol. 164(1):35-42 (2004); і Ma et al., Cancer Cell 5:607-616 (2004). Термін "мікрочіп" стосується порядку розташування елементів, що піддаються гібридизації, переважно полінуклеотидних зондів, на субстраті. Термін "полінуклеотид," коли використовується у однині або множині, загалом стосується буякого полірибонуклеотиду або полідеоксирибонуклеотиду, який може бути не модифікованою РНК або ДНК або модифікованою РНК або ДНК. Таким чином, наприклад, полінуклеотидами, як тут визначено, є, без обмеження, одно- і дво-ланцюгові ДНК, ДНК включають одно- і дво-ланцюгові регіони, одно- і дво-ланцюгові РНК, і РНК включає одно- і дво-ланцюгові регіони, гібридні молекули, що включають ДНК і РНК, що можуть бути одноланцюговими або, більш типово, дво-ланцюговими або включати одно- і дво-ланцюгові регіони. Крім того, термін "полінуклеотид", як тут використовується, стосується тричі-ланцюгових регіонів, що включають РНК або ДНК або і РНК, і ДНК. Ланцюги в таких регіонах можуть бути від однієї і тієї ж са 95902 18 мої молекули або від різних молекул. Регіони можуть включати всі з однією або більшої кількості молекул, але більш типово включати тільки регіон тих же самих молекул. Одна з молекул тричіспірального регіону часто є олігонуклеотидом. Термін "полінуклеотид" специфічно включає кДНК. Термін включає ДНК (включаючи кДНК) і РНК, що містять одну або більшу кількість модифікованих основ. Таким чином, ДНК або РНК із скелетами модифікованими для забезпечення стабільності або з інших причин є "полінуклеотидами", як передбачено цим терміном тут. Однак, в межі терміна "полінуклеотиди" включені ДНК або РНК, що містять незвичні основи, такі як інозин, або модифіковані основи, такі як мічені тритієм основи, як тут визначено. Загалом, термін "полінуклеотид" охоплює всі хімічно, ферментно і/або метаболітично модифіковані форми немодифікованих полінуклеотидів, також як і хімічні форми ДНК і РНК характеристичних вірусів і клітин, включаючи прості і складні клітини. Термін "олігонуклеотид" стосується відносно короткого полінуклеотиду, включаючи, без обмеження, одно-ланцюгові деоксирибонуклеотиди, одноабо дво-ланцюгові рибонуклеотиди, РНК:ДНК гібриди і дво-ланцюгові ДНК. Олігонуклеотиди, такі як одно-ланцюгові ДНК олігонуклеотидні зонди, часто синтезуються за допомогою хімічних способів, наприклад, використовуючи автоматичні олігонуклеотидні синтезатори, що є комерційно доступними. Однак, олігонуклеотиди можна одержати використовуючи різноманіття інших способів, включаючи in vitro методики рекомбінантних ДНК і використовуючи експресію ДНК в клітинах і організмах. Фраза "ампліфікація гена" стосується процесу, в якому формується багато копій гена або фрагментів гена в певній клітині або ліній клітин. Дуплікований регіон (ланцюг ампліфікованої ДНК) часто називається як "амплікон". Зазвичай, кількість інформаційної РНК (ІРНК), що продукується, також збільшується пропорційно кількості копій виготовленого певного гена, що експресується. "Жорсткість" гібридизації легко визначить середній спеціаліст в цій галузі техніки, і загалом емпірично розраховується в залежності від довжини зонду, температури промивання і концентрації солі. Загалом, довші зонди потребують вищих температур для специфічної гібридизації, в той час як коротші зонди потребують менших температур. Гібридизація загалом залежить від здатності денатурованої ДНК регібридизувати, коли комплементарні ланцюги присутні в навколишньому середовищі нижче їх температури плавлення. Вищій ступінь бажаної гомології між зондом і послідовністю, що здатна до гібридизації, відповідає вищій відносній температурі, яка може бути використана. Як наслідок, з цього випливає, що вищі відносні температури будуть мати тенденцію забезпечувати більш жорсткі умови реакції, в той час як нижчі температури менші. Для ознайомлення з додатковими деталями і трактуванням жорсткості реакцій гібридизації, дивіться Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995). 19 "Жорсткі умови" або "високожорсткі умови", як тут визначено, типово: (1) використання низько іонних концентрацій і високої температури для промивання, наприклад 0,015 Μ хлорид натрію/0,0015 Μ цитрат натрію/0,1% додецилсульфат натрію при 50°С; (2) використання під час проведення гібридизації денатуруючого агента, такого як формамід, наприклад, 50% (об/об) формаміду з 0,1% бичачого сироваткового альбуміну/0,1% Ficoll/0,1% полівінілпіролідон/50 мМ буфер фосфату натрію при рН 6,5 з 750 мМ хлориду натрію, 75 мМ цитрату натрію при 42°С; або (3) використання 50% формаміду, 5 × SSC (0,75 MNaCl, 0,075 Μ цитрат натрію), 50 мМ фосфату натрію (рН 6,8), 0,1% пірофастфату натрію, 5 × розчин Денхардта, ДНК сонікованої сперми лосося (50 &gr; г/мл), 0,1% SDS, і 10% сульфат декстрану при 42°С, з промиванням при 42°С в 0,2 × SSC (хлорид натрію/цитрат натрію) і 50% формамід при 55°С, з наступним високо-жорстким промиванням, що включає 0,1 × SSC, який містить EDTA, при 55°С. "Помірно жорсткі умови" можуть бути визначені як описано Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, і включають застосування промивного розчину і умов гібридизації (наприклад, температури, іонної сили і % SDS) менш жорстких, ніж це було описано вище. Прикладом помірно жорстких умов є інкубування протягом ночі при 37°С в розчину, що містить: 20% формаміду, 5 × SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ цитрату тринатрію), 50 мМ фосфату натрію (рН 7,6), 5 × розчин Денхардта, 10% сульфату декстрану і 20 мг/мл денатурованої зсувом ДНК сперми лосося, з наступним промиванням фільтрів 1 × SSC приблизно при 37-50°С. Спеціалісту в цій галузі повинно бути зрозуміло, як підкоригувати температуру, іонну силу і т.і., коли це необхідно для підгонки факторів, таких як довжина зонду і т.і.. Вираз "нативна послідовність" поліпептиду є послідовністю, яка має ту ж саму амінокислотну послідовність як і поліпептид (наприклад, HER рецептор або HER ліганд) одержаний з природного джерела, включаючи ті, що зустрічаються в природі, або алельні варіанти. Такі поліпептиди з нативною послідовністю можна виділити з природного джерела або можна одержати використовуючи рекомбінантні або синтетичні засоби. Таким чином, поліпептид з нативною послідовністю може мати амінокислотну послідовність поліпептиду людини, поліпептиду миші або поліпептиду з будьяких інших видів ссавців, що зустрічаються у природі. Термін "антитіло" тут використовується у широкому сенсі і специфічно охоплює моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла), і фрагменти антитіл, доки вони проявляють бажану біологічну активність. Термін "моноклональне антитіло", як тут використовується, стосується антитіла з популяції, по суті, гомогенних антитіл, наприклад, індивідуальних антитіл, що включають популяцію, яка є ідентичною і/або зв'язаною тим же самим епітопом(ами), за винятком можливих варіантів, що 95902 20 можуть виникати під час продукування моноклонального антитіла, такого як варіанти, що зазвичай присутні в незначних кількостях. Таким моноклональним антитілом типово є антитіло, що містить поліпептидну послідовність, яка зв'язує ціль, де цілезв'язувальна поліпептидна послідовність одержана за допомогою процесу, що включає вибір окремої цілезв'язувальної поліпептидної послідовності з множини поліпептидних послідовностей. Наприклад, вибраний процес може допомогти вибрати унікальний клон з множин клонів, таких як група клонів гібридоми, фагових клонів або клонів рекомбінантної ДНК. Повинно бути зрозуміло, що вибір цілезв'язувальної послідовності може в подальшому бути змінений, наприклад, для покращення спорідненості до цілі, гуманізації цілезв'язувальної послідовності, покращення її продукування в культурі клітин, зменшення її імуногенності in vivo, створення мультиспецифічного антитіла, і т.і., і що антитіло, яке включає змінену цілезв'язувальну послідовність, також є моноклональним антитілом цього винаходу. На противагу поліклональному антитілу рецептури якого типово включають різні антитіла проти різних детермінантів (епітопів), кожне моноклональне антитіло рецептури моноклонального антитіла спрямоване проти окремого детермінанту на антигені. На додаток до їх специфічності, рецептури моноклонального антитіла є корисними тому, що вони є типово незабрудненими іншими імуноглобулінами. Модифікатор "моноклональне" вказує на характер антитіла, яке є одержаним з, по суті, гомогенної популяції антитіл, і не конструюється при необхідності одержання антитіла будь-яким певним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, що використовуються у відповідності з представленим винаходом можна одержати використовуючи різні методики, включаючи, наприклад, метод гібридоми (наприклад, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antybodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N. Y., 1981)), методи рекомбінантної ДНК (дивіться, наприклад, патент US № 4,816,567), технології фагового дисплею (дивіться, наприклад, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Моl Biol, 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Моl. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Моl. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad Set USA 101 (34): 12467-12472 (2004); і Lee et al. J. Immunol Methods 284(1-2): 119-132 (2004), методики одержання антитіл людини або людиноподібних антитіл в тваринах, що мають частини або всі імуноглобулінові локуси людини або гени, що кодують імуноглобуліни людини (дивіться, наприклад, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); патент U.S. № 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (всі належать фірмі GenPharm); патент U.S. № 5,545,807; WO 1997/17852; патенти US № 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; і 5,661,016; Marks 21 et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); і Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)). Моноклональні антитіла тут специфічно включають "химерні" антитіла в яких частина важкого і/або легкого ланцюга є ідентичною з або гомологічною відповідним послідовностям в антитілах одержаних з певних видів або що належать певному класу або підкласу антитіла, в той час як ланцюг(и), що залишились, є ідентичними з або гомологічними відповідним послідовностям в антитілах одержаних з інших видів або що належать іншому класу або підкласу антитіла, також як і фрагменти таких антитіл, доки вони проявляють бажану біологічну активність (патент US № 4,816,567; і Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерними антитілами, що представляють тут інтерес, є "приматовані" антитіла, що включають варіабельний домен антиген-зв'язуючих видів, що є похідним від нелюдського примату (наприклад, Old World Monkey, Ape etc) і неваріабельні регіони послідовності людини, також як і "гуманізовані" антитіла. "Гуманізовані" нелюдські форми (наприклад, гризуни) антитіл є химерними антитілами, що містять мінімальну послідовність одержану з нелюдського імуноглобуліну. Для найбільшої частини, гуманізованими антитілами є імуноглобуліни людини (реципієнтне антитіло), в якому залишки з гіперваріабельного регіону реципієнта є заміненими залишками з гіперваріабельного регіону видів, що не відносяться до нелюдських (донор антитіла), таких як миші, щури, кролі або примати окрім людини, що мають бажану специфічність, спорідненість і здатність. В деяких випадках, залишки каркасної області (FR) імуноглобуліну людини заміщують відповідними нелюдськими залишками. Крім того, гуманізовані антитіла можуть включати залишки, що не присутні в антитілі реципієнта або в антитілі донора. Ці модифікації призводять до подальшого покращення характеристики антитіла. Загалом, гуманізоване антитіло буде включати, по суті, всі з принаймні одного, і типово двох, варіабельних доменів, в яких всі або, по суті, всі гіперваріабельні петлі відповідають таким в імуноглобуліні нелюдини і всі або, по суті, всі з FR є каркасними областями послідовності імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло, необов'язково, також буде включати, принаймні, частину константної області імуноглобуліну (Fc), типово, що імуноглобуліну людини. Для більш детального ознайомлення, дивіться Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); і Presta, Curr. Op. Struct. Вiol. 2:593-596 (1992). Гуманізованими антитілами HER2 є huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 і huMAb4D5-8 або трастузумаб (HERCEPTIN7). Як описано в Таблиці 3 патенту US 5,821,337, спеціально включеного сюди як посилання; гуманізовані 520С9 (WO93/21319); і гу 95902 22 манізовані 2С4 антитіла, такі як пертузумаб, як тут описано. Для представлених тут цілей, "трастузумаб", "HERCEPTIN®" і "huMAb4D5-8" відносяться до антитіла, що включає легкий і важкий ланцюг амінокислотної послідовності показаної в SEQ ID NOS. 15 і 16, відповідно. Тут, "пертузумаб" і "OMNITARG™" стосується антитіла, що включає легкий і важкий ланцюг амінокислотної послідовності показаної в SEQ ID NOS. 13 і 14, відповідно. Відмінності між функціями трастузумабу і пертузумабу показані на Фіг. 6. "Інтактним антитілом" тут є антитіло, яке включає два антигензв'язувальні регіони, і Fc область. Переважно, інтактне антитіло має функціональну Fc область. "Фрагменти антитіла" включають частину інтактного антитіла, переважно включають його антигензв'язувальний регіон. Прикладами фрагментів антитіла є Fab, Fab', F(ab')2 і Fv фрагменти; димери; лінійні антитіла; одно-ланцюгові молекули антитіл; і мультиспецифічні антитіла сформовані з фрагменту(ів) антитіл(а). "Нативні антитіла" зазвичай є гетеротетрамерними глікопротеїнами з масою 150000 дальтон, що включають два ідентичні легкі (L) ланцюги і два ідентичні важкі (Н) ланцюги. Кожен легкий ланцюг зв'язаний з важким ланцюгом за допомогою одного з ковалентних дисульфідних зв'язків, в той час як кількість дисульфідних зв'язків змінюється серед важких ланцюгів різних ізотипів імуноглобуліну. Кожен важкий і легкий ланцюг також має регулярно розташовані в межах ланцюга дисульфідні містки. Кожен важкий ланцюг має на одному з кінців варіабельний домен (Vh), що розташований за деякою кількістю константних доменів. Кожен легкий ланцюг має варіабельний домен на одному з кінців (Vl) і константний домен розташований на його іншому кінці. Константний домен легкого ланцюга вирівняють з першим константним доменом важкого ланцюга, і легкий ланцюг варіабельного домену вирівнюють з варіабельним доменом важкого ланцюга. Певні амінокислотні залишки, як припускають, утворюють стик між легким ланцюгом і важким ланцюгом варіабельних доменів. Термін "варіабельний" стосується того факту, що певні частини варіабельних доменів сильно відрізняються за послідовністю серед антитіл і використовуються при зв'язуванні і специфічності кожного певного антитіла для його певного антигену. Однак, варіабельність нерівномірно розповсюджена по всім варіабельним доменам антитіла. Він складається з трьох сегментів так званих гіперваріабельних областей і у легкому ланцюзі, і у важкому ланцюзі варіабельних доменів. Більш висококонсервативні частини варіабельних доменів є так звані каркасні області (FR). Кожен з варіабельних доменів нативного важкого і легкого ланцюгів складається з чотирьох FR, найбільше адаптованої /3-поверхневої конфігурації, з'єднаних за допомогою трьох гіперваріабельних областей, які утворюють петлі з'єднання, і в деяких випадках складає частину β-поверхневої структури. Гіперваріабельні області в кожному ланцюзі тримають 23 ся разом в близькості до кінця FR і з гіперваріабельними областями з іншого ланцюга, що сприяє утворенню антигензв'язуючого сайту антитіл (дивіться Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константні домени не включені безпосередньо у зв'язування антитіла з антигеном, але проявляють різні ефекторні функції, такі як участь антитіла в антитілозалежній клітинній цитотоксичності (ADCC). Термін "гіперваріабельна область", коли тут використовується, стосується амінокислотних залишків антитіла, які відповідають за зв'язування антигену. Гіперваріабельна область загалом включає амінокислотні залишки з "гіперваріабельної ділянки" або "CDR" (наприклад, залишки 24-34 (L1), 50-56 (L2) і 89-97 (L3) в легкому ланцюзі варіабельного домену і 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) і 95-102 (Н3) у важкому ланцюзі варіабельного домену; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) і/або ці залишки з "гіперваріабельної петлі" (наприклад, залишки 26-32 (L1), 50-52 (L2) і 91-96 (L3) в легкому ланцюзі варіабельного домену і 26-32 (Н1), 5355 (Н2) і 96-101 (Н3) у важкому ланцюзі варіабельного домену; Chothia and Lesk J. Моl. Biol. 196:901917 (1987)). Залишки "каркасної області" або "FR" є залишками залишків варіабельного домену іншими ніж залишки гіперваріабельної області, як тут визначено. Розщеплення папаїном антитіл дає два ідентичні антигензв'язувальні фрагменти, так звані "Fab" фрагменти, кожен з окремим антигензв'язувальним сайтом, і залишковий "Fc" фрагмент, назва якого відображає його здатність легко кристалізуватись. Обробка пепсином дає F(ab')2 фрагмент, що має два антигензв'язувальні сайти і все ще є здатним до зв'язування антигену. "Fv" є мінімальним фрагментом антитіла, який містить повний антиген-розпізнавальний і антигензв'язувальний сайт. Цей регіон складається з димеру одного важкого ланцюга і одного легкого ланцюга варіабельного домену в тісному нековалентному зв'язку. В цій конфігурації присутні три гіперваріабельні області кожного варіабельного домену, що взаємодіють з визначеним антигензв'язувальним сайтом на поверхні VH-VL димеру. Разом, шість гіперваріабельних областей надають антиген-зв'язувальну специфічність антитілу. Однак, навіть один варіабельний домен (або половина Fv, що містить тільки три гіперваріабельні області певного антигену) має здатність розпізнавати і зв'язувати антиген, хоча і з нижчою спорідненістю, ніж у повного сайту зв'язування. Fab фрагмент також містить константний домен легкого ланцюга і перший константний домен (СНІ) важкого ланцюга. Fab= фрагменти відрізняються від Fab фрагментів завдяки додаванню декількох залишків по карбоксикінцю важкого ланцюга СН1 домену, що включає один або більшу кількість цистеїнів з шарнірної ділянки антитіла. Fab'-SH використовується тут для позначення Fab', в якому цистеїновий залишок(и) константних 95902 24 доменів несуть, принаймні, одну вільну тіольну групу. F(ab')2 фрагменти антитіла первинно одержували як пари Fab' фрагментів, які мають шарнірні цистеїни між ними. Також відомі інші хімічні способи зв'язування фрагментів антитіла. "Легкі ланцюги" антитіл від будь-яких хребетних можна віднести до одного з двох безумовно окремих типів, так званих капа (κ) і лямбда (λ), виходячи з амінокислотної послідовності їх константних доменів. Термін "Fc область" тут використовується для визначення С-термінальної області важкого ланцюга імуноглобуліну, включаючи нативні послідовності Fc областей і варіанти Fc областей. Хоча межі Fc області важкого ланцюга імуноглобулін можуть змінюватись, Fc область важкого ланцюга IgG людини зазвичай визначається починаючи з амінокислотного залишку в положенні Cys226 або від Рrо230 до його карбоксикінця. С-термінальний лізин (залишок 447 згідно з системою нумерації EU) Fc області можна видалити, наприклад, під час одержання або очищення антитіла, або використовуючи методик генної інженерії нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг антитіла. Відповідно, склад інтактних антитіл може включати популяції антитіл у всіх з яких видалені K447 залишки, популяції антитіл, що не містять видалені K447 залишки і популяції антитіл, що мають суміш антитіл з або без K447 залишку. Якщо не вказано інше, тут нумерація залишків у важкому ланцюзі імуноглобуліну є такою як визначено в EU показнику як в Kabat et al., Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), спеціально включено сюди як посилання. "EU показник як в Kabat" стосується пронумерованого залишку IgG1 людини EU антитіла. "Функціональна Fc область" має "ефекторну функцію" нативної послідовності Fc області. Прикладом "ефекторних функцій" є зв'язування Clq; комплементзалежна цитотоксичність; зв'язування Fc рецептора; антитіло-залежна клітиноопосередкована цитотоксичність (ADCC); фагоцитоз; даун регуляція мембранних рецепторів (наприклад, рецептора В клітин; BCR), і т.і. Такі ефекторні функції загалом потребують Fc області для об'єднання із зв'язувальним доменом (наприклад, варіабельний домен антитіла) і може бути оцінений використовуючи різні дослідження, як тут описано, наприклад. "Нативна послідовність Fc області" включає амінокислотну послідовність ідентичну амінокислотній послідовності Fc області, що знаходиться в природі. Нативна послідовність Fc областей людини включає нативну послідовність Fc області IgG1 людини (не-А і А алотипи); нативну послідовність Fc області IgG2 людини; нативну послідовність Fc області IgG3 людини; і нативну послідовність Fc області IgG4 людини, також як і їх варіанти, що зустрічаються у природі. "Варіант Fc області" включає амінокислотну послідовність, яка відрізняється від нативної послідовності Fc області в силу, принаймні, однієї амінокислотної модифікації , переважно однієї або 25 більшої кількості амінокислотних заміщень(ня). Переважно, варіант Fc області має, принаймні, одне амінокислотне заміщення порівняно з нативною послідовністю Fc області або до Fc області вихідного поліпептиду, наприклад, від приблизно однієї до приблизно десяти амінокислотних замін і переважно від приблизно однієї до приблизно п'яти амінокислотних замін в нативній послідовності Fc області або в Fc області вихідного поліпептиду. Варіант Fc області тут буде переважно мати, принаймні, приблизно 80% гомологію з нативною послідовністю Fc області і/або з Fc областю вихідного поліпептиду і найбільш переважно, принаймні, приблизно 90% гомологію з нею, більш переважно, принаймні, приблизно 95% гомологію з нею. В залежності від амінокислотної послідовності константного домену її важких ланцюгів, інтактні антитіла можуть бути віднесені до різних "класів". Існує п'ять основних класів інтактних антитіл: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, і декілька з них можуть надалі розподілятись на "підкласи" (ізотипи), наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA і IgA2. Важко ланцюгові константні домени, що відповідають різним класам антитіл, називаються α, δ, ε, γ i μ, відповідно. Добре відомі субодиничні структури і три-вимірні конфігурації різних класів імуноглобулінів. "Антитіло-залежна клітиноопосередкована цитотоксичність" і "ADCC" стосується клітиноопосередкованої реакції, в якій неспецифічні цитотоксичні клітини, що експресують Fc рецептори (FcR) (наприклад, природні клітини кіллери (NK), нейтрофіли і макрофаги) розпізнають зв'язане антитіло на цільовій клітині і потім викликають лізис цільової клітини. Первинними клітинами для опосередкування ADCC, NK клітин, експресують тільки FcγRHI, тоді як моноцити експресують FcγRI, FcγRII і FcγRIII. FcR експресія на гематопоетичних клітинах приведена в Таблиці 3 на сторінці 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). При оцінці ADCC активності цікавої молекули може бути проведене in vitro ADCC дослідження, таке як те, що описано в патенті US № 5,500,362 або 5,821,337. Корисними ефекторними клітинами для таких досліджень є мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМС) і природні клітини кіллери (NK). Альтернативно, або додатково, ADCC активність молекули можна дослідити in vivo, наприклад, в тваринній моделі, такій як та, що описана в Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998). "Ефекторними клітинами людини" є лейкоцити, які експресують один або більшу кількість FcR і виконують ефекторні функції. Переважно, клітини експресують, принаймні, FcγRIII і виконують ADCC ефекторну функцію. Прикладами лейкоцитів людини, які опосередковують ADCC, є мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМС), природні клітини кіллери (NK), моноцити, цитотоксичні Τ клітини і нейтрофіли; і РВМС і ΝΚ клітини є переважними. Ефекторні клітини можуть бути виділені з їх природного джерела, наприклад, з крові або РВМС, як тут описано. Терміни "Fc рецептор" або "FcR" використовується для опису рецептора, що зв'язується з Fc областю антитіла. Переважним FcR є нативна по 95902 26 слідовність FcR людини. Однак, переважним FcR є рецептор, який зв'язує IgG антитіло (гамма рецептор) і включає рецептори FcγRI, FcγRII і FcγRIII підкласів, включаючи алель ні варіанти і, альтернативно, сплайсинговані форми цих рецепторів. FcγRII рецепторами є FcγRllA ("активаційний рецептор") і FcγRIIB ("інгібувальний рецептор"), які мають подібні амінокислотні послідовності, що відрізняються головним чином за їх цитоплазматичними доменами. Активаційний рецептор FcγRUA містить фрагмент активаційного тирозинзаснованого імунорецептора (ITAM) в його цитоплазматичному домені. Інгібувальний рецептор FcγRIIB фрагмент інгібувального тирозинзаснованого імунорецептора (ІТІМ) в його цитоплазматичному домені (дивіться огляд М. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcR розглядається Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); і de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Інші FcR, включаючи ті, що були ідентифіковані в майбутньому, охоплюються терміном тут "FcR". Термін також включає неонатальний рецептор, FcRn, який відповідає за трансфер материнських IgG до плода (Guyer et ah, J. Immunol. 117:587 (1976) і Kim et ah, J. Immunol. 24:249 (1994)), і регулює гомеостаз імуноглобулінів. "Комплемент залежна цитотоксичність" або "CDC" стосується здатності молекули лізувати ціль в присутності комплементу. Шлях активації комплементу починається із зв'язування першого компоненту комплементної системи (C1q) із молекулою (наприклад, антитіло), що комплексується із спорідненим антигеном. Для оцінки активації комплементу, може бути проведене CDC дослідження, наприклад, як описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Фрагменти "одно-ланцюгового Fv" або "scFv" антитіла включають VH і VL домени антитіла, де ці домени присутні в окремому поліпептидному ланцюзі. Переважно, Fv полі пептид також включає поліпептидний лінкер між VH і VL доменами, який дає можливість утворитись scFv бажаної структури для зв'язування антигену. Для огляду scFv дивіться Pliickthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). scFv фрагменти HER2 антитіла описуються в WO 93/16185; патенті US № 5,571,894; і патенті US № 5,587,458. Термін "димер" стосується маленьких фрагментів антитіла з двома антигензв'язувальними сайтами, де фрагменти включають варіабельні важкі домени (VH), що зв'язані з варіабельними легкими доменами (VL) в тому ж самому поліпептидному ланцюзі (VH - VL). При використанні лінкера, що є занадто коротким для забезпечення можливості парування між двома доменами на тому ж самому ланцюзі, домени примусова паруються з комплементарними доменами іншого ланцюга і утворюють два антигензв'язувальні сайта. Димери описані більш повно в, наприклад, ЕР 404,097; WO 93/11161; і Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Set USA, 90:6444-6448 (1993). 27 "Оголеним антитілом" є антитіло, що не є кон'югованим з гетерологічною молекулою, такою як цитотоксичний компонент або радіоактивна мітка. "Виділеним" антитілом є антитіло, яке було ідентифіковано і відокремлено і/або відновлено з компонента його природного оточення. Забруднюючими компонентами його природного оточення є матеріали, які будуть шкодити діагностичному або терапевтичному застосуванню антитіла, і можуть включати ферменти, гормони і інші протеїнові або непротеїнові розчини. В переважних втіленнях, антитіло буде очищеним (1) до більше ніж 95 вагових % антитіла як визначено з використанням способу Лоурі, і більш переважно більше ніж 99 вагових %, (2) до ступеня достатнього для одержання послідовності з, принаймні, 15 Nтермінальними або внутрішніми залишками амінокислот із застосуванням секвинатора із стаканом, що обертається, або (3) до гомогенності використовуючи SDS-PAGE за відновлюючих або невідновлюючих умов використовуючи Кумассі блакитний або, переважно, серебрянку. Виділене антитіло включає антитіло in situ в межах рекомбінантних клітин в якому буде відсутній, принаймні, один компонент природного оточення антитіла. Однак, нормально, що виділене антитіло буде одержуватись із використанням, принаймні, однієї стадії очищення. "Афіннодозрівшим" антитілом є антитіло з однією або більшою кількістю змін в одній або більшій кількості його гіперваріабельних областей, які призводять до покращення афінності антитіла для антигену, порівняно з вихідним антитілом, яке не має цих змін(и). Переважно, афіннодозрівші антитілами будуть мати наномолярну або навіть пікомолярну спорідненість до цілевого антигену. Афіннодозрівші антитіла одержують за методиками відомими в цій галузі. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) описують визрівання афінності використовуючи тасування VH і VL домену. Неспицифічний мутагенез CDR і/або каркасних залишків описується: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schieretal Gene 169:147-155(1995); Yeltoneial. J. Immunol 155:1994-2004(1995); Jackson ei al, J. Immunol 154(7):3310-9 (1995); і Hawkins et al., J. Моl Biol. 226:889-896 (1992). Термін "антитіло головних видів" тут стосується структури антитіла в композиції, яка є кількісно домінуючою молекулою антитіла в композиції. В одному з втілень, антитілом головного виду є HER2 антитіло, таке як антитіло, що зв'язує Домен IIHER2, антитіло, що інгібує димеризацію HER більш ефективно ніж трастузумаб, і/або антитіло, яке зв'язує гетеродимерно зв'язувальний сайт HER2. В переважному тут втіленні, антитілом головного виду є антитіло, що включає варіабельну легку і варіабельну важку амінокислотні послідовності показані на SEQ ID NO 3 і 4 і, найбільш переважно, що включає легкий ланцюг і важкий ланцюг амінокислотної послідовності показаної на SEQ ID NO 13 і 14 (пертузумаб). "Варіантом амінокислотної послідовності" антитіла тут є антитіло з амінокислотною послідовні 95902 28 стю, яка відрізняється від антитіла головних видів. Звичайно, варіанти амінокислотної послідовності будуть мати, принаймні, приблизно 70% гомологію з антитілом головних видів і, переважно, вони будуть мати, принаймні, приблизно 80%, більш переважно, принаймні, приблизно 90% гомологію з антитілом головних видів. Варіанти амінокислотної послідовності мають заміщення, делеції і/або добавки в деяких позиціях в межах або по сусідству з амінокислотними послідовностями антитіла головного виду. Прикладами варіантів амінокислотної послідовності тут є кислотні варіанти (наприклад, деаміновані варіанти антитіла), основні варіанти, антитіло з амінотермінальним лідерним подовженням (наприклад, VHS-) на одному або двох його легких ланцюгах, антитіло С-термінальним лізиновим залишком на одному або двох його важких ланцюгах, і т.і., і включає комбінації варіантів амінокислотних послідовностей важких і/або легких ланцюгів. Варіантом антитіла, що представляє тут особливий інтерес, є антитіло, що включає аміно-термінальне лідерне подовження на одному або двох його легких ланцюгах, необов'язково, що також включає іншу амінокислотну послідовність і/або глікозиляційні відмінності порівняно з антитілом головного виду. "Глікозильованим варіантом" антитіла тут є антитіло з одним або більшою кількістю карбогідратних замісників приєднаних до нього, який відрізняється від одного або більшої кількості карбогідратних замісників приєднаних до антитіла головного виду. Прикладами глікозильованих варіантів тут є антитіло з G1 або G2 олігосахаридною структурою, замість GO олігосахаридної структури, приєднаної до його Fc області, антитіло з одним або більшою кількістю карбогідратних замісників приєднаних до одного або двох його легких ланцюгів, антитіло без карбогідрату приєднаного до одного або двох важких ланцюгів антитіла, і т.і., і і комбінації глікозильованих варіацій. Коли антитіло має Fc область, олігосахаридна структура може бути приєднаною до одного або більшої кількість важких ланцюгів антитіла, наприклад, по залишку 299 (298, система нумерації залишків EU). Для пертузумабу, GO була домінуючою олігосахаридною структурою, і інші олігосахаридними структурами, такими як GO-F, G-1, Маn5, Маn6, G1-1, G1(1-6), G1(1-3) і G2 знаходять в менших кількостях в композиції пертузумабу. Якщо не вказано інше, "G1 олігосахаридна структура" тут включає G-1, G1-1, G1(1-6) і G1(1-3) структури. "Аміноктермінальне лідерне подовження" тут стосується одного або більшої кількості амінокислотних залишків аміно-термінальної лідерної послідовності, що присутні на амінокінці будь-якого одного або більшої кількості важких або легких ланцюгів антитіла. Приклади аміно-термінальних лідерних подовжень включають або містять три амінокислотні залишки, VHS, присутні на одному або обох легких ланцюгах варіанта антитіла. "Деамідованим" антитілом є антитіло, в якому один або більша кількість його аспарагінових залишків була модифікована, наприклад, у аспарагі 29 нову кислоту, сукцинімід або ізо-аспарагінову кислоту. Терміни "рак" і "раковий" стосується або описує фізіологічні умови у ссавця, що типово характеризується нерегульованим ростом клітин. Прикладами раку є, але не обмежується, карцинома, лімфома, бластома (включаючи медулобластому і ретинобластому), саркома (включаючи ліпосаркому і саркому сіновіальних клітин), нейроендокринні пухлини (включаючи карциноїдні пухлини, гастриному і рак інсулоцитних клітин), мезотеліома, шванома (включаючи неврому слухового нерву), менінгіома, аденокарцинома, меланома і лейкемія або лімфолейкоз. Більш особливими прикладами таких видів раку є рак сквамозних клітин (наприклад, рак епітеліальних сквамозних клітин), рак легені включаючи мілкоклітинний рак легені (SCLC), немілкоклітинний рак легені (NSCLC), аденокарцинома легені і пласкоклітинна карцинома легені, очеревинний рак, гепатоцелюлярний рак, рак шлунку або рак очеревини включаючи гастроінтестинальний рак, рак підшлункової залози, гліобластома, рак шийки матки, рак яічників, рак печінки, рак сечового міхура, гепатоаденома, рак молочної залози (включаючи метастатичний рак молочної залози), рак товстої кишки, ректальний рак, проктологічний рак, ендометріальна карцинома або карцинома тіла матки, карцинома слинних залоз, рак нирок або ренальний рак, рак простати, рак вульви, рак щитовидної залози, карцинома печінки, карцинома анального отвору, карцинома пенісу, тестикулярний рак, езофагеальний рак, пухлини жовчних шляхів, також як і рак голови і шиї. "Прогресуючим" раком є рак, який розповсюдився за межі місця або органу виникнення, або завдяки локальній інвазії, або завдяки метастазам. "Стійким" раком є рак, який розвивається навіть незважаючи на протипухлинний агент, такий як хіміотерапевтичний агент, який був призначений пацієнту, що страждає на рак. Прикладом стійкого раку є рак, який є стійким до платини. "Рецидивним" раком є рак, який повторно розвивається, або в початковому місці, або в іншому місці, після відповіді на початкове лікування. Тут, "пацієнтом" є людина. Пацієнтом може бути "раковий пацієнт", наприклад, пацієнт, який страждає або має ризик виникнення страждань від одного або більшої кількості симптомів раку. "Зразком раку" тут є зразок одержаний з або що включає клітини пухлини від пацієнтів, що страждають на рак. Прикладами зразків раку тут є, але не обмежується, біопсії пухлини, циркулюючі клітини пухлини, циркулюючі протеїни плазми, асцитична рідина, первинні культури клітин або ліній клітин, що є похідними від пухлин або що проявляють пухлиноподібні властивості, також як і консервовані зразки пухлин, такі як зразки фіксовані формаліном, зразки пухлин залиті парафіном або заморожені зразки пухлин. "Фіксованим" зразком пухлини є зразок, який був гістологічно законсервований використовуючи фіксаж. "Фіксованим формаліном" зразком пухлини є зразок, який був законсервований використовуючи формальдегід, як фіксувальний агент. 95902 30 "Залитим" зразком пухлини є зразок оточений твердою оболонкою і зазвичай твердим середовищем, таким як парафін, віск, целоїдин або смола. Заливання робить можливим відрізання тонких скибочок для мікроскопічного дослідження або для проведення мікроаналізу тканини (ТМА). "Залитим парафіном" зразком пухлини є зразок оточений очищеною сумішшю твердих вуглеводнів одержаних з нафти. Тут, вираз "заморожений" зразок пухлини стосується зразку пухлини, який є або був заморожений. Раком або біологічним зразком, який "проявляє експресію, ампліфікацію або активування HER", є рак або біологічний зразок, який в діагностичному тесті, експресує (включаючи надмірну експресію) HER рецептор, ампліфікує HER ген і/або ж демонструє активацію або фосфорилювання HER рецептора. Раком або біологічним зразком, який "проявляє активацію HER" є рак або біологічний зразок, який в діагностичному тесті, демонструє активацію або фосфорилювання HER рецептора. Таку активацію можна визначити безпосередньо (наприклад, шляхом вимірювання фосфорилювання HER використовуючи ELISA) або небезпосередньо (наприклад, при профільованій експресії гена або при детектуванні HER гетеродимерів, як тут описано). Тут, вираз "профільована експресія гена" стосується оцінки експресії одного або більшої кількості генів, як сурогату для визначення безпосереднього фосфорилювання HER. "Фосфо-ELISA дослідженням" тут є дослідження, в якому оцінюється фосфорилювання одного або більшої кількості HER рецепторів, особливо HER2, імуноферментному спот-аналізі (ELISA) використовуючи реагент, зазвичай антитіло, для детектування фосфорильованого HER рецептора, субстрату або молекулу даунстрім сигналювання. Переважно, використовується антитіло, яке детектує фосфорильований HER2. Дослідження можна проводити на лізатах клітин, переважно із свіжих або заморожених біологічних зразків. Раковою клітиною з "надмірною експресією або ампліфікацією HER рецептора" є клітина, яка має значно вищі рівні протеїну або гена HER рецептора порівняно з нераковою клітиною тканини того ж самого типу. Така надмірна експресія може бути викликана ампліфікацією гена або підвищеною транскрипцією або трансляцією. Надмірну експресію або ампліфікацію HER рецептора можна визначити в діагностичному або прогностичному досліджені шляхом оцінки збільшення рівнів HER протеїну присутнього на поверхні клітини (наприклад, використовуючи імногістохімчне дослідження; ІНС). Альтернативно, або додатково, можна виміряти рівні HER-кодуючої нуклеїнової кислоти в клітині, наприклад, використовуючи флуоресценцію in situ гібридизації (FISH; дивіться WO 98/45479, що публікована у жовтні 1998), саузернблотинг, або методики полімеразної ланцюгової реакції (PCR), такі як кількісна PCR в режимі реального часу (qRT-PCR). Також можна дослідити надмірну експресію або ампліфікацію HER рецеп 31 тора шляхом вимірювання антигену, що злущується (наприклад, зовнішньоклітинний домен HER) в біологічній рідині, такі як сироватка (дивіться, наприклад, патент U.S. № 4,933,294, що виданий у червні 12,1990; WO 91/05264, що опублікована 18 квітня 1991; патент U.S. 5,401,638 виданий 28 березня 1995; і Sias et al. J. Immunol. Methods 132:7380 (1990)). В стороні від викладених вище досліджень, спеціалісту в цій галузі доступні різні in vivo дослідження. Наприклад, можна ввести клітини в межах тіла пацієнта в контакт з антитілом, яке є необов'язково міченим міткою, що детектується, наприклад, радіоактивним ізотопом, і можна оцінити зв'язування антитіла з клітинами в пацієнті, наприклад, шляхом зовнішнього сканування радіоактивності або шляхом аналізу біопсії взятої у пацієнта перед введенням антитіла. Навпаки, раком, який "не експресує надмірно або не ампліфікує HER рецептор" є рак, в якому відсутні вищі ніж нормальні рівні протеїну або гена HER рецептора порівняно з нераковими клітинами того ж самого типу тканини. Антитіла, що інгібують димеризацію HER, такі як пертузумаб, можуть бути використані для лікування раку, який не викликає надмірної експресії або ампліфікації HER2 рецептора. Тут, вираз "протираковий агент" стосується лікарського засобу, що використовується для лікування раку. Необмежуючими прикладами протиракових агентів тут є хіміотерапевтичні агенти, інгібітори димеризації HER, HER антитіла, антитіла спрямовані проти пухлинопов'язаних антигенів, протигормональні сполуки, цитокіни, EGFRнацілені лікарські засоби, протиангіогенні агенти, інгібітори тирозинкінази, агенти і антитіла, що інгібують ріст, цитотоксичні агенти, антитіла, що викликають апоптоз, інгібітори СОХ, інгібітори фарнезилтрансферази, антитіла, що зв'язують карциноембріональний протеїн СА 125, HER2 вакцини, Raf або Ras інгібітори, ліпосомальний доксорубіцин, топотекан, таксан, подвійні інгібітори тирозинкінази, TLK286, EMD-7200, пертузумаб, трастузумаб, ерлотиніб і бевацизумаб. "Схваленими протираковими агентами" є лікарські засоби, що використовуються для лікування раку, які схвалені до продажу регулюючими органами, такими як Управління з санітарного нагляду за якістю харчових продуктів та медикаментів (FDA) або їх закордонними еквівалентами. Коли інгібітор димеризації HER призначається як "окремий протираковий агент", вводиться тільки протираковий агент для лікування раку, наприклад, він не вводиться в комбінації з іншим протираковим агентом, таким як хіміотерапія. Під "мірою піклування" тут розуміють протираковий агент або агенти, що повсякчасно використовуються для лікування певної форми раку. Наприклад, для платино-стійкого раку яічників, мірою піклування є топотекан або ліпосомальний доксорубіцин. Вираз "агент, що інгібує ріст", коли тут використовується, стосується сполуки або композиції, яка інгібує ріст клітин, особливо ракової клітини, що експресує HER, або in vitro, або in vivo. Таким чином, агентом, що інгібує ріст, може бути агент, 95902 32 який значно зменшує відсоток клітин, що екпресують HER, в S фазі. Прикладами агентів, що інгібують ріст, є агенти, що блокують цикл розвитку клітини (в місці іншому ніж S фаза), такі як агенти, що викликають затримку G1 фази і затримку М-фази. Класичними блокаторами М-фази є алкалоїди вінка (вінкристин і вінбластин), таксани і нгібітори топо II, такі як доксорубіцин, епірубіцин, даунорубіцин, етопозид і блеоміцин. Агенти, що затримують G1, також розповсюджують свою дію на Sфазу, затримуючи її, наприклад, ДНК алкілувальні агенти, такі як тамоксифен, преднізон, дакарбазин, мехлоретамін, цисплатин, метотрексат, 5фторурацил і ара-С. Додаткову інформацію можна знайти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Частина І, що має назву "Регуляція клітинного циклу, онкогени і антинеоплатичні лікарські засоби" за редакцією Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), особливо cтop. 13. Прикладами антитіл "що інгібують ріст" є антитіла, які зв'язують HER2 і інгібують ріст ракових клітин, що надмірно експресують HER2. Переважно HER2 антитіла, що інгібують ріст, інгібують ріст клітин пухлини молочної залози SK-BR-3 в культурі клітин більше ніж на 20%, і переважно більше ніж на 50% (наприклад, від приблизно 50% до приблизно 100%) при концентрації антитіла приблизно від 0,5 до 30 мкг/мл, де інгібування росту визначали протягом шести днів після введення в контакт з SK-BR-3 клітинами антитіла (дивіться патент U.S. № 5,677,171 виданий 14 жовтня 1997). Дослідження інгібування росту SK-BR-3 клітин описується більш детально в згаданому вище патенті і тут далі. Переважним антитілом, що інгібує ріст, є гуманізований варіант моноклонального антитіла миші 4D5, наприклад, трастузумаб. Антитілом, яке "стимулює апоптоз", є антитіло, яке стимулює програмовану смерть клітин, яке визначається по зв'язуванню аннексии V, фрагментування ДНК, зморщуванню клітин, дилатації ендоплазматичного ретикулуму, фрагментації клітин і/або утворенню мембранних везикул (так званих апоптичних тіл). Клітиною зазвичай є клітина, яка надмірно експресує HER2 рецептор. Переважно, клітиною є клітина пухлини, наприклад, клітина молочної залози, яічників, шлунку, ендометріальна клітина, клітина слинних залоз, клітина легені, клітина нирки, клітина товстої кишки, клітина щитовидної залози, клітина підшлункової залози або клітина сечового міхура. In vitro, клітиною може бути SK-BR-3, ВТ474, Calu 3 клітина, MDA-MB-453, MDA-MB-361 або SKOV3 клітина. Доступні різні способи оцінки клітинної поведінки пов'язаної з апоптозом. Наприклад, може бути виміряна транслокація фосфатидилсерину (PS) використовуючи зв'язування аннексину; може бути оцінена фрагментація ДНК через електрофоретичне розщеплення ДНК; і можна оцінити конденсування ядро/хроматин поряд з фрагментацією ДНК за будьяким збільшенням гіподиплоїдних клітин. Переважно, антитілом, яке стимулює апоптоз, є антитіло, яке призводить до приблизно 2-50 кратного, переважно приблизно 5-50 кратного, і найбільш переважно приблизно 10-50 кратного, індукування зв'язування аннексину порівняно з необробленими 33 клітинами в дослідженні зв'язування аннексину використовуючи ВТ474 клітини (дивіться нижче). Прикладами HER2 антитіл, що індукують апоптоз є 7С2 і 7F3. "Епітоп 2С4" є областю в зовнішньоклітинному домені HER2 до якого прив'язується антитіло 2С4. Для того щоб визначити антитіла, які зв'язують 2С4 епітоп, можна провести дослідження типового перехресного блокування, такого як те, що описано в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Переважно, антитіло блокує 2С4 забезпечуючи приблизно 50% або більше зв'язування HER2. Альтернативно, можна провести картування епітопу для дослідження чи зв'язує антитіло 2С4 епітоп HER2. Епітоп 2С4 включає залишки Домену II в зовнішньоклітинному домені HER2. 2С4 і пертузумаб Зв'язують зовнішньоклітинний домен HER2 при об'єднанні доменів І, II і III. Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004). "Епітопом 4D5" є область в зовнішньоклітинному домені HER2 з якою зв'язується антитіло 4D5 (АТСС CRL 10463) і трастузумаб. Цей епітоп завершує трансмембранний домен HER2 і знаходиться в межах Домену IV HER2. Визначення антитіл, які зв'язують 4D5 епітоп, можна провести використовуючи аналіз типового перехресного блокування, такого як те, що описано в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Альтернативно, можна провести картування епітопу для визначення антитіла, яке зв'язує 4D5 епітоп HER2 (наприклад, будь-який один або більшу кількість залишків в області від приблизно залишку 529 до приблизно залишку 625, включаючи HER2 ECD, залишку пронумерованого із включенням сигнального пептиду). "Епітоп 7C2/7F3" є областю на N кінці, в межах Домену І, зовнішньоклітинного домену HER2, з яким зв'язуються 7С2 і/або 7F3 антитіла (кожне депоноване в АТСС, дивіться нижче). Визначення антитіл, які зв'язують 7C2/7F3 епітоп, можна провести використовуючи аналіз типового перехресного блокування, такого як те, що описано в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Альтернативно, можна провести картування епітопу для визначення антитіла, яке зв'язує 7C2/7F3 епітоп на HER2 (наприклад, будь-який один або більшу кількість залишків в області від приблизно залишку 22 до приблизно залишку 53 HER2 ECD, залишку пронумерованого із включенням сигнального пептиду). "Лікування" стосується і терапевтичного лікування, і заходи з профілактики або попередження. Під тими, що потребують лікування, розуміють осіб, що вже страждають на рак, також як і тих для яких необхідним є попередження розвитку раку. Однак, у пацієнта, що тут лікується, може бути діагностований рак або він може мати схильність до виникнення або може бути чутливим до раку. Термін "ефективна кількість" стосується кількості лікарського засобу ефективної для лікування раку у пацієнта. Ефективна кількість лікарського засобу може зменшувати кількість ракових клітин; зменшувати розмір пухлини; інгібувати (напри 95902 34 клад, уповільнювати до деякої міри і переважно зупиняти) інфільтрацію ракових клітин у периферійні органи; інгібувати (наприклад, уповільнювати до деякої міри і переважно зупиняти) метастази пухлини; інгібувати, до деякої міри, ріст пухлини; і/або полегшувати до деякої міри один або більшу кількість симптомів пов'язаних з раком. Доза лікарського засобу може попереджати ріст і/або убивати існуючі ракові клітини, а також може бути цитостатичною і/або цитотоксичною. Ефективна кількість може розширити розвиток вільного виживання (наприклад, як виміряно Response Evaluation Criteria for Solid Tumors, RECIST, або змінами СА-125), забезпечити об'єктивну відповідь (включаючи, часткову відповідь, PR, або повну відповідь, CR), збільшити загальний час життя, і/або покращити один або більшу кількість симптомів раку (наприклад, як досліджено FOSI). Термін "цитотоксичний агент", як тут використовується, стосується речовини, що інгібує або попереджає функціонування клітин і/або викликає деструкцію клітин. Термін призначений для охоп211 131 125 90 186 лення ізотопів (наприклад, At , l , l , Y , Re , 188 153 212 32 Re , Sm , Bi , Ρ і радіоактивних ізотопів Lu), хіміотерапевтичних агентів і токсинів, таких як низькомолекулярні токсини або ферментноактивні токсини бактерій, грибків, рослин або тварин, включаючи їх фрагменти і/або варіанти. "Хіміотерапевтичним агентом" є хімічна сполука корисна при лікуванні раку. Прикладами хіміотерапевтичних агентів є алкілувальні агенти, такі як тіотепа і CYTOXAN® циклофосфамід; алкілсульфонати, такі як бусулфан, імпросульфан і піпосульфан; азиридини, такі як бензодопа, карбоквон, метуредопа і уредопа; етиленіміни і метиламілеміни включаючи алтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід і триметилоломеламін; TLK 286 (TELCYTA™); ацетогеніни (особливо буллатацин і буллатацинон); дельта-9-тетрагідроканнабінол (дронабінол, MARINOL®); бета-лапахон; лапахол; колхіцини; бетулінова кислота; камптотецин (включаючи синтетичний аналог топотекану (HYCAMTIN®), СРТ11 (іринотекан, CAMPTOSAR®), ацетилкамптотецин, скополектин і 9-амінокамптотецин); бріостатин; каллістатин; СС-1065 (включаючи його синтетичні аналоги адозелесин, карзелесин і бізелесин); подофілотоксин; подофілінова кислота; теніпозид; криптофіцини (особливо криптофіцин 1 і криптофіцин 8); доластатин; дуокарміцин (включаючи синтетичні аналоги, KW-2189 і СВ1-ТМ1); елеутеробін; панкратістатин; саркодистиін; спонгістатин; азотисті іприти, такі як хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорофосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоретамін, мехлоретаміну оксиду гідрохлорид, мелфалан, новембіхін, фенестерин, преднімустин, трофосфамід, ураціиловий іприт; нітрозосечовини, такі як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин і ранімнустин; бісфосфонати, такі як клодронат; антибіотики,такі як енедіінові антибіотики (наприклад, каліхеаміцин, особливо каліхеаміцин гаммаїї і каліхеаміцин омегаїї (дивіться, наприклад, Agnew, Chem lntl. Ed. Engl., 33:183186(1994))іантрацикліни, такі як аннаміцин, AD 32, алкарубіцин, даунорубіцин, декстразоксан, DX-52 35 1, епірубіцин, GPX-100, ідарубіцин, KRN5500, меногаріл, динеміцин, включаючи дінеміцин А, еспераміцин, неокарзиностатину хромофор і подібні хромопротеїнові хромофори енедиінового антибіотику, аклациномізини, актиноміцин, аутраміцин, азасерин, блеоміцини, кактиноміцин, карабіцин, карміноміцин, карцинофілін, хромоміцини, дактиноміцини, деторубіцин, 6-діаза-5-оксо-Lнорлейцин, ADRIAMYCIN® доксорубіцин (включаючи морфоліно-доксорубіцин, ціаноморфолінодоксорубіцин, 2-піроліно-доксорубіцин, ліпосомальний доксорубіцин і деоксидоксорубіцин), езорубіцин, марцеломіцин, мітоміцини, такі як мітоміцин С, мікофенольна кислота, ногаламіцин, олівоміцини, пепломіцин, потфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидин, убенімекс, зиностатин і зорубіцин; аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, птероптерин і триметрексат; аналоги пурину, такі як флударабін, 6-меркаптопурин, тіаміприн і тіогуанін; аналоги піримідину, такі як анцитабін, азацитидін, 6-азауридин, кармофур, цитарабін, дідеоксиуридин, доксифлуридин, еноцитабін і флоксуридин; андрогени, такі як калустерон, дромостанолону пропіонат, епітіостанол, мепітіостан і тестолактон; анти-адреналінові агенти, такі як аміноглутетімід, мітотан і трилостан; добавка до фолієвої кислоти, така як фолінова кислота (леуковорін); ацеглатон; антифолати анти-неопластичні агенти, такі як ALIMTA®, LY231514 пеметрексед, інгібітори дигідрофолатредуктази, такі як метотрексат, антиметаболіти, такі як 5-фторурацил (5-FU) і його пролікарські форми, такі як UFT, S-1 і капецитабін, і інгібітори тимідилатсинтази і інгібітори гліцинамідрибонуклеотидформілтрансферази, такі RM якралтітрексед (TOMUDEX , TDX); інгібітори дигідропіримідиндегідрогенази, такі як енілурацил; альдофосфамідглікозид; амінолевулінова кислота; амсакрин; бестрабуцил; бісантрен; едатраксат; дефофамін; демеколцин; діазиквон; елфорнітин; елліптинію ацетат; епотілон; етоглуцид; нітрат галію; гідроксисечовина; лентинан; лонідаінін; маітансиноіди, такі як маітансин і ансамітоцини; мітогуазон; мітоксантрон; мопіданмол; нітраерін; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; лозоксантрон; 2етилгідразид; прокарбазин; РSK®-складний полісахарид (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; різоксин; сізофіран; спірогерманій; тануазонова кислота; триазиквон; 2,2',2"трихлортриетиламін; трихотецени (особливо Т-2 токсин, верракурин А, рорідин А і ангуідин); уретан; віндезин (ELDISINE®, FILDESIN®); дакарбазин; манномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид ("Аrа-С"); циклофосфамід; тіотепа; таксоїди і таксени, наприклад, TAXOL® паклітаксель (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, Ν. J.), ABRAXANE™ Кремофор-вільний, альбумін-сконструйована наночастинкова рецептура паклітакселю (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), і TAXOTERE® доцетаксель (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; гемцитабін (GEMZAR®); 6-тіогуанін; меркаптопурин; платина; аналоги платини або аналоги на основі платини, такі як цисплатин, оксаліплатин і карбоплатин; 95902 36 вінбластин (VELBAN®); етопозид (VP-16); іфосфамід; мітоксантрон; вінкристин (ONCOVIN®); алкалоїд барвінку; вінорелбін (NAVELBINE®); новантрон; едатрексат; дауноміцин; аміноптерин; кселода; ібандронат; інгібітор топоізомерази RFS 2000; дифторметилорнітин (DMFO); ретиноїди, такі як ретиноєва кислота; фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якої із згаданих вище сполук; також як і комбінації двох або більшої кількості, такі як CHOP, абревіатура для комбінованої терапії із використанням циклофосфаміду, доксорубіцину, вінкристину і преднізолону, і FOLFOX, абревіатура для режиму лікування із використанням оксаліплатину (ELOXATIN™) у поєднанні з 5-FU і леуковорином. Також включеними в це визначення є протигормональні агенти, що регулюють або інгібують дію гормону на пухлини, такі як антиестрогени і селективні модулятори рецептора естрогену (SERM), включаючи, наприклад, тамоксифен (включаючи NOLVADEX® тамоксифен), ралоксифен, дролоксифен, 4-гідрокситамоксифен, тріоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон і FARESTON® тореміфен; інгібітори ароматази, що інгібують фермент ароматазу, який регулює продукування естрогену в наднирокових залозах, такі як, наприклад, 4(5)-мімідазоли, аміноглутетімід, MEGASE® мегестролу ацетат, AROMASIN® ексеместан, форместаніе, фадрозол, RIVISOR® ворозол, FEMARA® летрозол і ARIMIDEX® анастрозол; і анти-андрогени, такі як флутамід, нілутамід, бікалутамід, леупролід і ггозерелін; також як і троксацитабін (1,3-діоксолановий нуклеозидний аналог цитозину); антисмислові олігонуклеотиди, особливо ті, що інгібують експресію генів в сигнальних шляхах втягнутих в проіферацію аберантних клітин, такі як, наприклад, РKС-альфа, Raf, H-Ras і рецептор фактора росту епідермісу (EGF-R); вакцини, такі як вакцини для генної терапії, наприклад, ALLOVECTIN® вакцина, LEUVECTIN® вакцина і VAXID® вакцина; PROLEUKIN® rIL-2; інгібітор топоізомерази 1 LURTOTECAN®; ABARELEX® rmRH; і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якої із згаданих вище сполук. "Антиметаболічним хіміотерапевтичним агентом" є агент, який є структурно подібним до метаболіту, але не може бути використаний тілом в способі продукування. Багато антиметаболічних хіміотерапевтичних агентів перешкоджають продукуванню нуклеїнових кислот, РНК і ДНК. Прикладами антиметаболічних хіміотерапевтичних агентів є гемцитабін (GEMZAR®), 5-фторурацил (5FU), капецитабін (XELODA™), 6-меркаптопурин, метотрексат, 6-тіогуанін, пеметрексад, ралтітрексед, арабінозилцитозин ARA-C цитарабін (CYTOSAR-U®), дакарбазин (DTIC-DOME®), азоцитозин, деоксицитозин, піридміден, флударабін (FLUDARA®), кладрабін, 2-деокси-0-глюкоза і т.і. Переважним антиметаболічним хіміотерапевтичним агентом є гемцитабін. "Гемцитабін" або "2'-деокси-2',2'дифторцитидину моногідрохлорид (b-ізомер)" є аналогом нуклеозиду, що проявляє протипухлинну активність. Емпіричною формулою для гемцитабі 37 ну НСI є C9H11F2N3O4 × НСI. Гемцитабіну НСI продається фірмою Eli Lilly під торговою назвою GEMZAR®. "Хіміотерапевтичним агентом на основі платини" є органічна сполука, яка містить платину як складову частину молекули. Прикладом хіміотерапевтичного агента на основі платини є карбоплатин, цисплатин і оксаліплатина. "Хіміотерапія на основі платини" означає лікування використовуючи один або більшу кількість хіміотерапевтичних агентів на основі платини, необов'язково, в комбінації з одним або більшою кількістю інших хіміотерапевтичних агентів. Вираз "хіміотерапевтична стійкість" раку означає, що рак пацієнта розвивається під час проведення хіміотерапевтичного лікування (наприклад, пацієнт є "хіміотерапевтично важковиліковним"), або пацієнт у якого розвивається рак в межах 12 місяців (наприклад, в межах 6 місяців) після завершення хіміотерапевтичного лікування. Вираз "платино-стійкий" рак означає, що рак пацієнта розвивається під час проведення хіміотерапевтичного лікування із застосуванням платини (наприклад, пацієнт є "платиноважковиліковним"), або пацієнт у якого розвивається рак в межах 12 місяців (наприклад, в межах 6 місяців) після завершення хіміотерапевтичного лікування із застосуванням платини. Вираз "анти-ангіогенний агент" стосується сполуки, яка блокує або впливає у деякому ступені на розвиток кровоносних судин. Анти-ангіогенним фактором може, наприклад, бути низькомолекулярна сполука або антитіло, що зв'язує фактор росту або рецептор фактора росту включений в промотування ангіогенезу. Переважним антиангіогенним фактором тут є антитіло, що зв'язує фактор росту ендотелію судин (VEGF), такий як бевацизумаб (AVASTIN®). Термін "цитокін" э генеричним терміном для протеїнів, що вивільнюються однією популяцією клітин, які діють на інші клітини як внутрішньоклітинні медіатори. Прикладами таких цитокінів є лімфокіни, монокіни і традиційні поліпептидні гормони. Серед цитокінів можна згадати гормон росту, такий як гормону росту людини, N-метіоніл гормон росту людини і гормон росту теляти; паратіроїдний гормон; тироксин; інсулін; проінсулін; релаксин; прорелаксин; глікопротеїнові гормони, такі як фолікулостимулюючий гормон (FSH), тиреотропний гормон (TSH) і літеінізуючий гормон (LH); гепатичний фактор росту; фактор росту фібробласту; пролактин; плацентарний лактоген; фактор некрозу пухлини-α і -β; мюллерова інгібувальна речовина; гонадотропін-пов'язаний пептид миші; інгібін; активін; фактор росту ендотеліальних судин; інтегрин; тромбопоіетин (TРО); фактори росту нерву, такі як NGF-β; фактор росту тромбоцитів; трасформуючі фактори росту (TGF), такі як TGF-α і TGF-β; інсулін-подібний фактор росту-І і -ll; еритропоетин (ЕРО); остеоіндуктивні фактори; інтерферони, такі як інтерферон-α, -β і -γ, колонійстимулюючі фактори (CSF), такі як макрофаг-CSF (M-CSF); гранулоцит-макрофаг-CSF (GM-CSF); і гранулоцит-CSF (G-CSF); інтерлейкіни (IL), такі як IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, 95902 38 IL-10, IL-11, IL-12; фактор некрозу пухлини, такий як TNF-α або TNF-β; і інші поліпептидні фактори включаючи LIF і набір ліганду (KL). Як тут використовується, термін цитокін включає протеїни з природних джерел або з рекомбінантної культури клітин і біологічно активні еквіваленти нативних послідовностей цитокінів. Як тут використовується, термін "EGFRнацілений лікарський засіб" стосується терапевтичного агента, що зв'язує EGFR і, необов'язково, інгібує активацію EGFR. Прикладами таких агентів є антитіла і низькомолекулярні сполуки, що зв'язують EGFR. Прикладами антитіл, які зв'язують EGFR є МАb 579 (АТСС CRL НВ 8506), МАb 455 (АТСС CRL НВ8507), МАb 225 (АТСС CRL 8508), МАb 528 (АТСС CRL 8509) (дивіться, патент US № 4,943,533, Mendelsohn et al.) і їх варіанти, такі як химеризовані 225 (С225 або Цетуксимаб; ERBUTIX®) і переформоване 225 людини (Н225) (дивіться, WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, повністю людське, EGFR-націлене антитіло ((Imclone); антитіло, що зв'язує тип II мутанту EGFR (патент US № 5,212,290); гуманізовані і химерні антитіла, що зв'язують EGFR як описано в патенті US № 5,891,996; і антитіла людини, що зв'язують EGFR, такі як ABX-EGF (дивіться WO 98/50433, Abgenix); EMD 55900 (Stragliotto et al. Em. J. Cancer 32A:636-640 (1996)); EMD7200 (матузумаб) гуманізоване EGFR антитіло спрямоване проти EGFR, що конкурує з EGF і TGF-альфа за зв'язування EGFR; і mAb 806 або гуманізоване mAb 806 (Johns et al., J. Вiol. Chem. 279(29):3037530384 (2004)). Анти-EGFR антитіло може бути кон'юговане з цитотоксичним агентом утворюючи таким чином імунокон'югат (дивіться, наприклад, ЕР659,439А2, Merck Patent GmbH). Прикладами низькомолекулярних сполук, що зв'язують EGFR є ZD1839 або Гефітиніб (IRESSA™; Astra Zeneca); CP-358774 або Ерлотиніб (TARCEVA™; Genentech/OSI); і AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen); EMD-7200. "Інгібітором тирозинкінази" є молекула, яка інгібує активність тирозинкінази, такої як HER рецептор. Прикладами таких інгібіторів є EGFRнацілені лікарські засоби згадані в попередньому параграфі; низькомолекулярні інгібітори HER2 тирозинкінази, такі як ТАКІ 65 доступні від Takeda; СР-724,714, оральний селективний інгібітор ЕrbВ2 рецептора тирозинкінази (Pfizer і OSI); подвійніHER інгібітори, такий як ЕKВ-569 (доступний від Wyeth), який переважно зв'язує EGFR, але інгібує клітини, що надмірно екпресують і HER2, і EGFR; GW572016 (доступний від Glaxo) оральний інгібітор HER2 і EGFR тирозинкінази; РKІ-166 (доступний від Novartis); pan-HER інгібітори, такий як канертиніб (СІ-1033; Pharmacia); Raf-1 інгібітори, такий як антисмисловий агент ISIS-5132 доступний від ISIS Pharmaceuticals, який інгібує передачу сигналу Raf-1; не-HER націлені ТK інгібітори, такий як Іматинібу мезилат (Gleevac™) доступний від Glaxo; СІ-1040 інгібітор МАРK зовнішньоклітинно регульованої кінази І (доступний від Pharmacia); хіназоліни, такі як PD 153035,4-(3хлораніліно)хіназолін; піридопіримідини; піримідопіримідини; піролопіримідини, такі як CGP 59326, 39 CGP 60261 і CGP 62706; піразолопіримідини, 4(феніламіно)-7Н-піроло[2,3-d]піримідини; куркумін (диферулоїлметан, 4,5-біс(4фтораніліно)фталамід); тирфостини, що містять нітротіофенові замісники; PD-0183805 (WarnerLambert); антисмислові молекули (наприклад, ті що зв'язують HER-κοдуючу нуклеїнову кислоту); хіноксаліни (патент US № 5,804,396); трифостини (патент US № 5,804,396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); pan-HER інгібітори, такі як СІ-1033 (Pfizer); Аффінітак (ISIS 3521; Isis/Lilly); Іматиніб мезилат (Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); СІ-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxinib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); або як описано в будьякій з наступних патентних публікацій: патент US № 5,804,396; WO 99/09016 (American Cyanimid); WO 98/43960 (American Cyanamid); WO 97/38983 (Warner Lambert); WO 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396 (Warner Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, Inc); WO 96/33978 (Zeneca); WO 96/3397 (Zeneca) і WO 96/33980 (Zeneca). Вираз "фіксована" або "однорідна" доза терапевтичного агента тут стосується дози, що вводиться людині без урахування ваги (WT) або площі поверхні тіла (BSA) пацієнта. Фіксована або однорідна доза не виражається тут як мг/кг дозу або 2 мг/м дозу, але скоріше як абсолютна кількість терапевтичного агента. Вираз "ударна" доза тут загалом включає початкову дозу терапевтичного агента, що вводиться пацієнтові, і подальшу одну або більшу кількість доз, що її підтримують. Загалом, вводиться одна ударна доза, але тут передбачаються і декілька ударних доз. Зазвичай, кількість ударної доз(и), що вводиться, перевищує кількість підтримуючої доз(и), що вводиться, і/або ударна доз(а) вводиться більш часто, ніж підтримуюча доз(а), так що досягається рівноважна концентрація терапевтичного агента раніше, ніж можна було досягти використовуючи підтримуючу дозу(и). Вираз "підтримуюча" доза тут стосується однієї або більшої кількості доз терапевтичного агента, що вводиться пацієнтові під час лікування. Зазвичай, підтримуючі дози вводяться з деякими інтервалами, такими як приблизно кожний тиждень, приблизно кожні 2 тижні, приблизно кожні 3 тижні або приблизно кожні 4 тижні. II. Одержання антитіл Оскільки, в переважному втіленні, інгібітором димеризації HER є антитіло, приведений далі опис є прикладом методики одержання використовуваних HER антитіл у відповідності з представленим винаходом. HER антигеном, що використовується для одержання антитіл, може бути, наприклад, розчинна форма зовнішньоклітинного домену HER рецептора або його частина, що містить бажаний епітоп. Альтернативно, клітини, що експресують HER, на їх поверхні (наприклад, NIH-3T3 клітини, що трансформовані для надмірної експресії HER2; або лінія клітин карциноми, така як SK-BR-3 клітини, дивіться Stancovski et al. PNAS (USA) 88:86918695 (1991)) можуть бути використані для одержання антитіл. Інші форми HER рецептора корисні 95902 40 для генерування антитіл будуть очевидні для спеціаліста в цій галузі. (і) Політональні антитіла Поліклональні антитіла переважно вирощують в тваринах шляхом багаторазових підшкірних (пш) або внутрішньоочеревинних (во) ін'єкцій релевантного антигену і ад'юванту. Може бути корисним кон'югувати релевантний антиген з протеїном, що є імуногенним у видах, що імунізуються, наприклад, гемоціанін лімфи равлика, сироватковий альбумін, тіроглобулін теляти або соєвий інгібітор трипсину використовуючи біфукнкціональний або модифікуючий агент, наприклад, малеімідобензоїл сульфосукцинімідний естер (кон'югується через цистеїнові залишки), N-гідроксисукцинімід (через лізинові залишки), глутаральдегід, сукциновий 1 1 ангідрид, SOCl3 або R N=C=NR, де R і R є різними алкільними групами. Тварин імінузіють проти антигену, імуногенних кон'югатів або похідних шляхом об'єднання, наприклад, 100 мкг або 5 мкг протешу або кон'югату (для кролів або мишей, відповідно) з 3 об'ємами повного ад'юванту Фрейнда і ін'єктують розчин інтрадермально в декількох місцях. Через один місяць тварин стимулюють 1/5 - 1/10 оригінальної кількості пептиду або кон'югату в повному ад'юванті Фрейнда шляхом підшкірної ін'єкції в декількох місцях. Через від семи до 14 днів у тварин відбирають кров і сироватку піддають дослідженню для визначення титру антитіла. Тварин стимулюють до плаского титру. Переважно, тварину стимулюють кон'югатом того ж самого антигену, але кон'югованого з різними протеїнами і/або використовуючи різні зшиваючи реагенти. Кон'югати також можна одержати в культурі рекомбінантних клітин як злиті протеїни. Також, придатними є агрегатуючи агенти, такі як галуни, що використовуються для підсилення імунної відповіді. (іі) Моноклональні антитіла В цій галузі відомі різні способи одержання моноклональних антитіл. Наприклад, моноклональні антитіла можна одержати використовуючи спосіб гібридоми вперше описаний Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), використовуючи способи рекомбінантної ДНК (патент U.S. № 4,816,567). В способі гібридоми, мишей або іншу придатну тварину хазяїна, таку як хом'як, імунізують як тут було описано вище до появи лімфоцитів, що продукують або здатні продукувати антитіла, що будуть специфічно зв'язувати протеїн, який використовується для імунізації. Альтернативно, лімфоцити можуть бути імунізовані in vitro. Лімфоцити потім зливають з мієломними клітинами використовуючи придатний зливаючий агент, такий як поліетиленгліколь, з утворенням клітини гібридоми (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Одержані таким чином клітини гібридоми висівають і вирощують в придатному культуральному середовищі, що переважно містить одну або більшу кількість речовин, що інгібують ріст або виживаність незлитих, парентеральних мієломних клітин. Наприклад, якщо парентеральні мієломні клітини потребують фермент гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферазу 41 (HGPRT або HPRT), культуральне середовище для гібридом типово буде включати гіпоксантин, аміноптерин і тимідин (HAT середовище), речовини якого попереджають ріст HGPRT-дефіцитних клітин. Переважними мієломними клітинами є клітини, що ефективно зливаються, підтримуючи стабільний високий рівень продукування антитіла вибраними антитіло-продукуючими клітинами і чутливі до середовища, такого як HAT середовище. Серед них, переважними лініями мієломної клітини є лінії мієломи миші, такі як ті, що походять від МОРС-21 і МРС-11 пухлин мишей доступних від Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, і SP-2 або X63-Ag8-653 клітини доступні від American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Також були описані для продукування моноклональних антитіл людини лінії клітин мієломи людини і лінії клітин гетеромієломи мишілюдини (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); і Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Культуральне середовище, в якому ростуть клітини гібридоми, досліджують на продукування моноклональних антитіл спрямованих безпосередньо проти антигену. Переважно, визначають специфічність зв'язування моноклональних антитіл, що продукуються клітинами гібридоми, використовуючи імунопреципітацію або використовуючи дослідження зв'язування in vitro, таке як радіоімунодослідження (RIA) або використовуючи імуноферментний твердофазний аналіз (ELISA). Спорідненість зв'язування моноклонального антитіла можна, наприклад, визначити за допомогою аналізу Скатчарда Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980). Після ідентифікації клітин гібридоми, що продукують антитіла з бажаною специфічністю, спорідненістю і/або активністю, клони можна субклонувати за методиками серійних розведень і виростити за стандартними методиками (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Придатним культуральним середовищем для цих цілей є, наприклад, D-MEM або RPMI-1640 середовище. Крім того, клітини гібридоми можна виростити in vivo як асцитні пухлини в тварині. Моноклональні антитіла, що секретуються субклонами, придатно відокремлюють від культурального середовища, асцитної рідини або сироватки використовуючи звичайні методики очищення антитіла, такі як, наприклад, протеїн А-сефароза, хроматографія на гідроксилапатиті, гельелектрофорез, діаліз або афінна хроматографія. ДНК, що кодує моноклональні антитіла, легко виділити і визначити послідовність використовуючи звичайні методики (наприклад, шляхом використання олігонуклеотидних зондів, що здатні специфічно зв'язувати гени, які кодують важкий і легкий ланцюги антитіл миші). Клітини гібридоми слугують переважним джерелом такої ДНК. Виділена ДНК може бути поміщена в екпресійні векторі, які потім трансфікують в хазяйські клітини, такі як клітини Е. соlі, мавпячі COS клітини, клітини 95902 42 яічників китайських хом'ячків (СНО) або мієломні клітини, що не продукують інший протеїн - антитіло, із забезпеченням синтезу моноклональних антитіл в рекомбінантних хазяйських клітинах. Оглядовими статтями по рекомбінантній експресії в бактерії ДНК, що кодує антитіло, є Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol, 5:256-262 (1993) і Pltickthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992). В наступному втіленні, моноклональні антитіла або фрагменти антитіла можна виділити з фагових бібліотек антитіла одержаних використовуючи методики описані в McCafferty et al., Nature, 348:552554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) і Marks et al., J. Моl. Вiol., 222:581-597 (1991) описують виділення антитіл миші і людини, відповідно, використовуючи фатові бібліотеки. Наступні публікації описують одержання високоспоріднених (нМ діапазон) антитіл людини використовуючи тасування ланцюга (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), також як і комбінаторне інфікування і in vivo рекомбінацію як стратегію для конструювання дуже великих фагових бібліотек (Waterhouse et al., Nuс. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким чином, ці методики є життєздатними альтернативами традиційних методик гібридоми моноклонального антитіла для виділення моноклональних антитіл. ДНК також можна модифікувати, наприклад, шляхом заміни кодувальної послідовності константних доменів важкого ланцюга і легкого ланцюга людини гомологічними послідовностями миші (патент U.S. № 4,816,567; і Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), або шляхом ковалентного приєднання до кодувальної послідовності імуноглобуліну всієї або частини кодувальної послідовності не-імуноглобулінового поліпептиду. Типово, такими не-імуноглобуліновими поліпептидами заміщують константні домени антитіла, або вони є заміщеними варіабельними доменами одного з антиген-об'єднуючих сайтів антитіла із утворенням химерного бівалентного антитіла, що містить один антиген-об'єднуючий сайт, що має специфічність до антигену, і інший антигеноб'єднуючий сайт має специфічність до іншого антигену. (iiі) Гуманізовані антитіла Способи гуманізації нелюдських антитіл були описані в літературі. Переважно, гуманізоване антитіло має один або більшу кількість амінокислотних залишків включених в нього з джерела, що не людським. Ці нелюдські амінокислотні залишки часто відносять до "імпортних" залишків, які типово беруть від "імпортного" варіабельного домену. Гуманізацію можна, по суті, провести згідно із методикою Вінтера і співробітників (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), шляхом заміни гіперваріабельної області послідовностей відповідними послідовностями антитіла людини. Відповідно, такі "гуманізовані" антитіла є химерними антитілами (патент U.S. № 4,816,567), які, по суті, менше ніж непошкоджений варіабельний домен людини заміщені відповідною послідовністю видів окрім людини. На практиці, гуманізовані антитіла є 43 типово антитілами людини, в яких деякі залишки гіперваріабельної області і можливо деякі FR залишки є заміненими залишками з аналогічних сайтів в антитілах гризунів. Вибір варіабельних доменів людини і легкого, і важкого, що використовуються при одержанні гуманізованих антитіл є дуже важливим для зменшення антигенності. Відповідно до так званого способу "оптимізації", послідовність варіабельного домену антитіла гризуна піддають скринінгу порівняно з повної бібліотекою відомих послідовностей варіабельних доменів людини. Послідовність людини, яка є найближчою до мишачої, зв'язують як каркасну область (FR) людини для гуманізованого антитіла (Sims et al., J. Immunol. ,151:2296 (1993); Chotbia et al., J. Моl. Biol, 196:901 (1987)). Інший спосіб використовує певну каркасну область, що походить від консенсусної послідовності всіх антитіл людини певної підгрупи легкого або важкого ланцюгів. Той же самий каркас можна використати для декількох різних гуманізованих антитіл (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, 151:2623 (1993)). Також важливо, що антитіла, які гуманізуються, зберігають високу спорідненість до антигену і інші сприятливі біологічні властивості. Для досягнення цієї цілі, згідно з переважним способом, гуманізовані антитіла одержують з використанням процесу аналізу материнських послідовностей і різних концептуальних гуманізованих продуктів використовуючи тримірні моделі материнських і гуманізованих послідовностей. Як правило доступні і відомі спеціалісту в цій галузі техніки тривимірні моделі імуноглобуліну. Доступні комп'ютерні програми, які ілюструють і відображають можливі тривимірні конформаційні структури вибраних кандидатів імуноглобулінових послідовностей. Аналіз цих зображень дозволяє виявити імовірну роль залишків у функціонуванні кандидатної імуноглобулінової послідовності, наприклад, аналіз залишків, що впливають на здатність кандидатного імуноглобуліну зв'язувати його антиген. Таким чином, FR залишки можна вибирати або комбінувати з реціпієнтних і важливих послідовностей для того щоб одержати антитіло з бажаними характеристиками, такими як збільшення спорідненості до цільового антигену(ів). Загалом, залишки гіперваріабельною області включені безпосередньо і найбільш сильно впливаючи таким чином на зв'язування антигену. WO 01/00245 описує одержання прикладів гуманізованих HER2 антитіл, які зв'язують HER2 і блокують активацію ліганду HER рецептора. Особливо цікаве тут гуманізоване антитіло блокує EGF, TGF-α і/або HRG опосередковану активацію МАРK, по суті, також ефективно як моноклональне антитіло миші 2С4 (або його Fab фрагмент) і/або зв'язує HER2, по суті, також ефективно як моноклональне антитіло миші 2С4 (або його Fab фрагмент). Описане тут гуманізоване антитіло може, наприклад, включати залишки нелюдської гіперваріабельної області включені у важкий варіабельний домен людини і може також включати каркасну область (FR) заміщену в положенні, що вибирають з групи, яка містить 69Н, 71Η і 73Н ви 95902 44 користовуючи систему нумерації варіабельного домену приведену в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). В одному з втілень, гуманізоване антитіло містить FR заміщення в двох або всіх положеннях 69Н, 71Н і 73Н. Прикладом гуманізованого антитіла цікавого в цьому контексті є гіперваріабельні залишки варіабельного важкого домену GFTFTDYTMX, де X є переважно D або S (SEQ ID NO:7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO:8); і/або NLGPSFYFDY (SEQ ID NO:9), що необов'язково включає амінокислотні модифікцаії в цих CDR залишках, наприклад, де модифікації, по суті, зберігають або покращують спорідненість антитіла. Наприклад, цікавий варіант антитіла може мати від приблизного одного до приблизно семи або приблизно п'ять амінокислотних заміщень у згаданих вище варіабельних важких CDR послідовностях. Такі варіанти антитіла можна одержати визріванням афінності, наприклад, як описано вище. Найбільш переважне гуманізоване антитіло містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4 варіабельного важкого домену. Гуманізоване антитіло може включати гіперваріабельні залишки варіабельного легкого доме1 2 3 ну KASQDVSIGVA (SEQ ID NO:10); SASY X X , де 1 2 X є переважно R або L, X є переважно Υ або Е, і 3 X є переважно Τ або S (SEQ ID NO:11); і/або QQYYIYPYT (SEQ ID NO:12), наприклад, на додаток до тих CDR залишків варіабельного важкого домену згаданих в попередньому параграфі. Такі гуманізовані антитіла необов'язково включають амінокислотні модифікації згаданих вище CDR залишків, наприклад, де модифікцаії, по суті, зберігають або покращують спорідненість антитіла. Наприклад, цікавий варіант антитіла може мати від приблизного одного до приблизно семи або приблизно п'ять амінокислотних заміщень у згаданих вище варіабельних легких CDR послідовностях. Такі варіанти антитіла можна одержати визріванням афінності, наприклад, як описано вище. Найбільш переважне гуманізоване антитіло містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:3 варіабельного легкого домену. Представлена заявка також розглядає афінновизрівші антитіла, які зв'язують HER2 і блокують активацію ліганду HER рецептора. Материнським антитілом може бути антитіло людини або гуманізоване антитіло, наприклад, антитіло, що містить варіабельні легкі і/або варіабельні важкі послідовності SEQ ID NO 3 і 4, відповідно (наприклад, що містить VL і/або VH пертузумаб). Афінно визрівше антитіло переважно зв'язує HER2 рецептор із надзвичайною спорідненістю порівняно з мишачим 2С4 або пертузумабом (наприклад, від приблизно двох або до приблизно чотирьох разів, до приблизно 100 разів або приблизно в 1000 разів кращою спорідненістю, наприклад, як визначено використовуючи HER2-зовнішньоклітинний домен (ECD) ELISA). Прикладами CDR залишків для заміщення варіабельного важкого ланцюга є Н28, Н30, Н34, Н35, Н64, Н96, Н99, або комбінації двох або біль 45 ше (наприклад, двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести або семи з цих залишків). Прикладами CDR залишків для заміщення варіабельного легкого ланцюга є L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 або комбінації двох або більше (наприклад, двох, трьох, чотирьох, п'яти або до приблизно десяти з цих залишків). Розглядаються різні форми гуманізованого антитіла або афінновизрівшого антитіла. Наприклад, гуманізованим антитілом або афінновизрівшим антитілом може бути фрагмент антитіла, такий як Fab, який є необов'язково кон'югованим з одним або більшою кількістю цитотоксичних агент(ів) з утворенням імунокон'югату. Альтернативно, гуманізованим антитілом або афінновизрівшим антитілом може бути інтактне антитіло, таке як інтактне IgG1 антитіло. Переважне інтактне IgG1 антитіло містить послідовність легкого ланцюга показану на SEQ ID NO:13 і послідовність важкого ланцюга показану на SEQ ID NO:14. (iv) Антитіла людини Як альтернатива гуманізації, можна одержати антитіла людини. Наприклад, зараз є можливим одержати трансгенних тварин (наприклад, мишей), що здатні, при імунізації, продукувати повний набір антитіл людини у відсутності продукування ендогенного імуноглобуліну. Наприклад, було описано, що гомозиготна делеція J-області (JH) важкого ланцюга гена антитіла в химерній і зародковій лінії мишачого мутанту призводить до повного інгібування продукування ендогенного антитіла. Перенос набору зародкової лінії гена імуноглобуліну людини в таку зародкову лінію мишачого мутанту буде призводити до продукування антитіла людини при антигенній стимуляції. Дивіться, наприклад, Jakobovits et αl., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); і патент U.S. № 5,591,669, 5,589,369 і 5,545,807. Альтернативно, технологія фагового дисплею (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) може бути використана для продукування антитіла людини і фрагментів антитіла in vitro, з наборів генів варіабельного домену (V) імуноглобуліну з імунізованих донорів. Згідно з цією технікою, гени V домену антитіла клонують в рамку зчитування в або основний, або неосновний ген оболонкового протеїну нитковидного бактеріофагу, такого як М13 або fd, і відображають як функціональні фрагменти антитіла на поверхні фагової частинки. Оскільки нитковидні часточки містять копію одноланцюгової ДНК фагового геному, вибір на основі функціональних властивостей антитіла також призводить до вибору гена, що кодує антитіло, яке проявляє ці властивості. Таким чином, фаг копіює деякі властивості В-клітини. Фаговий дисплей можна проводити в різних форматах; для ознайомлення з ними дивіться, наприклад, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-57Ί (1993). Для фагового дисплею можуть бути використані декілька джерел сегментів V-гена. Clackson et al., Nature, 352:624628 (1991) виділили інший набір антиоксазолонових антитіл з маленької випадково комбінаційної бібліотеки V генів одержаних з селе 95902 46 зінки імунізованих мишей. Можна сконструювати набір V генів з імунізованих людей донорів і можна виділити інший набір антитіл антигенів (включаючи напівантигени), по суті, згідно з методиками описаними Marks et al., J. Моl. Biol 222:581-597 (1991), або Griffith et al.,EMBO J. 12:725-734 (1993). Дивіться, також, патенти U.S. № 5,565,332 і 5,573,905. Як обговорювалось вище, антитіла людини також можна одержати in vitro використовуючи активовані В клітини (дивись патенти U.S. 5,567,610 і 5,229,275). HER2 антитіла людини описуються в патенті U.S. № 5,772,997 виданому 30 червня 1998 і WO 97/00271, що опублікована 3 січня 1997. (ν) Фрагменти антитіла Розроблені різні методики одержання фрагментів антитіла, що містять один або більшу кількість антиген зв'язувальних областей. Традиційно, ці фрагменти одержують шляхом протеолітичного гідролізу інтактних антитіл (дивіться, наприклад, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); і Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однак, ці фрагменти зараз можна одержати безпосередньо використовуючи рекомбінантні хазяйські клітини. Наприклад, фрагменти антитіла можна виділити з бібліотек фату антитіла як обговорювалось вище. Альтернативно, Fab'-SH фрагменти можна безпосередньо виділити з Е. соlі і хімічно сконденсувати з утворенням F(ab')2 фрагментів (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Згідно з іншим підходом, F(ab')2 фрагменти можна виділити безпосередньо з культури хазяйської клітини. Інші методики одержання фрагментів антитіла будуть очевидні спеціалісту в цій галузі. В інших втіленнях, вибраним антитілом є одноланцюговий Fv фрагмент (scFv). Дивіться WO 93/16185; патент U.S. № 5,571,894; і патент U.S. № 5,587,458. Фрагментом антитіла також може бути "лінійне антитіло", наприклад, як описано, наприклад, в патенті U.S. 5,641,870. Такі лінійні фрагменти антитіла можуть бути моноспецифічними або біспецифічними. (vi) Біспецифічні антитіла Біспецифічними антитілами є антитіла, що мають зв'язувальну специфічність до, принаймні, двох різних епітопів. Типові біспецифічні антитіла можуть зв'язувати два різні епітопи HER2 протешу. Інші такі антитіла можуть поєднувати HER2 зв'язувальний сайт із зв'язувальним сайтом(ами) для EGFR, HER3 і/або HER4. Альтернативно, HER2 частина може бути поєднана з частиною, яка зв'язує тригерну молекулу на лейкоциті, таку як молекула рецептора Т-клітини (наприклад, CD2 або CD3), або Fc рецептори для IgG (FcγR), такі як FcγRI (CD64), FcγRH (CD32) і FcγRHI (CD16) для того щоб сфокусувати механізми клітинного захисту на клітини, що експресують HER2. Біспецифічні антитіла можуть також бути використані для локалізації цитотоксичних агентів у клітинах, які експресують HER2. Ці антитіла зберігають НЕR2зв'язувальну частину і частину, яка зв'язує цитотоксичний агент (наприклад, сапорін, антиінтерферон-α, алкалоїд барвінку, ланцюг рицину А, 47 метотрексат або мічений радіоактивним ізотопом гаптен). Біспецифічні антитіла можна одержати як повнодовжинні антитіла або фрагменти антитіла (наприклад, F(ab')2 біспецифічні антитіла). WO 96/16673 описує біспецифічне HER2/FcγRIII антитіло і патент U.S. № 5,837,234 описує біспецифічне HER2/FcγRI антитіло IDM1 (Osidem). Біспецифічне HER2/Fcαантитіло показано в WO 98/02463. Патент U.S. № 5,821,337 пропонує біспецифічне HER2/CD3 антитіло. MDX-210 є біспецифічним HER2-FcγRlll Ab. В цій галузі відомі способи одержання біспецифічних антитіл. Традиційне одержання повнодовжинного біспецифічного антитіла ґрунтується на спільній експресії двох пар важкий ланцюглегкий ланцюг імуноглобуліну, де два ланцюги мають різну специфічність (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Оскільки має випадкове розходження генів важкого і легкого ланцюгів імуноглобуліну, ці гібридоми (квадроми) продукують потенційну суміш 10 різних молекул антитіл, з яких тільки одне має відповідну біспецифічну структуру. Очищення відповідної молекули, яке зазвичай проводять за допомогою декількох стадій афінної хроматографії, є скоріше обтяжуючим, і дає продукт з низьким виходом. Подібна методика описується в WO 93/08829 і в Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991). Згідно з іншим підходом, варіабельні домени антитіла з бажаною зв'язувальною специфічністю (антитіло-антиген зв'язувальні сайти) зливають з послідовностями константного домену імуноглобуліну. Зливають переважно з константним доменом важкого ланцюга імуноглобуліну, що включає, принаймні, частину шарніру, СН2 і СН3 області. Переважно мати першу константу область важкого ланцюга (СН1), що містить сайт необхідний для зв'язування легкого ланцюга, присутній в, принаймні, одному із злиттів. ДНК, що кодують, злиття важкого ланцюга імуноглобуліну і, якщо бажано, легкий ланцюг імуноглобуліну, вводять в окремі експресійні вектори, і спільно трансфікують в придатний організм хазяїн. Це забезпечує більшу гнучкість при підгонці відповідних пропорцій трьох поліпептидних фрагментів у втіленнях, коли при конструюванні використовуються нееквівалентні співвідношення трьох поліпептидних ланцюгів забезпечуючи оптимальні виходи. Однак, можна ввести кодувальні послідовності двох або всіх трьох поліпептидних ланцюгів в один експресійний вектор, коли відбувається експресія, принаймні, двох поліпептидних ланцюгів у еквівалентних співвідношеннях з високими виходами або коли співвідношення є не особливо важливим. В переважному втіленні цього підходу, біспецифічні антитіла складаються з важкого ланцюга гібридного імуноглобуліну з першою зв'язувальною специфічністю в одній частині і пари важкий ланцюг-легкий ланцюг гібридного імуноглобуліну (що забезпечує другу зв'язувальну специфічність) в іншій частині. Було знайдено, що ця асиметрична структура полегшує відокремлення бажаної біспецифічної сполуки від небажаних комбінацій ланцюгів імуноглобуліну, як присутність легкого ланцюга імуноглобуліну в тільки одній половині біспецифіч 95902 48 ної молекули забезпечує полегшення розділення. Цей підхід описується в WO 94/04690. Для більш детального ознайомлення з одержанням біспецифічних антитіл дивіться, наприклад, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). Згідно з іншим підходом описаним в патенті U.S. № 5,731,168, поверхня розділу між парою молекул антитіла може бути сконструйована для максимізації відсотку гетеродимерів, які виділяються з культури рекомбінантної клітини. Переважна поверхня розділу включає, принаймні, частину СH3 домену константного домену антитіла. В цьому способі, одну або більшу кількість маленьких амінокислотних бічних ланцюгів з поверхні розділу першої молекули антитіла замінюють більшими бічними ланцюгами (наприклад, тирозин або триптофан). На поверхні розділу другої молекули антитіла утворюються компенсаційні "порожнини" ідентичного або подібного розміру до великого бічного ланцюга(ів) при заміні великих амінокислотних бічних ланцюгів меншими ланцюгами (наприклад, аланін або треонін). Це забезпечує механізм для збільшення виходу гетеродимеру порівняно з іншими небажаними побічними продуктами, такими як гомодимери. Біспецифічні антитіла включають перехресно зв'язані або "гетерокон'юговані" антитіла. Наприклад, одне з антитіл в гетерокон'югаті може бути конденсоване з авідином, інше з біотином. Такі антитіла, наприклад, були запропоновані як цільові клітини імунної системи для небажаних клітин (патент U.S. № 4,676,980), і для лікування ВІЛ інфекції (WO 91/00360, WO 92/200373 і ЕР 03089). Гетерокон'юговані антитіла можна одержати використовуючи будь-які звичайні способи перехресного конденсування. Придатні агенти для перехресного зв'язування добре відомі в цій галузі і описані в патенті U.S. № 4,676,980, разом з рядом методик перехресного зв'язування. В літературі були описані методики одержання біспецифічних антитіл з фрагментів антитіл. Наприклад, біспецифічні антитіла можна одержати використовуючи хімічне зв'язування. Brennan et ai, Science, 229: 81 (1985) описують методику, в якій інтакті антитіла піддають протеолітичному розщепленню з утворенням F(ab')2 фрагментів. Ці фрагменти відновлюють в присутності дітіоілкомлексувального агента- арсеніту натрію, для стабілізації віцинальних дітіолів і попередження утворення внутрішньомолекулярних дисульфідних зв'язків. Одержані Fab' фрагменти потім перетворюють у похідні тіонітробензоату (TNB). Одне з похідних Fab'-TNB потім перетворюють у Fab'-тіол шляхом відновлення меркаптоетиламіном і змішують з еквімолярною кількістю іншого похідного Fab'-TNB з утворенням біспецифічного антитіла. Одержані біспецифічні антитіла можна використовувати як агенти для селективної іммобілізації ферментів. Нещодавні дослідження полегшили безпосереднє виділення Fab'-SH фрагментів з Е. соlі, які можна хімічно сконденсувати з утворенням біспецифічних антитіл. Shalaby etal, J. Exp. Med, 175: 217-225 (1992) описують одержання молекули повністю гуманізованого біспецифічного антитіла F(ab')2. Кожен Fab' фрагмент окремо секретувався 49 в Е. соlі і піддавався безпосередньому хімічному конденсуванню in vitro з утворенням біспецифічного антитіла. Біспецифічне антитіло одержане таким чином було здатне зв'язувати клітини, що надмірно експресують HER2 рецептор, і нормальні Τ клітини людини, також як і ініціювати літичну активність цитотоксичних лімфоцитів людини проти цілей в пухлині молочної залози людини. Також були описані різні методики одержання і виділення фрагментів біспецифічного антитіло безпосередньо з культури рекомбінантних клітин. Наприклад, біспецифічні антитіла одержували використовуючи лейцинові застібки. Kostelny et al., J. Immunol, 148(5):1547-1553 (1992). Пептиди з лейциновими застібками з Fos і Jun протеїнів приєднували до Fab' частин двох різних антитіл використовуючи злитий ген. Гомодимерні антитіла відновлювали в шарнірній області з одержанням мономерів і потім повторно окисляли з утворенням гетеродимерних антитіл. Цей спосіб також можна використати для одержання гомодимерних антитіл. Технологія "димерів" описана Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) забезпечує альтернативний механізм одержання фрагментів біспецифічного антитіла. Фрагменти включають варіабельний домен важкого ланцюгу (VH) приєднаний до варіабельного домену легкого ланцюгу (VL) за допомогою лінкера, який є занадто коротким щоб дозволити парування між двома доменами на тому ж самому ланцюзі. Відповідно, VH і VL домени одного фрагменту примушують до парування з комплементарними VL і VH доменами іншого фрагменту, завдяки чому утворюється два антигензв'язувальні сайти. Також був розкритий інший підхід до одержання фрагментів біспецифічного антитіла, в якому використовуються одноланцюгові Fv (sFv) димери. Дивіться Gruber et al., J. Immunol, 152:5368(1994). Розглядаються антитіла з більше ніж двома валентностями. Наприклад, можна одержати триспецифічні антитіла. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991). (vii) Інші модифікації амінокислотної послідовності Тут розглядаються описані модифікація(ї) амінокислотної послідовності антитіл. Наприклад, вони можуть бути бажаними для покращення спорідненості зв'язування і/або інших біологічних властивостей антитіла. Варіанти амінокислотної послідовності антитіла одержують шляхом введення прийнятних змін нуклеотидів в нуклеїнову кислоту антитіла або шляхом пептидного синтезу. Такими модифікаціями є, наприклад, делеції, і/або вставки, і/або заміщення залишків в межах амінокислотної послідовності антитіла. Будь-яка комбінація делецій, вставок і заміщень виконується для оде 95902 50 ржання кінцевого конструкту, за умови, що кінцевий конструкт має бажані характеристики. Амінокислотні заміни також можуть вноситись використовуючи пост-трансляційні процеси антитіла, такі як зміна кількості або положення глікозильованих сайтів. Корисний спосіб для ідентифікації деяких залишків або областей антитіла, що переважно пристосовані для мутагенезу, має назву "скануючий аланіном мутагенез", як описано Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Тут, ідентифікують залишок або групу цільових залишків (наприклад, зміни залишків, таких як arg, asp, his, lys i glu) і заміну нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (найбільш переважно аланіном або поліаланіном) для впливу на взаємодію амінокислот з антигеном. Ті амінокислотні розташування, що демонструють функціональну чутливість до заміщень, тоді удосконалюють шляхом введення додаткових або інших варіантів біля або в сайта заміщення. Таким чином, в той час як місце для введення варіації амінокислотної послідовності є визначеним, природу мутації саму по собі не треба визначати. Наприклад, для того щоб проаналізувати функціонування мутації в даному місці, проводять сканування аlа або випадковий мутагенез в цільовому кодоні або області і досліджують варіанти експресованого антитіла на бажану активність. Вставками в амінокислотну послідовність є аміно- і/або карбоксил-термінальні приєднання в інтервалі довжин від одного залишку до поліпептидів, що містять сотню або більше залишків, також як і вставки в середину послідовності одного або багатьох амінокислотниих залишків. Прикладами термінальних вставок є антитіло з Nтермінальним метіонільним залишком або антитіло злите з цитотоксичним поліпептидом. Іншими варіантами вставок в молекулу антитіла є кондеснування N- або С-кінця антитіла з ферментом (наприклад, для ADEPT) або поліпептидом, який збільшує час напіврозкладу антитіла в сироватці. Іншим типом варіанту є амінокислотні заміщення варіанту. Ці варіанти мають, принаймні, один амінокислотний залишок в молекулі антитіла замінений іншим залишком. Найбільш цікавими сайтами для заміщувального мутагенезу є гіперваріабельні області, але також розглядають FR зміни. Консервативні заміщення показані в Таблиці 1 під заголовком "переважні заміщення". Якщо такі заміщення призводять до змін в біологічній активності, тоді можуть бути введенні більш значні зміни, названі "приклади заміщення" в Таблиці 1, або як далі описано нижче з посиланням на амінокислотні класи, і потім продукти піддають дослідженню. 51 95902 Таблиця 1 Оригінальний залишок Ala (A) Arg(R) Asn(N) Asp (D) Cys (С) Gln (Q) Glu (E) Gly (G) His (H) lle (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V) Переважне заміщення Val; Leu; lle Val Lys; Gln; Asn Lys Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Glu; Asn Glu Ser; Ala Ser Asn; Glu Asn Asp; Gln Asp Ala Ala Asn; Gln; Lys; Arg Arg Leu; Val; Met; Ala; Phe; Leu Hopлейцин Норлейцин; llе; Val; lle Met; Ala; Phe Arg; Gln; Asn Arg Leu; Phe; lle Leu Trp; Leu; Val; lle; Ala; Tyr Tyr Ala Ala Thr Thr Val; Ser Ser Tyr; Phe Tyr Trp; Phe; Thr; Ser Phe lle; Leu; Met; Phe; Ala; Leu Норлейцин Приклади заміщення Значних модифікації в біологічних властивостях антитіла досягають шляхом селективного заміщення, що значно відрізняється за їх впливом на збереження (а) структури скелету поліпептиду в області заміщення, наприклад, як пласка або спіралевидна конформація, (б) заряду або гідрофобності молекули в цільовому сайті, або (в) загального бічного ланцюга. Амінокислоти можна згрупувати за подібністю властивостей їх бічних ланцюгів (в A. L. Lehninger, в Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) неполярні: Ala (A), Val (V), Leu (L), lle (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) незаряджені полярні: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys I, Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) (3) кислотні: Asp (D), Glu (E) (4) основні: Lys (K), Arg I, His (H) Альтернативно, залишки, що зустрічаються у природі, можна розподілити на групи виходячи із загальних властивостей бічного ланцюга: гідрофобні: Норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, lle; (2) нейтральні гідрофільні: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) кислотні: Asp, Glu; (4) основні: His, Lys, Arg; (5) залишки, що впливають на орієнтацію ланцюга: Gly, Pro; (6) ароматичні: Trp, Tyr, Phe. Неконсервативні заміщення будуть викликати обмін члену одного з цих класів на інший клас. Будь-який цистеїновий залишок не включений в збереження характерної конформації антитіла також може бути заміщений, зазвичай серином, для покращення стійкості до окислення молекули і 52 попередження аберантного зшивання. Навпаки, цистеїновий зв'язок(и) може бути введений в антитіло для покращення його стабільності (особливо, коли антитілом є фрагмент антитіла, такий як Fv фрагмент). Особливо переважний тип варіанта заміщення включає заміщення одного або більшої кількості залишків гіперваріабельної області материнського антитіла (наприклад, гуманізованого або антитіла людини). Загалом, одержаний варіант(и), що вибирають для подальшого удосконалення, буде мати покращенні біологічні властивості порівняно з материнським антитілом, з якого вони були одержані. Звичайний шлях для одержання таких заміщених варіантів включає афінне визрівання використовуючи фаговий дисплей. Коротко, декілька сайтів гіперваріабельної області (наприклад, 6-7 сайтів) піддають мутації для одержання всіх можливих амінозаміщень в кожному сайті. Одержані таким чином варіанти антитіла проявляються в моновалентному способі взаємодії з ниткоподібними фаговими часточками як злиття з продуктом гена III МІ3 упакованого з кожною часточкою. Фаго-відображені варіанти потім досліджували на їх біологічну активність (наприклад, спорідненість зв'язування), як тут описано. Для того щоб ідентифікувати сайта кандитати для модифікації гіперваріабельної області, можна провести скануючий аланіном мутагенез для визначення залишків гіперваріабельної області, що значно впливають на зв'язування антигену. Альтернативно, або додатково, корисним може бути аналіз кристалічної структури комплексу антиген-антитіло для визначення точок контакту між антитілом і HER2 людини. Такі контакті залишки і суміжні залишки є кандидатами на заміщення згідно з методиками розглянутими тут. Одержують такі варіант, ряд варіантів піддають дослідженню як тут описано і в одному або більшій кількості відповідних досліджень можна вибрати для наступних удосконалень антитіла із надзвичайними властивостями. Інший тип амінокислотного варіанта антитіла включає зміну оригінального глікозилювання материнського антитіла. Під зміною розуміють видалення одного або більшої кількості вуглеводних залишків розташованих на антитілі і/або введення одного або більшої кількості глікозильованих сайтів, що не присутні в антитілі. Глікозилювання антитіл типово відбувається або через N-приєднання, або О-приєднання. Nприєднання стосується приєднання вуглеводного замісника по бічному ланцюзі залишку аспарагіну. Трипептидні послідовності аспарагін-Х-серин і аспарагін-Х-треонін, де X є будь якою амінокислотою, за винятком проліну, є послідовностями, що розпізнаються, для ферментного приєднання вуглеводного замісника до бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, присутність цих трипептидних послідовностей в поліпептиді створює потенційний сайт глікозилювання. Глікозилювання через Оприєднання стосується приєднання одного з таких цукрів як N-ацетилгалактозамін, галактоза або ксилоза до гідроксиамінокислоти, найбільш звично 53 серину або треоніну, хоча також можуть бути використані 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин. Введення сайтів глікозилювання в антитіло зручно провести шляхом зміни амінокислотної послідовності, за умови щоб вона містила одну або більшу кількість описаних вище трипептидних послідовностей (для N-приєднаних сайтів глікозилювання). Зміну також можна зробити шляхом додавання або заміни одного або декількох залишків серину або треоніну в послідовності оригінального антитіла (для О-приєднаних сайтів глікозилювання). Коли антитіло містить Fc область, можна змінити вид вуглеводу приєднаного до нього. Наприклад, антитіла із зрілою структурою вуглеводу, що позбавлені фукози приєднаної до Fc області антитіла описані в заявці на патент US з серійним номером US 2003/0157108 Α1, Presta, L. Дивіться також US 2004/0093621 A1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Антитіла з N-ацетилглюкозаміном (GlcNAc), що діляться надвоє, по вуглеводу приєднаному до Fc області антитіла згадані в WO 03/011878, Jean-Mairet et al. і патенті US № 6,602,684, Umana et al. Антитіла з, принаймні, одним галактозним залишком в олігосахариді приєднаному до Fc області антитіла описуються в WO 97/30087, Patel et al. Дивіться, також, WO 98/58964 (Raju, S.) і WO 99/22764 (Raju, S.), що стосуються антитіл із зміненим вуглеводом приєднаним до їх Fc області. Може бути бажано модифікувати антитіло винаходу стосовно ефекторної функції, наприклад, для того щоб збільшити антиген-залежну клітиноопосередковану цитотоксичність (ADCC) і/або комплементзалежну цитотоксичність (CDC) антитіла. Це можна досягти шляхом введення однієї або більшої кількості амінокислотних заміщень в Fc область антитіла. Альтернативно або додатково, цистеїновий залишок(ки) можна ввести в Fc область, дозволивши таким чином утворення міжланцюгових дисульфідних зв'язків в цій області. Одержане таким чином гомодимерне антитіло може мати покращину інтерналізаційну здатність і/або підвищену комплемент-опосередкований лізис клітин і антитіло-залежну клітинну цитотоксичність (ADCC). Дивіться Caron et al., J. ExpMed. 176:1191-1195 (1992) і Shopes, В. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерні антитіла з підвищеною протипухлинною активністю також можна одержати використовуючи гетеробіфункціональні крос-лінкери як описано в Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Альтернативно, можна сконструювати антитіло, яке має дві Fc області і тому може мати підвищений комплементний лізис і здатність до ADCC. Дивіться Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989). WO 00/42072 (Presta, L.) описує антитіла з покращеною ADCC функцією в присутності ефекторних клітин людини, де антитіла містять амінокислотні заміщення в їх Fc області. Переважно, антитіло з покращеною ADCC містить заміщення в положеннях 298,333 і/або 334 Fc області (нумерація залишків згідно з Еu). Переважно, зміненою Fc областю є Fc область IgG1 людини, що місить або включає заміщення в одному, двох або трьох з цих 95902 54 положень. Такі заміщення, необов'язково, поєднують із заміщенням(и), які підвищують C1q зв'язування і/або CDC. Антитіла із зміненим зв'язуванням С1q і/або комплемент залежною цитотоксичністю (CDC) описуються в WO 99/51642, патент US № 6,194,551В1, патент US № 6,242,195В1, патент US № 6,528,624В1 і патент US № 6,538,124 (Idusogie et al.). Антитіла містять амінокислотні заміщення в одному або більшій кількості амінокислотних положень 270,322, 326, 327, 329, 313,333 і/або 334 їх Fc області (нумерація залишків згідно з Еu). Для підвищення часу напіврозкладу антитіла в сироватці, воно може включати реутилізаційний епітоп зв'язувального рецептора в антитілі (особливо фрагмент антитіла) як описано, наприклад, в патенті US 5,739,277. Як тут використовується, термін "реутилізаційний епітоп зв'язувального рецептора" стосується епітопа Fc області молекули IgG (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4), що відповідає за підвищення in vivo часу напіврозкладу в сироватці молекули IgG. Антитіла з покращеним зв'язуванням з неонатальним Fc рецептором (FcRn) і підвищеним часом напіврозкладу описуються в WO 00/42072 (Presta, L.) і US 2005/0014934A1 (Hinton et al.). Ці антитіла включаючть Fc область з однією або більшою кількістю заміщень, які покращують зв'язування Fc області з FcRn. Наприклад, Fc область може мати заміщення в одній або більшій кількості положень 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 або 434 (нумерація залишків згідно з Еu). Переважний варіант Fc область-вмісного антитіла з покращеним зв'язуванням FcRn включає амінокислотні заміщення по одному, двом або трьом положенням 307,380 і 434 його Fc області (нумерація залишків згідно з Еu). Також розглядається конструювання антитіл з трьома або більше (переважно чотирма) функціональними антигензв'язувальними сайтами (патентна заявка US з серійним номером № US 2002/0004587 A1, Miller et al.). Молекули нуклеїнової кислоти, що кодують амінокислотну послідовність варіантів антитіла, переважно змінюються із застосуванням методик відомих в цій галузі. Ці методи включають, але не обмежується, виділення з природного джерела (у випадку варіантів амінокислотної послідовності, що зустрічаються в природі) або одержання із застосуванням олігонуклеотид-опосередкованого (або сайт-спрямованого) мутагенезу, PCR мутагенезу і касетного мутагенезу раніше одержаного варіанту або неваріантної версії антитіла. (viii) Дослідження антитіл з бажаними властивостями Методики одержання антитіл були описані вище. При бажанні, можна також вибрати антитіла з визначеними біологічними характеристиками. Для ідентифікації антитіла, яке блокує активацію лігандом HER рецептора, можна визначити здатність антитіла блокувати HER ліганд пов'язаний з експресією клітинами HER рецептора (наприклад, у поєднанні з іншим HER рецептором з яким цікавий HER рецептор утворює HER гетеро 55 олігомер). Наприклад, клітини, що природно експресують, або трансфіковані для експресії HER рецептори HER гетероолігомеру можна інкубувати з антитілом і потім зв'язати з міченим HER лігандом. Потім можна оцінити здатність антитіла блокувати зв'язування ліганду з HER рецептором в HER гетероолігомері. Наприклад, інгібування зв'язування HRG з MCF7 ліній клітин пухлини молочної залози використовуючи HER2 антитіла проводять використовуючи моношарові MCF7 культури на льоду в форматі 24-лункового планшету, по суті, як описано в WO 01/00245. HER2 моноклональні антитіла додають до кожної лунки і інкубують протягом 30 125 хвилин. Потім додають І-мічений rHRG/β1177-224 (25 пм) і інкубування продовжують від 4 до 16 годин. Одержують криві залежності відповідь від дози і розраховують значення ІС50 для цікавого антитіла. В одному з втілень, антитіло, яке блокує активацію ліганду HER рецептора буде мати ІС50 для інгібування зв'язування HRG з MCF7 клітинами в цьому дослідженні приблизно 50 нМ або менше, більш переважно 10 нМ або менше. Коли антитілом є фрагмент антитіла, такий як Fab фрагмент, ІС50 для інгібування зв'язування HRG з MCF7 клітинами в цьому дослідженні може, наприклад, бути приблизно 100 нМ або менше, більш переважно 50 нМ або менше. Альтернативно, або додатково, можна дослідити здатність антитіла блокувати HER лігандстимулюване фосфорильвання тирозину HER рецептора присутнього в HER гетероолігомері. Наприклад, клітини, що ендогенно експресують HER рецептори, або трансфіковані для їх експресії можна інкубувати з антитілом і потім дослідити на HER ліганд-залежну активність по фосфорилюванню тирозину використовуючи моноклональний анти-фосфотирозин (який є необов'язково кон'югованим з детектованою міткою). Дослідження активації рецептора кінази, що описується в патенті U.S. № 5,766,863, також придатне для визначення активації HER рецептора і блокування цієї активності антитілом. В одному з втілень, можна дослідити антитіло, яке інгібує стимулювання HRG фосфорилювання p180 тирозину в MCF7 клітинах, по суті, як описано в WO 01/00245. Наприклад, MCF7 клітини наносять на 24-лункові планшети і додають моноклональні антитіла для HER2 до кожної лунки і інкубують протягом 30 хвилин при кімнатній температурі; потім до кожної лунки додають rHRGΒ1 177-244 із кінцевою концентрацією 0,2 нМ, і інкубування продовжують протягом 8 хвилин. Середовище видаляють з кожної лунки і реакції зупиняють додаючи 100 мкл зразка буфера SDS (5% SDS, 25 мМ DTT і 25 мМ Tris-НСl, рН 6,8). Кожен зразок (25 мкл) піддають електрофорезу на гелі з 4-12% градієнтом (Novex) і потім електрофоретично переносять до полівінілідендифторидної мембрани. Одержують імуноблоти антифосфотироозину (при 1 мкг/мл) і визначають інтенсивність домінуючих реактивних смуг при Мr -180000 використовуючи відбивну денситометрію. Вибране антитіло, в цьому дослідженні, буде переважно значно інгібувати стимулювання HRG фосфори 95902 56 лювання рі 80 тирозину до приблизно 0-35% від контролю. Можна одержати криву доза-відповідь для інгібування стимулювання HRG фосфорилювання p180 тирозину як визначено із використанням відбивної денситометрії і розрахувати ІС50 для цікавого антитіла. В одному з втілень, антитіло, яке блокує активацію ліганду HER рецептора буде мати ІС50 для інгібування стимулювання HRG фосфорилювання p180 тирозину в цьому дослідженні приблизно 50 нМ або менше, більш переважно 10 нМ або менше. Коли антитілом є фрагмент антитіла, такий як Fab фрагмент, ІС50 для інгібування стимулювання HRG фосфорилювання p180 тирозину в цьому дослідженні може бути, наприклад, приблизно 100 нМ або менше, більш переважно 50 нМ або менше. Також можна дослідити ростінгібувальну дію антитіла на MDA-MB-175 клітини, наприклад, по суті, як описано в Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997). Згідно з цим дослідженням, MDA-MB-175 клітини обробляють HER2 моноклональним антитілом (10 мкг/мл) протягом 4 днів і зафарбовують використовуючи кристалічний фіолетовий. Інкубування з HER2 антитілом показує ростінгібувальну дію на ці клітини подібну до тієї, що проявляє моноклональне антитіло 2С4. В наступному втіленні, екзогенний HRG в незначній мірі обертає це інгібування. Переважно, антитіло буде здатне інгібувати проліферацію MDA-МВ-175 клітин із більшим ступенем ніж моноклональне антитіло 4D5 (і необов'язково із більшим ступенем ніж моноклональне антитіло 7F3), обидва в присутності і відсутності екзогенного HRG. В одному з втілень, цікаве HER2 антитіло може блокувати херегулінзалежне поєднання HER2 з HER3 і в MCF7, і в SK-BR-3 клітинах, як визначено в спів-імунопреципітаційному експерименті, такому як той що описаний в WO 01/00245, по суті, більш ефективно ніж моноклональне антитіло 4D5, і переважно, по суті, більш ефективно ніж моноклональне антитіло 7F3. Для визначення інгібування росту HER2 антитілами, можна дослідити антитіла, які інгібують ріст ракових клітин, які надмірно експресують HER2. В одному з втілень, вибране антитіло, що інгібує ріст, здатне інгібувати ріст SK-BR-3 клітин в культурі клітин на приблизно 20-100% і переважно на приблизно 50-100% при концентрації антитіла приблизно від 0,5 до 30 мкг/мл. Для ідентифікування таких антитіл, можна провести SK-BR-3 дослідження описане в патенті U. S. № 5,677,171. Згідно з цим дослідженням, вирощують SK-BR-3 клітини в 1:1 суміші F12 і DMEM середовища доповненого 10% сироватки ембріону теляти, глутаміном і пеніцилін стрептоміцином. SK-BR-3 клітини висівають в кількості 20000 клітин в 35 мм чашки для культур клітин (2 мл/35мм чашку). До кожної чашки додають від 0,5 до 30 мкг/мл HER2 антитіла. Через шість днів, підраховують кількість клітин порівняно з необробленими клітинами використовуючи електронний лічильник клітин COULTER™. Ті антитіла, що інгібують ріст SK-BR-3 клітин на приблизно 20-100% або приблизно 50-100% можна відібрати як антитіла, що інгібують ріст. Дивіться патент US № 5,677,171, в якому описані мето 57 дики скринінгу інгібування росту антитілами, такими як 4D5 і 3Е8. Для того щоб вибрати антитіла, які викликають апоптоз, доступним є дослідження зв'язування аннексину використовуючи ВТ474 клітини. ВТ474 клітини культивують і висівають у чашки як обговорювалось в попередньому параграфі. Середовище потім видаляють і заміняють одним свіжим середовищем або середовищем, що містить 10 мкг/мл моноклонального антитіла. Після трьох днів інкубаційного періоду, моношари промивають PBS і розділяють трипсинізацією. Клітини потім 2+ центрифугують, ресуспендують в Са зв'язувальному буфері і аліквотують в пробірки як обговорювалось вище в дослідженні некрозу клітин. В пробірки потім додають мічений аннексии (наприклад, аннексии V-FTIC) (1 мкг/мл). Зразки можна аналізувати використовуючи потоковий цитометр FACSCAN™ і програмне забезпечення FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson). Ті антитіла, які акумулювали статистично значні рівні зв'язаного аннексину порівняно з контролем відбирають як апоптоз-стимулюючі антитіла. На додаток до дослідження зв'язування аннексину, доступним є дослідження забарвленої ДНК використовуючи ВТ474 клітини. Для того щоб провести це дослідження, ВТ474 клітини, які мають бути оброблені досліджуваним антитілом, як описано в двох попередніх параграфах, інкубують з 9 мкг/мл HOECHST 33342™ протягом 2 г при 37°С, і потім аналізують на потоковому цитометрі EPICSELITE™ (Coulter Corporation) використовуючи програмне забезпечення MODFITLT™ (Verity Software House). Антитіла, які викликають зміну відсотка апоптичних клітин в 2 рази або більше (і переважно 3 рази або більше), ніж необроблені клітини (до 100% апоптичних клітин) можна відбирати як про-апоптичні антитіла використовуючи це дослідження. Дивіться WO 98/17797, яка стосується скринінгу антитіл, які стимулюють апоптоз, таких як 7С2 і 7F3. Для скринінгу антитіл, які зв'язують епітоп на HER2 можна провести зв'язування цікавого антитіла в звичайному перехресно-блокувальному дослідженні, такому як те, що описане в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), дослідивши яке антитіло блокує перехресне зв'язування антитіла, такого як 2С4 або пертузумаб, з HER2. Альтернативно, або додатково, можна провести картування епітопу за методами відомими в цій галузі і/або можна дослідити структуру антитіло-НЕR2 (Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)) визначивши, який домен(и) HER2 зв'язується антитілом. (іх) Композиції пертузумабу В одному з втілень композиції HER2 антитіла, композиція містить головні види антитіла пертузумабу і один або більшу кількість їх варіантів. Переважне тут втілення головних видів антитіла пертузумабу є антитіло, що включає варіабельну легку і варіабельну важку амінокислотні послідовності показані на SEQ ID NO 3 і 4, і найбільш переважно, що включає легкий ланцюг амінокислотної послідовності, яку вибирають з SEQ ID NO 13 і 17, і важкий ланцюг амінокислотної послідовності, яку 95902 58 вибирають з SEQ ID NO 14 і 18 (включаючи деамідовані і/або окислені варіанти цих послідовностей). В одному з втілень, композиція містить суміш головних видів антитіла пертузумабу і його варіант амінокислотної послідовності, що містить амінотермінальне лідерне подовження. Переважно, аміно-термінальним лідерним подовження є варіант легкого ланцюга антитіла (наприклад, по одному або двом легким ланцюгам варіанта антитіла). Головні види HER2 антитіла або варіанти антитіла можуть бути повнодовжинним антитілом або фрагментом антитіла (наприклад, Fab з F(ab=)2 фрагментів), але переважно обидва є повнодовжинними антитілами. Варіанти антитіла тут можуть включати аміно-термінальне лідерне подовження на будь-якому одному або декількох з його важкого або легкого ланцюгів. Переважно, аміно-термінальне лідерне подовження знаходиться на одному або двох легких ланцюгах антитіла. Аміно-термінальне лідерне подовження переважно містить або складається з VHS-. Присутність аміно-термінального лідерного подовження в композиції можна визначити використовуючи різні аналітичні методики включаючи, але не обмежується, аналіз N-термінальної послідовності, дослідження зміни гетерогенності (наприклад, катіон-обмінна хроматографія або капілярно зонний електрофорез), мас-спектрометрія, і т.і. Кількість варіанта антитіла в композиції загалом змінюється від кількості, що становить межу детектування будь-якого дослідження (переважно, аналіз N-термінальної послідовності), що використовується для детектування варіанта, до кількості менше ніж кількість головних видів антитіла. Загалом, приблизно 20% або менше (наприклад, від приблизно 1% до приблизно 15%, наприклад від 5% до приблизно 15%) молекул антитіла в композиції містять аміно-термінального лідерного подовження. Такі значення відсотків переважно визначають використовуючи кількісний аналіз Nтермінальної послідовності або катіонообмінний аналіз (переважно, використовуючи високороздільну слабокатіоннообмінну колонку, таку як катіоннообмінна колонка PROP AC WCX-10™). За винятком варіанта аміно-термінального лідерного подовження, також тут розглядаються зміни амінокислотної послідовності головних видів антитіла і/або варіанта, включаючи, але не обмежується, антитіло, що містить С-термінальний залишок лізину на одному або обох його важких ланцюгах, варіант деамідованого антитіла і т.і. Однак, головні види антитіла або варіанта можуть також включати глікозильовані варіанти, необмежуючими прикладами яких є антитіло, що містить G1 або G2 олігосахаридну структуру приєднану до його Fc області, антитіло, що містить вуглеводний замісник приєднаний до його легкого ланцюга (наприклад, один або два вуглеводні залишки, такі як глюкоза або галактоза, що приєднані до одного або двох легких ланцюгів антитіла, наприклад, що приєднані до одного або більшої кількості лізинових залишків), антитіло, що містить один або два неглікозильовані важкі ланцюги, або антитіло, що містить сіалідований олігосахарид 59 приєднаний до одного або двох його вадких ланцюгів і т.і.. Композицію можна одержати з генетично сконструйованої лінії клітин, наприклад, лінії клітин яічників китайського хом'ячка (СНО), що екпресують HER2 антитіло, або можна одержати використовуючи пептидний синтез. (х) Імунокон 'югати Винахід також стосується імунокон'югатів, що містять антитіло кон'юговане з цитотоксичним агентом, таким як хіміотерапевтичний агент, токсин (наприклад, низькомолекулярний токсин або ферментноактивний токсин бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, включаючи фрагменти і/або їх варіанти), або радіоактивний ізотоп (наприклад, радіокон'югат). Хіміотерапевтичні агенти корисні при одержанні таких імунокон'югатів були описані вище. Також тут розглядаються кон'югати антитіла і одного або більшої кількості низькомолекулярних токсинів, таких як каліхеаміцин, міатанзин (патент U.S. № 5,208,020), трихотен і СС1065. В одному з переважних втілень винаходу, антитіло кон'юговане з одним або більшою кількістю молекул маітанзину (наприклад, від приблизно 1 до приблизно 10 молекул маітанзину на молекула антитіла). Маітанзин можна, наприклад, перетворити у May-SS-Me, який можна відновити до MaySH3 і ввести у взаємодію з модифікованим антитілом (Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)) з утворенням імунокон'югату маітанзиноїдантитіло. Іншим цікавим імунокон'югатом є антитіло кон'юговане з одним або більшою кількістю молекул каліхеаміцину. Родина каліхеаміцинових антибіотиків здатна руйнувати утворення дволанцюгової ДНК при суб-пікомолярних концентраціях. Структурними аналогами каліхеаміцину, які можуть бути використані є, але не обмежується, l l l 1 I γ1 , α2 , α3 , N-ацетил-γ1 , PSAG і θ 1 (Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) і Lode et al. Cancer Research 58:2925-2928 (1998)). Дивіться, також, патент US № 5,714,586; 5,712,374; 5,264,586 і 5,773,001, спеціально включений сюди як посилання. Ферментноактивними токсинами і їх фрагментами, які можуть бути використані, є ланцюг дифтериту А, незв'язуючі активні фрагменти токсину дифтериту, ланцюг екзотоксину А (з Pseudomonas aeruginosa), ланцюг рицину А, ланцюг абрину А, ланцюг модецину А, альфа-сарцин, протеїни Aleurites fordii, протеїни діантину, протеїни Phytolaca americana (РАРІ, РАРll і PAP-S), інгібітор дині гіркої, курцин, кротин, інгібітор мильнянки лікарської, гелонін, мiтогеллін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і трикотецени. Дивіться, наприклад, WO 93/21232, що опублікований 28 жовтня 1993. Представлений винахід також розглядає імунокон'югати утворені антитілом і сполукою з нуколеотичною активністю (наприклад, рибонуклеаза або ДНК ендонуклеаза, така як деоксирибонуклеаза; ДНаза). Різні радіоактивні ізотопи є доступними для одержання радіокон'югованих HER2 антитіл. При 95902 60 211 131 125 90 186 188 153 кладами є At , l , l , Y , Re , Re , Sm , 212 32 Ві , Ρ і радіоактивні ізотопи Lu. Кон'югати антитіла і цитотоксичного агента можна одержати використовуючи різноманіття конденсувальних агентів біфункціональних протеїнів, такі як N-сукцинімідил-3-(2піридилдітіол)пропіонат (SPDP), сукцинімідил-4-(Nмалеімідометил)циклогексан-1-карбоксилат, імінотіолан (IT), біфункцілнальні похідні імідоестерів (такі як диметил адипімідату НСl), активні естери (такі як дисукцинімідилу суберат), альдегіди (такі як глутаральдегід), біс-азидосполуки (такі як біс(пазидобензоїл)гександіамін), біс-діазонієві похідні (такі як біс-(п-діазонійбензоїл)-етилендіамін), діізоціанати (такі як толуол 2,6-діізоціанат) і сполуки з біс-активнийм фтором (такі як 1,5-дифтор-2,4динітробензол). Наприклад, імунотоксин рицин можна одержати як описано в Vitetta et al. Science 238:1098 (1987). Мічена вуглецем-14 1ізотіоціанатобензил-3метилдиетилентриамінпентаоцтова кислота (MXDTPA) є прикладом хелатуючого агента для кон'югації радіонуклеотиду з антитілом. Дивіться WO 94/11026. Лінкером може бути "відщеплюваний лінкер", що полегшує вивільнення цитотоксичного лікарського засобу в клітині. Наприклад, може бути використаний кислотонестійкий лінкер, пептидазочутливий лінкер, диметиловий лінкер або дисульфідвмісний лінкер (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)). Альтернативно, злитий протеїн, що містить антитіло і цитотоксичний агент, можна одержати, наприклад, використовуючи рекомбінантні методики або пептидний синтез. Тут також розглядаються інші імунокон'югати. Наприклад, антитіло можна зв'язати з одним з великого вибору непротеїнових полімерів, наприклад, поліетиленгліколь, поліпропіленгліколь, поліоксиалкілени або співполімери поліетиленгліколю і поліпропіленгліколю. Антитіло також може бути включено в мікрокапсули одержані, наприклад, за допомогою методик консервації або використовуючи полімеризацію на межі фаз (наприклад, гідроксиметилцелюлоза або мікрокапсули з желатину і полі-(метилметакрилатні) мікрокапсули, відповідно), в колоїдних системах вивільнення лікарського засобу (наприклад, ліпосоми, мікрокапсули альбуміну, мікроемульсії, наночасточки і нанокапсули), або в мікроемульсіях. Такі методики описуються в Remington's Pharmaceutical th Sciences, 16 edition, Oslo, Α., Ed., (1980). Антитіла описані тут також можна сформулювати як імуноліпосоми. Ліпосоми, що містять антитіло, одержують за способами відомими в цій галузі, такі як описано в Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sex. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); патент U.S. № 4,485,045 і 4,544,545; і WO 97/38731, що опублікована 23 жовтня 1997. Ліпосоми із збільшеним часом циркуляції описуються в патенті U.S. № 5,013,556. Особливо корисні ліпосоми можна одержати за допомогою способу обернено-фазового випарювання використовуючи ліпідну композицію, що містить фосфатидилхолін, холестерол і PEG