Сполука (rs)-2-(2-оксо-4-фенілпіролідин-1-іл)ацетамід, яка має модуляторну активність з пропорційним впливом, фармацевтичний склад субстанції (варіанти) та його застосування, композиція (варіанти)

Реферат: Винахід стосується різних областей медицини, фармації та фармакології, хімікофармацевтичної, фармацевтичної та парафармацевтичної промисловості, конкретно стосується нового класу засобів, що має модуляторну активність з співмірним впливом. Винахід полягає в тому, що запропонований продукт (RS)-2-(2-оксо-4-фенілпіролідин-1-іл)ацетамід не містить у своєму складі біологічно інертних речовин, які здійснюють негативний вплив на його вперше виявлені і суттєво покращені відомі властивості і характеристики, відкриваючи при цьому раніше невідомі основоположні і найважливіші уявлення про сполуку, розширюючи області її застосування з підвищенням ефективності та безпеки застосування, збільшенням терапевтичної широти, забезпечує отримання продукту і її продукції з виявленими властивостями і характеристиками. UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рівень техніки. Вперше визначення модуляції (від лат. modulatio - мірність, розмірність) як співрозмірного (лат. - commensuratur, англ. - сommensurate) впливу і дивергентності (від лат. divergerens розходження), як розходження впливу у фармакології були введені і фундаментально обґрунтовані В.І.Ахапкіною в 2006 році в доповіді "Класифікація лікарських засобів, її фундаментальні та прикладні основи та проблеми" на ХIII Російському національному конгресі "Людина і ліки". Облігатні критерії виявлення і оцінки цих видів активності та їх механізмів дії мають суттєві відмінності від лише або переважно однозначно стимулюючих і пригнічуючих засобів. Модуляторна активність - співрозмірний вплив на процеси і стимуляції, і пригнічення, їх пропорційно консолідоване сполучення й співрозмірну реверсивність. Стимулююча і пригнічуюча дія співрозмірного впливу здатна проявлятися диференційовано за перевагою в залежності від типу стану організму в нормі і від типу розладу норми. Співрозмірний вплив, включаючи тригерну трансмісію і реверсивність, є основною відмінною ознакою модуляторів від інших базових класів препаратів (стимулятори, засоби, що пригнічують, дивергенти). Концептуалізація модуляції усунула спотворення її розуміння, існуючого довгі роки саме в біології та медицині, який визначається модулюючим впливом, що не відповідає по суті поняттю модуляції як такому в принципі. Дивергентна активність - зміна базової активності з вираженим розходженням стимуляції і пригнічення залежно від дози. Ознаки дивергентності в медицині і зокрема в фармакології, на відміну від дивергенції в математиці і визначення Ч.Дарвіна, розходяться не тільки з однієї точки або з одного виду. На рівні сучасного наукового знання є всі підстави говорити про те, що модуляція і дивергентність відіграють провідну організаційно-управлінську патогенетичну і функціональну роль в живому організмі. Речовини, що синтезуються в організмі, можуть в одних випадках грати роль модуляторів (наприклад, за рахунок конформації, сполучено асиметричною стереоспецифічності потенціалу дії, що забезпечують реверсивність процесів і т.д.), а в інших дивергентів з явним ефектом зміни парадигми за рахунок концентрації, що особливо виражено при зміні ритму сон-неспання і навпаки. Відомо, що нейротрансмітери (включаючи ГАМК) проявляють як збудливий, так і гальмівний вплив залежно від місця, часу, умов, віку. Відомий поліморфізм синапсів (визначаючий сигнальну диференціацію) і нейронів. Виявлено та описано шаперони, ко-фактори і транскрипційні фактори. Доведено, що вони в одних випадках забезпечують зниження, а в інших підвищення впливу і константи зв'язування. Всупереч науковим відкриттям і досягненням, існуюча класифікація лікарських засобів не зазнала змін по суті і як і раніше базується на діархіі (або тільки стимуляція, або тільки пригнічення), що бере коріння з "принципу Дейла" [36]. Вона фундаментально, морально і фізично застаріла, так як в її рамки не можуть вписатися не тільки модулятори з співрозмірним впливом, а й дивергенти. Вони не можуть бути включені і в її групи "нетипові" ("атипові") або "інші", так як їх вплив типово й органічно, визначено природою еволюції. Класи модуляторів (розмірний вплив) і дивергентів дозволяють більш об'єктивно оцінювати ефективність препаратів, їх механізми дії та місце в систематизації, визначати нові підходи до лікування, корекції та профілактики різних розладів і захворювань з найбільш раціональним дозуванням і прогнозуванням впливу того чи іншого засобу. При цьому ексфоліативні (від лат. ехfoliatio - розшарування), інші супутні та опосередковані компоненти дії модуляторів і дивергентів, як втім і стимуляторів, і пригнічуючих речовин, вторинні і не є визначальними в їх класифікації. Вторинними ознаки названі не за значимістю, а тому що вони в тій чи іншій мірі є або залежними, або загальними, зазвичай розглядаються в групах і підгрупах при систематизації класів, але часто мають у медичній практиці значиме і самостійне застосування. До таких ознак належать в першу чергу ноотропний і адаптогенний ефекти, вплив на метаболізм, присутні в тій чи іншій мірі практично у будь-якого засобі. Порушення адаптивної регуляції, когнітивних процесів, метаболізму і їх пластичності відбуваються як на фоні будь-якого типу розладу і патологічного стану (особливо на стадіях загострення, ускладнення, хронічного протікання), так і в постфертильному періоді. Розлад когнітивних процесів, адаптивної регуляції, пластичної організації відбувається не тільки на фоні їх пригнічення, а фаза виснаження організму не може входити в тріаду стресу (позитивний стрес, дистрес, дестрес), так як це вже не стрес, а наслідок дезорганізаційної фази негативного стресу (дестрес). Дивергенти представлені в номенклатурі препаратів досить широко, але примусово приписані або до стимуляторів, або до засобів, що пригнічують, хоча по суті такими не є. Переважна кількість препаратів з групи "ноотрапів" (Т.А. Вороніна, 1989; Т.А. Вороніна, С.Б. 1 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Середенин, 1998, 2007), за винятком стимуляторів (пірацетам та ін.), деякі нейролептики, анксиолітики, антидепресанти, протиелептичні засоби та інші психотропні та нейротропні продукти є дивергентами з притаманними для них вторинними ознаками. Спроби зв'язати активність дивергентів і багатьох стимуляторів з ноотропною концепцією в тому вигляді, в якому вона існує, не увінчалися успіхом за сорок років досліджень з об'єктивних причин. Немає підстав стверджувати й те, що стимуляція нейрометаболізму є виключно прерогативою ноотроної активності, а ноотропний ефект лікарських засобів необхідний виключно як виражено стимулюючий. По суті ноотропно-стимулююча активність, названа істинною ноотропною активністю у відомих препаратів не базова, а компонент дії і досить дозозалежний, розшаровуються у більшості препаратів з базовою активністю або на фоні базової активності, зникаючий при збільшенні дози [23; 24]. Наприклад, фенібут, пантогам та інші - класичні дивергенти (стимулятори в низьких дозах і транквілізатори або навіть снодійне в більш високих дозах). Їх вторинні ознаки (ноотропні, адаптогенні та ін. ефекти) розшаровуються. На підставі відомих ефектів і механізмів дії препарату фенотропіл-Nкарбамоілметіл-4-феніл-2-піролідон [31; 2-7; 9-21; 25; 26; 32-34], виявлених ефектів у оптично чистих ізомерів N-карбамоілметіл-4(R)-феніл-2-пірролідінон та N-карбамоілметіл-4(S)-феніл-2пірролідінон (WO2007/104780 А2, дата публікації 20.07.2007), з усією очевидністю можна стверджувати те, що рацемічний продукт і продукти оптично чистих ізомерних речовин є дивергентами з притаманними для них супутніми компонентами дії, включаючи ексфоліативні ознаки. Виявлені сукупні показники за впливом препарату фенотропіл на симптомокомплекс інсульту різної етіології також, строго кажучи, вказує на модулюючий вплив [5], тому така специфічна ознака як співрозмірність в результаті не була внесена у формулу та до Інструкції на застосування. Модулюючий вплив фенотропілу підтверджено і за механізмами дії [26, 32, 33]. У пірацетему на фоні стимулюючої активності виражено розшаровуються антигіпоксичний з ноотропним і адаптогенним компонентами дії. Стимулююча активність пірацетаму посилюється із збільшенням дози і при цьому зникає ноотропний ефект, але проявляється антигіпоксичний. Збільшення дози пірацетаму вступає в явне протиріччя з ноотропною концепцією, викликаючи порушення концентрації уваги, сплутаність свідомості і галюцинації, що характерно для психостимуляторів. Відомі нейрометаболічні стимулятори - нейропептиди не володіють антигіпоксичною активністю, але мають виражений антиамнестичний ефект. Транквілізатори бензодіазепінового ряду, володіючи вираженим антигіпоксичним ефектом, самі викликають амнезію, а в низьких порогових дозах здатні виявляти стимулюючу активність. Вторинні ознаки пом'якшують до певної міри екстенсивну та репресивну активність у препаратів нового покоління, особливо якщо вони поліативні та паліативні, що залежить від механізмів дії того чи іншого засобу в тих чи інших дозах. Враховуючи, що вторинні ознаки залежать від базової активності і механізмів дії препарату, вони також можуть характеризуватися по-різному і це, в свою чергу, визначає їх місце в систематизації анатомотерапевтично-хімічної (АТХ) класифікації лікарських засобів. Аналіз відомих джерел інформації показує, що модулятори з співрозмірним впливом в номенклатурі лікарських засобів не представлені. Спотворене розуміння "модуляції" саме в біології та медицині [38] з модулюючим впливом вкладене в лапки М.Д. Машковським [27] "імуномодулятори" - лікарські препарати, які модулюють процеси імунітету (підгрупа А імуностимулятори - левамізол, тималін та ін., підгрупа В - імунодепресанти - азатіоприн, батріден та ін.) В результаті імунодепресанти були виключені з "імуномодуляторів". До теперішнього часу визначення - модулюючий вплив застосовується лише для комплексних стимуляторів або стимуляторів з комплексним стимулюючим механізмом дії [31]. Модулюючим (стимулюючим) синергізмом і опосередкованим потенціюванням володіють церебролізин, семакс, нооглютіл, пірацетам, фенотропіл та ін. За аналогією визначені "нейромодулятори" з модулюючим впливом, синтезовані в організмі [29]. Модулюючим впливом характеризується все що завгодно, включаючи дискретну трансмісію (коли одне включили, а інше при цьому виключили) [37] і шкідливу дію факторів ризику (Н.В. Іванова, 2009). Визначення модулюючого впливу (синонім "модуляції") не відповідає суті модуляції як такої в принципі і його облігатні критерії (ознаки) не відповідають вимогам істинної модуляції і модуляторної активності. Недоліки прямої і/або опосередкованої або лише стимулюючої переважно дії за принципом синергізму або потенціювання комплексного складу або комплексного механізму дії, або лише пригнічуючої дії, або з змінною (дивергентною) активністю в залежності від дози досить добре вивчені і відомі. Дискретна трансмісія практично не відрізняється від шкідливої дії факторів ризику, проявляючись сенсибілізацією, зниженням порогів реакцій, розвитком атипової поведінки, утворенням атипових білків і атипових клітин, розвитком різних форм залежності. 2 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Багато захворювань усунути застосуванням стимуляторів, репресорів, дівергентів або не вдається, забезпечуючи або прискорюючи в кращому випадку тимчасову ремісію (фальш норма), або доводиться усувати побічні дії та аверсивність, що виникають на їх фоні. Корекцію побічних дій нерідко доводиться проводити протягом усього курсу терапії і навіть довше. Враховуючи новизну модуляторної концепції, відсутність, як встановлено з рівня техніки, препаратів, здатних підтвердити всі її облігатні критерії, необхідно підкреслити наступне: - виразність модуляторної активності в залежності від дози не може порушувати облігатні критерії виявлення і оцінки того чи іншого співрозмірного впливу; - дивергентність ефектів залежно від дози (коли в одній дозі проявляється лише стимулююча, а в іншій - лише пригнічуюча дія) не є ознакою наявності співрозмірного впливу; - дивергентність ефектів за межами разових терапевтичних доз не може зменшувати переваг модуляторів; - не може являтися ознакою наявності співрозмірного впливу кількість виявлених ефектів, якщо вони не відповідають його облігатним критеріями; - ексфоліативність різних супутніх компонентів дії залежно від дози не може зменшувати переваг того або іншого модуляторного засобу, тому що в кожному випадку вони можуть бути не тільки індивідуальні, але і здатні проявлятися в тій чи іншій мірі залежно від дози. Для модуляції і модуляторів зі специфічним співрозмірним впливом не являються синонімами такі загальні поняття, як: моделювання (модель), модулюючий (модуль) і регуляторний вплив. Моделювання та модулюючий вплив присутні при виявленні та оцінці будь-якої провідної активності лікарського засобу (будь то стимулятори, що пригнічують засоби, модулятори, дивергенти), будь-яких супутніх ефектів і будь-яких побічних реакцій. Регулюючий (регуляторний) вплив закладено в саму філософію поняття лікарського засобу. Організм, функціональна система і будь-яка одинична клітина є сукупністю множин в цілому і жодне з їхніх множин не ізольовано від інших ні в конкретному модулі (наприклад - в певній області головного мозку) ні з/від конкретного модуля на інші модулі, ні в усьому організмі. Виявлення та оцінка модуляторної активності з співрозмірним впливом не вимагає застосування нових моделей дослідження, але вимагає нових підходів і методів, які в першу чергу полягають у дослідженні того (тих)/іншого (інших) показника (показників) на фоні їх початково високого і початково низького рівня при різних типах норми і різних типах розладу норми. Модуляція з співрозмірним впливом, порівняно з пригніченням, стимуляцією і дивергентністю універсальна, але її універсальність може бути обмежена еволюційною специфікою клітин і тканин організму і тоді вона не може мати юнімодуляторного (від лат. universalis - універсальний) статусу навіть при наявності промоутмодуляторного (від лат. promovere - просуваю і ut - як) типу дії. У таких випадках модуляторна активність не може характеризуватися без приставки або префікса, що вказує на рівень і від рівня функціонального, патогенетичного, органотропного і т.д. типу співрозмірного впливу. Вона має свої діапазони і межі впливу в рамках онтогенезу і гомеостазу, в рамках фенотипу і вікових особливостей в нормі і при розладах норми. Тому формантивний (від лат. Formans, formantis - утворює) і фермативний (від іт.fermata - невизначена тривалість паузи або дії) типи пластичності, сценарій розвитку організації, дезорганізації, деградації функціонального стану не еквівалентні і не постійні. З постнатального до фертильного віку фермативний тип організації в нормі спрямований на досягнення формантивного в фертильному періоді. У постфертильному періоді фермативний тип організації має аут напрямок. Ритмічність стимуляції і пригнічення, їх реципрокно асиметричні відносини і протиборство ніколи не перебувають у рівноважному і абсолютного спокою станах ні на одному з рівнів, ні між рівнями. Отже, принцип справжньої (співрозмірної) модуляції пов'язаний не тільки з тим, скільки механізмів дії включено в той чи інший стан, але і який балансовий підсумок цих взаємин в певному діапазоні ритму при певному стані або при переході в інший стан. Гомеостаз, як сталість середовища, постійний лише в тому, що він постійно суперечливий і постійно рухливий. Відкриття і розробка інноваційних модуляторів з співрозмірним впливом і дивергентів, виявлення цих видів активності у деяких відомих препаратах, що не вписуються в існуючі на даний момент рамки не обґрунтовано консервативної класифікації лікарських засобів, з часом будуть тільки розширюватися, поповнюючи і розширюючи їх систематизацію. Модуляторна концепція не передбачає, що кожна модуляторна речовина або комплекс речовин повинні володіти широким спектром промоутмодуляторного і тим більше юнімодуляторного типів дії. Для вирішення вузько специфічних завдань необхідні модулятори з співрозмірним впливом переважно на конкретні мішені. 3 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відкриття нових класів лікарських засобів явище найбільш рідкісне, ніж відкриття нових речовин у відомих класах і вдосконалення відомих продуктів і продукції, але кожне з цих напрямків самоцінне і самодостатнє за новизною, промисловою придатністю, застосованістю в різних областях медицини і суміжних дисциплінах. 1 Терміни та їх значення, що використовуються в даному винаході : дестрес* - дезорганізаційна стадія негативного стресу (Ds); стан організму з стійко гіперфункціональним, гіпофункціональним або змішаним типом, як наслідок дистресу; дивергенти* - (від лат. divergerens - розходження) новий клас лікарських засобів природного або синтетичного походження, стимулююча і пригнічуюча активність яких розходиться в залежності від дози; дистрес* - термін Г.Сельє, але зараз (ds) розуміється на відміну від трактування Г.Сельє, як гострий і субхронічний негативний стрес; імуномодулятори* - речовини або комплекси речовин природного і синтетичного походження, які виявляють співрозмірний вплив на рівні і від рівня імунної системи; інкретомодулятори* - речовини або комплекси речовин природного і синтетичного походження, які виявляють співрозмірний вплив на рівні і від рівня гормональної системи; негативний стрес* - стан, при якому порушена тренінг-стрес факторна сукупність систем і факторів організму з виникненням гострих, субхронічних або хронічних розладів; модулятори* - (від лат. modulatio - мірність, розмірність) новий клас лікарських засобів природного або синтетичного походження, які виявляють співрозмірний вплив на процеси і стимуляції, і пригнічення, і їх консолідоване сполучення, та їх реверсивність, а також речовини, що мають здатність до конформації і реверсивності; нейромодулятори* - речовини або комплекси речовин природного і синтетичного походження, які виявляють співрозмірний вплив на рівні і від рівня нервової системи; Сsмодулятори - рівня і від рівня центральної нервової системи та Аs-модулятори рівня і від рівня автономної або периферичної нервової системи; 1 Новітерміни або відомі з введенням нової або істотної зміни значення відзначені зірочкою. операндмодулятори* - (від англ. operand - аргумент до дії) речовини або комплекси речовин природного і синтетичного походження, які виявляють співрозмірний вплив на рівні і від рівня щодо статичних і динамічних генів і білків, а також речовини, здатні долати утворення домінантних форм атипового характеру; парафармацевтичні засоби - (від гр. pаra - біля, при, поза, перебування поруч) відносяться СБАД * (спеціальні біологічно активні добавки), БАД (біологічно активні добавки до їжі), загальнозміцнюючі, адаптогенні, деякі гомеопатичні засоби, гігієнічні, стоматологічні, косметичні і багато інших засобів лікувального, профілактичного та коригуючого призначення для людини, а так само засоби для тварин; промоутмодулятори* - (від лат. promovere - просуваю і ut - як) речовини або комплекси речовин природного і синтетичного походження, які виявляють співрозмірний комплексний вплив на різних рівнях прямо та/або опосередковано; псиоперандмодулятори (Ψ-операндмодулятори)* - теж саме, що і операндмодулятори, але на рівні і від рівня вищої нервової діяльності; психомодулятори (Ψ-модулятори)* - речовини або комплекси речовин природного і синтетичного походження, які виявляють співрозмірний вплив на рівні і від рівня вищої нервової діяльності; реювенаціона* активність - (від англ. rejuvenation - омолодження) - фармакологічна профілактика і корекція вікових змін, як зовнішнього прояву, так і функціонального і/або патогенетичного; вплив на середню і максимальну тривалість життя і його якість; CБАД* - спеціальні біологічно активні добавки, що містять у своєму складі лікарський засіб не більше разової дози або в розведенні його терапевтичних доз на певну разову, курсову або субкурсовую масу або обсяг парафармацевтичного засобу; не є добавкою до їжі, але можуть входити в харчову добавку для поліпшення її біологічних властивостей і характеристик і тоді БАД переходить у категорію СБАД навіть при тому, що вона пов'язана з харчовою добавкою; слендерна* активність - (від англ. slender - стрункий), фармакологічна корекція маси тіла без вираженого анорексигенного впливу; супровідні домішки для синтетичних продуктів - сукупність індивідуальних супровідних домішок (споріднені речовини діючого з'єднання - продукти синтезу і попередники) і залишкових кількостей органічних розчинників; співрозмірний* вплив - специфічна активність, яка вказує на характер дії; синонім істинної модуляції (модулятора, модуляторні активності), що відрізняється по суті від модулюючого впливу; залежність впливу від стану; 4 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стрес* - загальновживане як негативний вплив на організм, що не відображає об'єктивного розуміння стресу і в даному випадку - загальна характеристика, що включає як позитивний, так і негативний стан організму, за винятком фази виснаження. Фаза виснаження не може розглядатися в тріаді стресу, так як вона вже не стрес, а наслідок дезорганізаціоної фази негативного стресу; тренінг-стрес* (Ts) - нормальний біоритмічно функціональний стан організму в напрузі і спокої залежно від типу норми, що забезпечує його життєдіяльність; здатність до адаптації і адаптивної регуляції з переходом на інший, більш об'єктивний рівень функціональної та патогенетичної тимчасової або постійної організації; тренінг-стрес факторна* активність (Tsf-активність) - активність речовин при відмінності виразності та напрями їх ефектів на початково високому та початково низькому рівнях стану організму в умовах об'єктивної норми або з переходом на більш об'єктивно ефективний пластичний рівень організації; цитомодулятори* - речовини або комплекси речовин природного і синтетичного походження, які виявляють співрозмірний вплив на мембранному та/або внутрішньоклітковому рівнях, що характеризуються у тому числі і антиапоптозною активністю через прямий та/або опосередкований вплив; ексфоліативна* активність - (від лат. ехfoliatio - розшарування) фармакологічні ефекти, які розшаровуються на фоні провідної активності в залежності від дози; юнімодулятори* - (від лат. universalis - універсальний) речовини або комплекси речовин природного і синтетичного походження, які виявляють співрозмірний вплив, не обмежуючись тканино- і органоспецифічністю. Далі під модуляцією в описі і у формулі винаходу розуміється спів розмірний вплив і тоді, коли характер впливу тієї чи іншої специфічної модуляторні активності не вказується. Мета даного винаходу - розробка продукту, який наділений модуляторною активністю з співрозмірним впливом. Мета досягається отриманням хімічно чистого стабільного складу рацемічної сполуки (RS)-2- (2-оксо-4-фенілпіролідин-1-іл)ацетамід зі стабільними ознаками, виявленими вперше і суттєво поліпшеними відомими. Виявлені властивості і характеристики самого (RS)-2- (2-оксо-4-фенілпіролідин-1-іл)ацетамід в рамках даного винаходу повністю змінюють основоположні і найважливіші уявлення про нього, відкриваючи фактично заново дане з'єднання для біології та медицини, що підтверджено прикладами винаходу, представленими нижче. В результаті досягнутого, промислово придатного винахідницького рівня отримані продукт і його продукція, які не несуть в собі істотних недоліків (вад), властивих відомим складам з рівня техніки і безпосередньо стосуються N-карбамоілметіл-4-феніл-2-піролідон, а саме: 1) Істотним недоліком фонтурацетама (fonturacetamum, fonturacetam, fonturacetam) або rac2-[(4R)-2-oxo-4-phenylpirrolidin-1-yl]ацетамід з джерел інформації [40] і [41] є те, що він ноотропний агент, тобто психостимулятор з ноотропним компонентом дії (N06B і N06BX) і містить у своєму складі не два, а одну біологічно активну речовину. У таких випадках необхідно вказувати діючу речовину в ½ частини від складу речовин рацемату. Введення прецеденту виключення в історично сформовану хімічну групу "рацетами" (пірацетам, прамирацетам, оксирацетам, анірацетам, леветирацетам тощо) не тільки можливе, а й вводить в оману. Необхідно відзначити, що даний рацемат (похідні діапірролідину- діапірролідону, конкретно – фепірону) не є хімічним гомологом, аналогом або похідним пірацетаму (похідні піролідинупіролідону) і "рацетамів" ні за хімічною структурою, властивої рацетамам, ні за хімічним походженням. Виключення з правил підкреслює в даному випадку недоліки продукту. Недоліки, зазначені нижче, не усунені, а посилені. 2) Істотні недоліки фенілпірацетаму (карфедон) з US 2009/0306225 А1 (дата публікації 10 грудня 2009, пріоритет 21 квітня 2009) аналогічні таким фонтурацетаму і підкреслені не тільки ознакою INN-"рацетам" (Фенілпірацетам). У назву одного препарату (Фенілпірацетам) повністю введено назву іншого (пірацетам-INN)-мономера і саме психостимулятора, що не характеризується будь-якою іншою базовою активністю. Формула винаходу (пп. 1, 3) недостовірна щодо Фенілпірацетаму. В ній, на відміну від інших (мономерних рацетамів), вказано вміст за діючою речовиною, але не передбачено за масою рацемату, що повністю змінює співвідношення компонентів. Приклади, що підтверджують здатність "рацетамів" (всього 16) надавати опосередковану імуностимулюючу (модулюючу) активність через стимуляцію глутаматних рецепторів головного мозку при їх введенні в лабіринт середнього вуха, відсутні. Не відомо, наприклад і те, що - чи здатен леветирацетам метаболізуватися в лабіринті середнього вуха, так як його діючою речовиною, як відомо, є не 5 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 він сам, а його вторинний метаболіт, що характеризується протисудомною активністю, що діаметрально протилежно відносно стимуляції. 3) Істотним недоліком продукту Карфедон в описі EP 2013166 B1 (пріоритет від 16.03. 2006) і WO 2007/104780 А2 (дата публікації 20.07.2007 - заявник Олайнфарм, Латвія) є те, що склад Карфедону дестабілізований і являє собою рацемічну суміш, а не рацемічні з'єднання. У Карфедону виявлена тільки стимулююча активність (табл. 1 і 2). Яку активність буде проявляти суміш оптично чистих енантіомерів в інших випадках не відомо. Спосіб отримання суміші ізомерів (Карфедон) не зазначений, стабільність не визначена. Оптично чисті продукти (R)/(+)-Карфедон і (S)/(-)-Карфедон володіють яскраво вираженою однотипною дивергентною активністю (табл. 1, 2 і 3). При збільшенні дози стимулюючий ефект зникає і проявляється пригнічуючий. Аналгезуючий ефект (за методом гарячої пластини) розшаровується з пригнічуючим і проявляється на фоні їх стимулюючих доз, що характерно, наприклад, для інкретостимуляторів і в стані психоемоційного збудження при нанесенні в такому стані болю зовнішнім фізичним впливом. Під "модуляцією" традиційно розуміється в даному випадку стимуляція (модулюючий вплив) локомоторної активності (табл. 2 і п. 4 формули). Інше не вказане та інше не випливає з представлених прикладів дослідження. Співрозмірного впливу - істинної модуляції не виявлено. Присутні дивергентність та ексфоліативний ефект (по відношенню до пригнічуючої) вказують на відсутність модуляторні активності з співрозмірним впливом. Спеціально зазначено у висновках джерел, що: "Отримані результати підтверджують високу терапевтичну ефективність R-Карфедону, яка перевищує таку ж ефективність рацемічного Карфедону, оскільки фармацевтичні властивості останнього піддаються негативному впливу в результаті наявності S-Карфедону, який характеризується більш низькою активністю, а в деяких експериментах - значно слабкою активністю". Cпосіб синтезу ізомерів не має по суті відмінностей від раніше відомого для рацемату. Заявленим у формулі винаходу (п.7) способом синтезу неможливо отримати речовину і речовину з вказаними властивостями (пп. 1-6 формули), а спосіб отримання оптично чистих продуктів (колонна хроматографія) промислово не застосовується, що очевидно з опису винаходу. Температура плавлення вказана для одного ізомеру (107,5-108 °C), не зазначена для іншого і суміші рацематів, що слід розуміти в таких випадках, якщо не вказано іншого, ідентично. Температура плавлення повністю розходиться з раніше відомою для продуктів "Nкарбамоілметіл-4-феніл-2-піролідон (132 °C) з SU №797219, A61 K21/40 і хімічно чистим Карфедоном "Фармакопейним" (139-140 °C) з МУК 4.1.234-96 (Москва, 2000, дію продовжено в 2004), а й неправильна в свою чергу, що буде підтверджено нижче. 4) При тому, що препарат Ентропія-N-карбамоілметіл-4-феніл-2-піролідон (Олайнфарм, Латвія, N06В), відповідно до його зареєстрованої Інструкції на застосування, копіює всі ефекти і суттєві недоліки фенотропілу [31], він набуває додаткових недоліків. Препарат повністю втрачає вплив на фізичну працездатність, що є вкрай винятковим і негативним явищем для будь-якого лікарського засобу і тим більше для даного рацемату. Його стабільність в 1,7 рази нижче, ніж у фенотропілу і він дуже вимогливий до температури навколишнього середовища при зберіганні (не вище 15-25 °C). Враховуючи, що температурний режим зберігання як максимум не конкретизовано відповідно до вимог Фармакопеї, то це вказує на те, що поліморфізм продукту розвивається і в зазначеному діапазоні. 5) Недоліком продукту з SU №797219, A61 K21/40 - "N-карбамоілметіл- 4-феніл-2-піролідон, що володіє гіпотензивною активністю" (пріоритет від 08.05.1979, дата публікації 25.07.1995) є те, що саме заявлене в ньому з'єднання не може мати сукупно температуру плавлення 132 °C в поєднанні з ЛД50=831 мг/кг у мишей, так як вони повністю виключають один одного саме для даного з'єднання, що буде показано нижче. Винахід не отримав медичного і промислового застосування до теперішнього часу. Красномовна в описі професійна хімічна характеристика "Враховуючи, що дане з'єднання є продуктом конденсації пірацетаму та 4-фенілпірролідону2…" повністю виключає все раніше в ньому вказане [1] з урахуванням визначення і розуміння реакцій конденсації в органічній та фармацевтичній хімії. 6) Істотним недоліком продукції Карфедону "Фармакопейного" ("АСЛГ Дослідницькі лабораторії", гіпотензивний засіб) з МУК 4.1.234-96 (Москва, 2000, дію продовжено в 2004) є те, що заявлений у ній продукт (1-карбамоілметіл-4-фенілпірролідон-2) не може сам мати жовтий колір і мати температуру плавлення 130-140 °C. Розрахувати весь аналітичний ряд (від - як мінімум і до - як максимум) по кількісному вмісту (1-карбамоілметіл-4- фенілпірролідон-2) в продукції для фахівця не складає труднощів відповідно до нормативів Фармакопеї, якщо не вказане інше. 6 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7) Істотним недоліком композиції RU 2183117 C1-("АСЛГ Дослідницькі лабораторії" пріоритет від 03.11.2000), є те, що для досягнення бажаного ефекту у засобу з метою нормалізації артеріального тиску і лікування гіпертонічної хвороби (в 58 % випадках як максимум) потрібне курсове застосування N-карбамоілметіл-4-феніл-2-піролідон в надмірно високих дозах (750 мг на три добових прийоми, "але краще приймати одноразово"). Рекомендовані ефективні курсові дози складають 1000 мг 1-4 рази на добу, що перевищує відоме ЛД50 в кілька разів у тварин. Індекс безпеки не забезпечений, а інше не вказане. Найближчими аналогами продукції N-карбамоілметіл-4-феніл-2-піролідон є, судячи з нозологічної приналежності і дослідженнях з участю людини, сполука Карфедону "Фармакопейного" з МУК 4.1.234-96 (Москва, 2000) і сполука з SU № 797219, A61 K21/40, недоліки яких описані вище. 8) Істотним недоліком композиції з Патенту RU №2240783 С1 (пріоритет від 17.07.2003 року), що характеризується ноотропною активністю і способом її отримання, є те, що в складі міститься 0,5 % нехарактерної супровідної індивідуальної домішки, яка в повному сенсі стороння (2-піролідон) і, відповідно, сукупний вміст супровідних домішок як максимум збільшується в рази, які не ідентифіковані. 9) Істотним недоліком композиції Патенту RU №2327458 С1 (пріоритет від 19.02.2007 року), є те, що сполука в заявленій композиції нестабільна при зберіганні (таблиця визначення стабільності), вміст домішок збільшується, що непередбачувано за ефективністю, будь-яких нових властивостей не виявлено. Застосування надзвичайно обмежене за способом введення, неприйнятне для педіатрії внаслідок наявності етилового спирту. Токсичність продукції підвищується. 10) Істотним недоліком фармацевтичної композиції з RU 2414898 C1 (пріоритет від 18.09.2009), яка характеризується ноотропною активністю, є те, що при зниженні кількості діючого рацемату при зберіганні композиції, психостимулююча активність збільшується в порівнянні з розчином субстанції, а, отже, збільшується кількість не ідентифікованих домішок із стимулюючою активністю, які конкурують за місця зв'язування. Вилучити стимулюючий синергізм основного діючого складу і домішок немає підстав. 11) Істотним недоліком фармацевтичного композиції з WO2009/048352А1 (пріоритет від 12.10.2007) при високодисперсній мікронізації є адгезія молекул Н 2O молекулами рацемату, що спотворюють властивості субстанції, утворюючи стійку суспензію. До кожної молекули енанатіомеру досить міцно приєднуються молекули води, замикаючи їх по ацетамідній групі в замок, фармакологічна активність різко знижується, промислове застосування не доцільне. Істотним недоліком фармацевтичної сполуки у вигляді мікроінкапсульованих полікомпонентних частинок з N-карбамоїл-метил-4-феніл-2-піролідон (Патент RU 2391976 з пріоритетом від 18.10.2007 (Фармацевтична сполука у вигляді мікроінкапсульованих полікомпонентних частинок з N-карбамоїл-метил-4-феніл-2-піролідон і допоміжного нейтрального органічного низькомолекулярного компоненту і спосіб його микрокапсулювавння) є те, що маса субстанції збільшується за рахунок присутності додаткового компонента. Склад нестабільний, біологічні властивості погіршуються, промислове застосування не доцільне. 12) З рівня техніки найбільш широко відомим, що характеризується промисловим тм застосуванням, є препарат фенотропіл ® [31; 2-7; 9-21; 25; 26; 32-34]. Пряме відношення до нього, промислове та клінічне застосування мають винаходи: за патентом RU № 2050851 С1 "Речовина, що характеризується нооотропною активністю" з пріоритетом від 28.08.1990року; за патентом RU № 2232578 С1 з пріоритетом від 10.04.2003 та його зарубіжні аналоги (антидепресивна активність); за патентом RU №2329804С2 ("Речовина, що характеризується нейротропною- нейромодуляторною активністю" з пріоритетом від 28.03.2006 року) та його зарубіжних аналогів (лікування геморагічного та ішемічного інсульту - WO2007/111528). Зазначені винаходи не долають недоліків продукції фенотропілу [31], до яких відносяться: - обмеження застосування при позитивній і негативній симптоматиці психічних розладів, пов'язаних з психомоторним збудженням, маренням і галюцинаціями не тільки в період маніфестації, а й за наявності таких епізодів в анамнезі у зв'язку з можливістю їх провокації; - обмеження застосування при важких формах артеріальної гіпертонії; - імуностимулююча і інкретостимулююча дії апріорно являються протипоказанням при гіперстанах імунної та ендокринної систем; - анорексигенна активність апріорно являється протипоказанням для застосування у хворих на анорексію; - дивергентність базової активності; - ексфоліативні ознаки та інші супутні компоненти дії не в змозі забезпечити модуляторну активність з співрозмірним впливом; 7 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - ноотропна активність носить характер прямої стимуляції, оскільки інше не виявлене; - істинної модуляторної активності (співрозмірного впливу) не виявлено. Недоліком продукції фенотропілу є також обмеження застосування максимальної добової дози (750 мг) за терапевтичним індексом (відношення максимальної добової дози до ЛД 50=800 мг/кг у тварин) в екстрених клінічних випадках з урахуванням фармакокінетики (В.І.Ахапкін, А.С.Берлянд, 2002; В.І.Ахапкін, С.Н.Потругалов, 2002). В екстрених випадках найчастіше потрібна постійна підтримка високих доз протягом декількох діб або навіть тижнів. З'єднання виводиться з організму в нормі і при високих фізичних навантаженнях протягом 72 годин. Даний факт обмежує застосування високих доз в клініці, так як відомо, що при зниженні метаболізму фармакокінетика препаратів може істотно змінюватись. З одного боку екстрені випадки вимагають збільшення доз, а з іншого і у зв'язку з уповільненням або зниженням діяльності бар'єрних і видільних функцій цьому перешкоджають, тому терапевтичний індекс повинен забезпечувати безпеку будь-якого лікарського засобу. За матеріалами роботи Ю.Ю.Фірстової [33], присвяченій фактично геронтології, судячи по масі тіла тварин (миші 30-35 г), можна говорити про відсутність в препараті фенотропіл впливу на тривалість життя у старих тварин і про відсутність у нього мнемотропної активності, а ноотропна активність характеризується стимуляцією. Показано, що фенотропіл не впливає на експресію фактору росту і диференціювання - BDNF в корі головного мозку, а у низько ефективної групи тварин проглядається за цим показником негативний напрямок впливу. Під "модуляцією" (назва роботи) автор розуміє модулюючий вплив (опис роботи та висновки), тобто стимуляція досліджених показників механізмів дії. Фенотропіл у низько і високо ефективних тварин викликає однотипний стимулюючий вплив на NMDA рецептори з різним ступенем виразності. Процеси старіння відносяться до глобальних змін в організмі, які провокують наростання нейрогуморальних розладів в аут напрямку з накопиченням атипових домінантних форм і вирішити їх за допомогою функціональних засобів неможливо. Було відкрито (пріоритет - січень 2006, подано для публікації в 2005 році), що рацемічна сполука N-карбамоілметіл-4-феніл-2-піролідон або з будь-якою іншою достовірною хімічною назвою, отримана в продукції описаним способом синтезу, в кристалічному (твердому) стані являє собою рацемічні з'єднання [34]. Поняття рацемічна суміш і рацемічні з'єднання в органічній хімії не еквівалентні. Результати дослідження рентгеноструктурного аналізу сполуки депоновані в Кембриджському банку структурних даних (Cambridge Structural Database System, "QELNEB", 2007) з посиланням на джерело інформації [34]. Недоліком способу отримання є: нестабільний вихід з'єднання в технічній сировині при синтезі, що становить 50-70 %, склад і кількісний вміст домішок не встановлені і не ідентифіковані; будь-яких інших, невідомих властивостей і характеристик не виявлено, препарат характеризується як ноотропний засіб. Отримати хімічно чистий і стабільний склад синтезом і азеотропною відгонкою води неможливо. Зазначені вище недоліки не ідентифіковані і не усунені. Очевидні недоліки продуктів та їх продукції з рівня техніки, суперечливість їх властивостей і характеристик вказують на складність отримання і відтворення стабільних складів препарату. Цих недоліків позбавлений розроблений продукт і його продукція в рамках даного винаходу. Способи їх промислового отримання прості, істотно знижують витрати на дорогі реагенти. Розкриття винаходу Приклади 1. Спосіб отримання з'єднання і його високо хімічно чистих стабільних фармацевтичних сполук, виявлення їх характеристик. Синтез та отримання цільової технічної сировини проводили розробленим однореакторним способом термодинамічного еквімолярного диспропорціювання з рацемічної суміші 4(R, S)феніілпірролідін-2-он (фепірон, отриманого циклізацією лінійного фенілпохідного попередника) в лужному середовищі з наступним додаванням ацетамід похідного без застосування каталізаторів, ДМСО або металевого натрію. Вихід з'єднання у складі сировини становить не менше 75 %. Очищення, кристалізацію і стабілізацію проводили наступним способом: після охолодження технічний склад обробляється демінералізованою (дистильованою) водою, відстоюється, відділяється рідка фракція і проводиться ізотермічна кристалізація з пропанолу. Сушать при температурі 40-70 °C до отримання постійної маси з вмістом цільового складу з'єднання не менше 99,0 % в перерахунку на суху речовину і температурою плавлення в діапазоні від 130 до 133 °C (порівняння капілярного і дериватографічного методів визначення) або - як мінімум від 128 °C (зазвичай у такому випадку початок плавлення порошку - від 129 °C) при вмісті діючого з'єднання менше 99,0 % (але не менше 98,0 %), але тоді вміст домішок і втрата в масі при висушуванні в процесі виготовлення препаративних композиційних форм будуть вище, так як супровідні домішки більш гігроскопічні, ніж фенотропіл, а деякі з них досить реакційні. 8 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Температура плавлення від початкової до кінцевої точки, що виходить за певні вище межі безпосередньо вказує на те, що у складі порошку субстанції присутній великий кількісний вміст домішок або склад спотворений і тоді він вже не є даним з'єднанням. Графіки температури плавлення рацемічних з'єднань і рацемічних сумішей також мають характерологічні відмінності. Для порівняльних досліджень одержували з'єднання з вмістом не менше 99,8 % (100±0,2) методом хроматографічного розділення з домішками, подальшою кристалізацією і стабілізацією кристалічного стану. Отримані сполуки є стабільними. Дослідження проводилися відповідно до нормативних вимог визначенняпри зберіганні в природних умовах (у сухому, захищеному від світла місці, при температурі не вище 30 °C) і стандартним методом прискореного старіння. Фармацевтичні сполуки з вмістом не менше 99,0 % діючого з'єднання в перерахунку на суху речовину стабільні не менше п'яти років (втрата в масі при висушуванні не досягала рівня 0,5 % при тривалому зберіганні в природних умовах), а з вмістом менше 99,0 % - не менше трьох років. Сам стабільний продукт при зберіганні не розкладається і не вступає в реакції. Методи аналітичного аналізу представлені в таблиці 1. Точне кількісне визначення проводили розробленим титриметричним методом (ТМТ): 0,2 г (точна наважка) субстанції 2-(2оксо-4-фенілпірролідін-1-іл)ацетамід поміщають в колбу К'ельдаля, додають 20мл 0,1 М розчину хлористоводневої кислоти. Колбу приєднують до приладу для визначення азоту (ГФ XII, ч. 1, с. 101) і починають відгонку. Після встановлення стаціонарного режиму відгону в колбу повільно додають 40мл 30 % розчину натрію гідроксиду, стежачи за тим, щоб розчин в колбі енергійно перемішувався струмом пару. Збирають 200мл відгону в приймач з 20мл 4 % розчину борної кислоти і 0,1мл розчину змішаного індикатору. Відгін титрують 0,1М розчином хлористоводневої кислоти до червоно-фіолетового забарвлення. Проводять контрольний дослід. Помилка відтворення для результату окремого кількісного визначення ТМТ методом складає ~ 0,2 % відносних до розчину стандартного зразка (РСО). Величина систематичної помилки статистично достовірно не відрізняється від 0 відносно контрольного досліду. Встановлено, що 1мл 0,1М розчину HCl відповідає 0,021826г або 21,826мг (21,83 мг) C 12H14N2O2 (Фенотропілу). ТМТ метод є найбільш точним (стандартна помилка не більше 5 %) в порівнянні з будьякими хроматографічними, включаючи тонкошарову хроматографію, ВЕРХ та НВЕРХ (стандартна помилка яких досягає 20 %). Індивідуальні домішки і їх кількісний вміст визначали методом ВЕРХ (високоефективна рідинна хроматографія) або НВЕРХ (надвисокоефективна рідинна хроматографія). Зіставлення результатів ТМТ і ВЕРХ забезпечує об'єктивну інформацію щодо кількісного вмісту діючого з'єднання, супровідних індивідуальних домішок і їх співвідношення. За даними ЯМР і масспектрального аналізу встановлено, що сліди індивідуальних домішок присутні в цільовій продукції, але їх кількісний вміст вдалося привести до стану, коли вони вже нездатні вплинути на властивості і характеристики цільового з'єднання. Мас-спектр позитивних іонів представлений (Фіг. 1) на прикладі одного із зразків. Індивідуальні домішки ідентифіковані, їх кількісний вміст в одному із зразків представлено в табл. 1.1. Перелік індивідуальних домішок залежить від способу синтезу. ІЧ-спектри рацемічної суміші і рацемічної сполуки мають характерні відмінності. Аналітичний аналіз сполук з менше 99,0 % вмістом діючого з'єднання в перерахунку на суху речовину і вмістом супровідних індивідуальних домішок більше 0,2 % вимагає деталізації складу домішок і їх поіменного кількісного визначення в технічній документації засобу. Номенклатура домішок в даному випадку незмінна, але їх кількісний склад може варіювати по кожній позиції в отриманих партіях серій. При зміні способу синтезу номенклатура індивідуальних супровідних домішок змінюється, але їх кількісний вміст в сукупності повинен відповідати встановленому. Присутність одиничної індивідуальної домішки бути радше винятком, ніж правилом, тому визначення одиничної передбачуваної домішки методом тонкошарової хроматографії здатне вводити в оману. При використанні в способі синтезу цільової сировини димеру 4-фенілпірролідін-2-он, отриманого із застосуванням нітрометану, необхідним буде проведення досліджень на відсутність ціанідів у хімічному складі вихідної і цільової продукції. Присутність навіть слідів ціанідів у низці неідентифікованих домішок непередбачувано за наслідками на організм при курсовому застосуванні лікарських і парафармацевтических засобів. Способи очищення, кристалізації і стабілізації сполук в таких випадках можуть виявитися набагато витратнішими, ніж сам синтез. При синтезі субстанції фенотропілу ніколи не використовувався і не використовується на сьогодні вихідний продукт, отриманий із застосуванням нітрометану за винятком зразків для порівняльного вивчення. При досягненні необхідної чистоти субстанції 9 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 перелік супровідних домішок у відсутності високотоксичних і отруйних речовин вже не має, як встановлено, ніякого значення для фізико-хімічних, органолептичних властивостей, а також і для біологічних, як буде показано нижче. Діапазон температури плавлення кожного окремого висушеного зразка (від і до) завжди о складає менше С (0,2-0,9 °C) при капілярному і дериватографічному методах визначення. Статистична достовірність показників висока (більше 120 вимірювань різних зразків). Залежно від характеристик сполуки можна розподілити таким чином: Сполука 1: Не менше 99,0 % і не більше 100,5 % в (RS)-2-(2-оксо-4-фенілпірролідін-1-іл)ацетамід перерахунку на суху речовину Індивідуальні домішки одинично або в сумі Не більше 0,2 % Залишкові кількості органічних розчинників Не більше 0,3 % (не більш 3000 ррm) Важкі метали Не більше 0,001 % Сульфатна зола Не більше 0,1 Втрата в масі при висушуванні Не більше 0,1 % Сполука 2: Не менш 99,0 % і не більше 100,5 % в (RS)-2-(2-оксо-4-фенілпірролідін-1-іл)ацетамід перерахунку на суху речовину Індивідуальні домішки одинично або в сумі Не більше 0,25 % Залишкові кількості органічних розчинників Не більше 0,3 % (не більше 3000 ррm) Важкі метали Не більше 0,001 % Сульфатна зола Не більше 0,1 Втрата в масі при висушуванні Не більше 0,1 % Сполука 3: (RS)-2-(2-оксо-4-фенілпірролідін-1-іл)ацетамід Не менше 99,8 % і не більше 100,2 % Втрата в масі при висушуванні Не більше 0,02 % Сполука 4: Не менше 98,0 % і не більше 100,5 % в (RS)-2-(2-оксо-4-фенілпірролідін-1-іл)ацетамід перерахунку на суху речовину Індивідуальні домішки одинично або в сумі Не більше 0,5 % Залишкові кількості органічнихрозчинників Не більше 0,5 % (не більше 5000ррm) Важкі метали Не більше 0,001 % Сульфатна зола Не більше 0,1 % Втрата в масі при висушуванні Не більше 0,5 % Мікробіологічна чистота і/або апірогенність відповідали вимогам Фармакопеї. Отримання біологічно чистих субстанцій відповідно вимогам Фармакопеї не вимагає застосування особливих способів. Стабільні сполуки легко витримують більш високі рівні температурної обробки, так як сублімація і розкладання продукту відбуваються при набагато більш високих температурах, ніж необхідні при стерилізації. Поліморфізм при зберіганні не виявлено. Поліморфізм спостерігався в зразках Сполуки 4 з вмістом менше 99,0 % діючого з'єднання на кордоні 3-х років і вище, який легко усувався просівом і сушінням зразків з певною часткою втрати маси. Рентгеноструктурний аналіз кристалічного порошку всіх сполук, включаючи дослідження при зберіганні, підтвердив характер діючого з'єднання як рацемічної сполуки, що схематично в розгорнутому стані представлено на малюнку 2. Рацемічні з'єднання кожної пари комплексону хіральних молекул має форму скручених стрічок, орієнтованих уздовж великої діагоналі центральної осі елементарної комірки. Провідні міжмолекулярні зв'язки між атомами Н-О (10) і Н-О (10') характеризуються як середні за силою. Таким чином, представлені результати досліджень показують, що отримані інноваційні хімічні Сполуки зі стабільними параметрами температури плавлення і збереженням всіх встановлених фізико-хімічних і структурних показників при тривалому зберіганні, виключаючи негативний і маскуючи вплив супровідних домішок, а також спотворення кристалічної структури сполуки. Хімічні сполуки з'єднання, що містить у співвідношенні 50:50 в рацемічному з'єднанні 2оксо-4(R)-феніл-1-піролідинілацетамід та 2-оксо-4(S)-феніл-1-піролідинілацетамід стабільні, не містять домішок, здатних яким-небудь чином істотно маскувати або чинити негативний вплив на характеристики (RS)-2-(2-оксо-4-фенілпірролідін-1-іл)ацетамід. Кристалічний порошок субстанцій фенотропілу не леткий, має білий, рідше білий зі злегка жовтуватим або злегка кремуватим відтінком колір, гіркуватого смаку (гіркий смак після розсмоктування в роті досить швидко зникає, не залишаючи неприємних відчуттів). У продукції гіркуватий смак зберігається. Сполуки мало розчиняються у воді і фізіологічному розчині, 10 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 помірно розчинні у 96,0 % спирті і хлороформі. Добре розчиняються у воді і фізіологічному розчині при нагріванні, але розчини нестабільні при охолодженні і зберіганні в звичайних умовах (не більше 2-х годин, що прийнятно для екстемпоральних препаратів та проведення досліджень), помірно розчиняються в 5,0 % розчині глюкози, добре розчиняються у присутності солюбілізатор і емульгаторів. Твін80 і циклодекстрини збільшують розчинність у воді, особливо Твін80, а циклодекстрини мають обмеження по концентрації. Стерильні 0,001-3 % розчини фенотропілу в присутності циклодекстрину або Твіну (вода для ін'єкцій, Фенотропіл, циклодекстрин (або розчин Твіну) ретельно перемішують протягом 30 хвилин, фільтрують, розливають в ампули з нейтрального скла, запаюють ампули і піддають стерилізації протягом 15 хвилин при температурі 120 °C). Стерильні розчини стабільні при зберіганні не менше 12 місяців. Остаточний термін придатності не визначений, зразки знаходяться на зберіганні. Ліпофільні властивості з'єднання виражені в набагато більшому ступені, ніж гідрофільні, що необхідно враховувати при розробці регламенту різних сполук препаративних форм. Встановлено, що в присутності допоміжних речовин сполука в терапевтично необхідній концентрації не схильна до кількісної зміни діючого з'єднання при зберіганні, на відміну від використання для цих цілей кислот і спиртів. Стабільність розчинів достатня. Приготування інших лікарських форм технологічно прості і не вимагають застосування складних сполук допоміжних речовин і носіїв. Отримані результати дослідження переконливо показують, що в даному винаході отримані вперше в чистому вигляді саме стабільне з'єднання (RS)-2-(2-оксо-4-фенілпірролідін-1іл)ацетамід, а також його хімічні сполуки фармацевтичних субстанцій, які повністю відповідають за фізико-хімічними та органолептичними характеристиками найчистішій сполуці з'єднання або наближені до неї настільки, що не тільки не перекручують, але й не маскують яким-небудь чином істотно її фізико-хімічні та органолептичні властивості і характеристики. Способи їх отримання, кількісного визначення та визначення автентичності з'єднання і супровідних домішок відносно прості і достовірні. Спосіб отримання прийнятних фармацевтичних та парафармацевтичних сполук на основі або з включенням (RS)-2-(2-оксо-4-фенілпірролідін-1-іл)ацетамід різних препаративних форм для внутрішнього і зовнішнього застосування відрізняється тим, що після просіву порошку субстанції через сито його додатково сушать (якщо він характеризується як Сполуки 2 і 4) до отримання постійної маси, що відповідає як мінімум Сполуці 1. Розраховують необхідну кількість маси порошку фармацевтичної субстанції в перерахунку на абсолютно діюче з'єднання, виходячи з фактичного в ній відсоткового вмісту 2-(2-оксо-4-фенілпірролідін-1іл)ацетамід і приступають до постадійної процедури отримання прийнятних сполук відповідно до промислового регламенту або аптечної технології з використанням відомих і прийнятних допоміжних речовин і носіїв, дозволених до застосування. Особливістю субстанції є розчинність, переважно ліпофільних властивостей, прагнення до компліментарності, здатність молекул до конформації. Досягнення хорошої розчинності у воді і фізіологічному розчині при нагріванні не вимагає високих температур. Виходячи з нашого досвіду, зазвичай в перерахунку на масу порошку достатньо взяти додатково не більше 1,01 %. Для даного продукту виробничі втрати мінімальні. При виготовленні будь-яких твердих, м'яких форм і пластирів, а так само пластин, вони не перевищують 0,2 % (основні втрати становлять при вивантаженні субстанції з пакувальної тари), а при виготовленні рідких форм і аерозолів не більше 1,0 %. На основі або з включенням (RS)-2-(2-оксо-4-фенілпірролідін-1-іл)ацетамід можна отримати такі композиції: Фармацевтичні та парафармацевтичні композиції для внутрішнього застосування, характеризуються на 100 % маси, масо- об'єму, об'єму в наступному співвідношенні компонентів: (RS)-2-(2-оксо-4-фенілпірролідін-1-іл)ацетамід 0,01 – 75 Інше одинично або в сумі 99,99-25 Фармацевтичні та парафармацевтичні композиції для зовнішнього застосування, характеризуються на 100 % маси, масо-об'єму, об'єму в наступному співвідношенні компонентів: (RS)-2-(2-оксо-4-фенілпірролідін-1-іл)ацетамід 0,001 – 90 Інше одинично або в сумі 99,999 – 10 До "іншого" можуть входити як допоміжні речовини і носії або цільові добавки, дозволені до застосування, так і додаткові, дозволені до застосування біологічно активні компоненти. За своїми стабільними властивостями фармацевтична Сполука 1 придатна для виготовлення композицій не тільки промислово, але і в аптечних умовах. 11 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Проведені вперше рентгеноструктурні, електроноструктурні, електронографічні дослідження (RS)-2-(2-оксо-4-фенілпірролідін-1-іл)ацетамід в різних середовищах існування показали, що залежно від середовища проживання і зміни стану середовища проживання (температура, РН, щільність, електролітний склад, електропровідність, електромагнітне поле та ін.) енантіомерні молекули з'єднання мають здатність до утворення різних конформацій і конформерів, як розділених в конверті (об'ємі) конформаційних молекул (додатково знайдено чотири, шість, і вісім, але не виключено, що може бути і більше), так і різних пакетних (касет) комплексонів в конверті. Комплексони більше двох молекул мають різні форми. Приклад деяких варіантів обертання в газовому середовищі (газова електронографія) за двома варіантами ядра (асиметричний атом вуглецю в положенні 4 ядра структурної формули) енантіомерних молекул з'єднання і за двома варіантами шестичленного циклу (Рh) функціональної групи представлений на малюнку 3. Прогностичну кількість, варіант потенційних функцій обертання і стереоспецифичну поведінку хіральних молекул передбачити з усією очевидністю або визначеністю залежно від зміни стану середовища існування неможливо. Для цього необхідні більш поглиблені дослідження, які по суті вже нічого змінити не можуть, але можуть деталізувати поведінку молекул в різних органах та тканинах залежно від їх стану. Це найважливіше відкриття для даного з'єднання вказує на те, що судити про його властивості та характеристики навіть з позицій вихідної оптичної активності чистих енантіомерних речовин неможливо, так як виключати ймовірність їх переходу один в одного немає причин у зв'язку з виявленими обставинами. Молекули рацемічного з'єднаняя мають досить високий ступінь компліментарності при переході з газового або рідкого середовища в кристалічний стан. Насиченість складів молекулами інших речовин і диспропорціонування здатні приводити до спотворення комплексонів. Інші речовини, присутні у сполуках здатні конкурувати і спотворювати молекули у сполуках, а також конкурувати за місця зв'язування в організмі. Прагнення молекул до компліментарності є причиною прагнення оптично чистих ізомерних композицій до рацемізації, яка починається досить стрімко. Ці властивості необхідно враховувати при отриманні оптично чистих ізомерів. Фармакологічні дослідження Сполук та композицій, статистична обробка отриманих результатів дослідження проведені на стандартних, відомих моделях і методах відповідно до лабораторної та клініко-фізіологічної плацебо контрольованої практикою, "Керівництвом з експериментального (доклінічного) вивчення нових фармакологічних речовин" (Москва, "Ремедіум", 2000), облігатними критеріями виявлення та оцінки модуляторної активності як співрозмірного впливу. У викладених моделях і методах фармакологічних досліджень представлених нижче прикладів, якщо не вказане інше, необхідно розуміти, що вони загальновідомі для фахівців. Відсутність вказівки порядкового номеру Сполуки в прикладах дослідження відповідає Сполуці 1 тм для препарату Фенотропіл ® . Кількість біологічних об'єктів в групах, якщо не вказане інше, становило не менше 10, в контрольних групах застосовувалися плацебо, стандартні розчинники (дистильована вода або фізіологічний розчин) і композиції з іншими носіями і допоміжними речовинами. Маса тіла, стать, вік тварин, якщо не вказане інше, відповідає безпородним білим щурам або мишам самцям стандартного статевозрілого віку за масою тіла. Співвідношення при вибірці субпопуляцій (високоефективних - ВЕФ і низькоефективних - НЕФ) в популяціях тварин становило 2:1 відповідно при допустимій помилці тестування не більше ± 10,0 %. Приготування дозованих композиційних форм проводилося з урахуванням виявлених фізико-хімічних властивостей досліджуваного з'єднання і його фармацевтичних сполук. Приклади 2: У таблицях 2, 2.1 і 2.2 представлені результати дослідження гострої токсичності складу з вмістом діючої сполуки як мінімум в безпородних білих мишей самців (18-24 г) і безпородних білих щурят 30-35 денного віку обох статей при одноразовому введенні. Розрахунок токсичних доз проводився за методом Літчфільда і Уілкоксона. Спостереження проводилися протягом 24 годин і 14 діб після одноразового введення. При внутрішньочеревному введенні (табл. 2) дорослим мишам ЛД 50 відповідало: у Сполук 2 і 1-1001 (959,1-1042,9) мг/кг і 1042 (982,9-1102,0) відповідно, у Сполуки 3-1050 (984,6-1115,3), у Сполуки 4-904 (857,3-950,4мг/кг). При внутрішньочеревному введенні Сполуки 1 у щурят (табл. 2.1) ЛД50=1029,5мг/кг (940-1119,0). ЛД50 у щурят при інтрагастральному введенні не виявлено. Введення щурятам інтрагастральний доз більше 1000мг/кг технічно неможливо через малий об'єм шлунка (табл. 2.2). 12 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Отримані результати показують, що без негативного і маскуючого впливу супровідних домішок токсичні дози з'єднання істотно вище, ніж це було раніше відомо по всіх позиціях. Самі енантіомерні молекули з'єднання без впливу супровідних домішок мають низьку токсичність. Отримані хімічні сполуки дозволяють вирішити питання з терапевтичним індексом, збільшивши безпеку застосування високих добових доз препарату як мінімум на 25 % з урахуванням досліджень у дорослих тварин і у 30-35 денних щурят. Найбільш наближеним до Сполуки 3 і за даним показником є Сполука 1. Встановлювати стандартний показник ЛД 50 вище 1000 мг/кг не доцільно, так як він встановлюється для фармацевтичних субстанцій з вмістом діючої речовини (в даному випадку синтетичного комплексу діючих речовин) по категорії як мінімум і при кількісному вмісті супровідних домішок як максимум. З урахуванням того, що Сполуки 2 і 4 технологічно нескладно (просівши та сушка) доводяться до стану Сполуки 1, вони прийнятні для виробництва дозованих форм з включенням стадії відповідної підготовки та доведення до необхідних характеристик за кількісним вмістом діючого з'єднання і супровідних домішок. Стабільність Сполук 2 і 4 достатня для їх транспортування та зберігання, а також для отримання з них при використанні нескладної підготовки Сполуки 1. Стабільні хімічні сполуки від- як мінімум до- як максимум не схильні до деструктивних змін і диспропозиціювання при встановлених термінах і умовах зберігання. Індивідуальні домішки здатні конкурувати за місця зв'язування в організмі. Вони легко проходять через гематоенцефалічний бар'єр. Істотну роль грають пропорціональність індивідуальних домішок і залишкових кількостей органічних розчинників, режим кристалізації і стабілізації. Сполука 1 найбільшою мірою наближена за властивостями і характеристиками до Сполуки 3, промислове досягнення отриманого технічного результату не представляє складності, тому подальші біологічні дослідження в основному проведені зі Сполуками 1 і 3. Приклади 3: (RS)-2-(2-оксо-4-фенілпірролідін-1-іл)ацетамід характеризується психомодуляторною активністю з співрозмірним впливом на рухову активність щурят. Ефект проявляється співрозмірно в залежності від вихідного стану у генетично ВЕФ і НЕФ білих безпородних щурят 30-35 денного віку (90-110г) обох статей за тестом рухової активності (табл. 3). Показано, що в досліджених дозах (5 і 10 мг/кг інтрагастрально) він проявляє діаметрально протилежну спрямованість психотропного ефекту і його різну вираженість при одноразовому введенні. У групі ВЕФ рухова активність на фоні фенотропілу знижувалася за сумарним показником залежно від дози на -12 % та -4,23 % порівняно контролем (дистильована вода), а в групі НЕФ цей показник збільшувався на +72 % та +67 % в дозах 5 і 10 мг/кг відповідно до порівняння з групою контролю. На моделі хрестоподібного лабіринту (Salimov et al., 1995) у мишей самців лінії 1CR (18-22 г) досліджували орієнтовно дослідницьку поведінку Фенотропілу (100мг/кг) - Сполука 1 в незнайомих обстановочних умовах порівняно зі Сполукою 4 (100 мг/кг), Пірацетамом (200 мг/кг) і групою контролю (дистильована вода) при внутрішньочеревному субхронічному введенні (5 діб) один раз на добу. Тварини тестувалися до введення препаратів і через добу після останнього введення. Додатково розраховували показник Kt (коефіцієнт критичної трансмісії відношення взаємозалежності чисельника одного показника одинично або в сумі до знаменника іншого одинично або в сумі в порівнянні з контролем в арифметичному або інтегральному вираженні). Kt (табл. 3.1) в групі НЕФ практично в два рази вище, ніж у групі ВЕФ, а також на 50 % вище ніж у нормоконтролі популяції. Норма Kt для різних досліджуваних ефектів має індивідуальні числові висловлювання при арифметичному або інтегральному розрахунку. Можна зробити висновок, що саме тригерна трансмісія, реверсивність і контраверсивність конформацій самих молекул Фенотропілу не допускає розвитку неврозоподібного ефекту, який проявлявся на фоні психостимулятора Пірацетаму з фермативним типом дії, за співвідношенням кількості обстежень відсіків і кількістю патрулювань в обох групах. Психомодуляторна активність Сполуки 1 співрозмірна і більш виражена, ніж у Сполуці 4. При системному застосуванні ефекти Сполуки 1 практично зрівняли показники тригерної трансмісії груп НЕФ з ВЕФ, перевівши їх на об'єктивно більш пластичний функціональний стан, як у НЕФ, так і у ВЕФ тварин. Ймовірно більш "жорстка" консолідація функціональних і структурних взаємовідносин у ВЕФ не є виключно позитивною властивістю для пластичної організації, як і високолабільна у НЕФ. Інкретомодуляторна активність з'єднання виявлена при калібруванні біологічно чутливих доз засобу у Сполуці 1 фенотропілу при введенні щурам самцям (масою 210-230 г) ліній Серпень (генетично низько стійкі до негативного стресу - Ns) і Вістар (генетично високо стійкі до Ns) в діапазоні доз 0,5-750,0 мг/кг. Визначали дози, що надають достовірний вплив на рівень кортизолу в плазмі крові щурів і обчислювали середній для них показник. Контрольним 13 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тваринам вводилася дистильована вода. Забір крові після декапітації для біохімічних досліджень кортизолу в плазмі крові виробляли через 60хв (біля кожних 5 щурів в групах) і через 3 години (у кожних 5-ти щурів в групах) після введення препаратів. Дослідження плазми крові проведені хроматографічним методом (Schwarz, А., Roberts, WL, Pasguali, M. Analysis of plasma amino acids by HPLC withphotodiode array and fluorescence detection // Clinica Chimica Acta.-2004.-V.312.-P.253-262). Усереднені по групах результати дослідження представлені в таблиці 3.2. Біологічно активна доза сполуки виявлялася достовірно, починаючи з 1,0 мг/кг. Tsf активність, з урахуванням відомої ролі кортизолу для організму, (RS)-2-(2-оксо-4фенілпірролідін-1-іл)ацетамід виявлялася співрозмірно вираженим ефектом по кортизолу і склала в групі лінії Серпень +14,1 %, а у Вістар - +2,0 % через годину після введення препарату. Через три години інкретомодуляторна активність препарату проявилася з діаметрально протилежними знаками впливу. У групі Вістар (-7,6 %), при тому, що в групі Серпень цей показник склав + 6,8 %. При одноразовому введенні коефіцієнт модуляції був більш виражений у Серпень. Якщо в контролі він становив 1,13, то на фоні сполуки - рівно 1,0 (-11,5 % порівняно з контролем), тобто реорганізувався функціональний стан до норми, що перевищує навіть показник Вістар. У Вістар в контролі він становив 0,9 і 0,88 - на фоні сполуки. Коефіцієнт модуляції (km) - чисельник різниці показників у досліджуваній групі після застосування препарату і до застосування поділений на знаменник - корінь квадратний із суми квадратів різниці чисельника і різниці значень в контрольній групі після застосування і до застосування плацебо, з визначенням впливу речовин на балансову вартість взаємовідношень і взаємозалежностей цих показників. Чим вище рівень модуляторної активності, тим більшою мірою km наближається до норми і тим більшою мірою прагне до одиниці або дорівнює одиниці (1,0). З'єднання характеризується модуляторною активністю з співрозмірним впливом у всіх досліджених дозах на всіх досліджених моделях. Це вказує на те, що специфічна модуляторна активність є провідною у даного з'єднання і залежить не стільки від дози, скільки від вихідного стану. Це відкриває абсолютно нові перспективи для Фенотропілу і показує, що він є істинним модулятором. Психомодуляторна і інкретомодуляторна активність поєднується з тренінг-стресфакторною, яка також проявляється співрозмірно в залежності від вихідного стану організму. Отже, можна припустити, що адаптогенна активність Фенотропілу має відмінні ознаки і від лише стимулюючих, і від лише пригнічуючих препаратів в стрес-негативних умовах, що відкриває нові можливості і з адаптивної регуляції за допомогою інноваційних фармакологічних засобів. Приклади 4: Виявлена унікальна нейролептична (антипсихотична) активність (RS)-2- (2-оксо-4фенілпіролідин-1-іл)ацетамід, яка у нього не залежить від природи психічного розладу. Дослідження проведені на білих безпородних мишах самцях (18-24 г) в порівнянні з Оланзапіном (зипрексу) при внутрішньочеревному введенні. На моделі позитивної симптоматики шизофренії, пов'язаної з гіперактивацією дофамінових систем, що дозволяє виявляти здатність речовин блокувати дофамінергічну передачу в мезолімбічній системі мозку, Фенотропіл (100, 200 і 300 мг/кг) зменшував інтенсивність вертикалізації в балах (табл. 4), викликану апоморфіном (2 мг/кг підшкірно) на 45 %, в 2,0 і 2,6 рази відповідно. Оланзапін істотно поступався за активністю Фенотропілу в тесті апоморфінової вертикалізації. На його фоні спостерігалося зменшення інтенсивності вертикалізації тільки на 26 % в дозі 1мг/кг і на 66,5 % в дозі 10 мг/кг. На моделі негативної симптоматики шизофренії (табл. 4.1), пов'язаної з гіперактивацією серотонинергиченої системи (викликаної 5-оксітріптофаном в дозі 300 мг/кг внутрішньочеревно), Оланзапін в дозі 1 мг/кг повністю усував струшування, викликані 5-оксітріптофаном. Фенотропіл у всіх досліджуваних дозах зменшував прояв гіперкінезу (струшування головою): у дозі 100 мг/кг - на 88 %, в дозі 200 мг/кг - на 87 % і в дозі 300 мг/кг - на 89 %. Достовірної різниці в залежності від досліджених доз Фенотропілу не виявлено за цим тестом. Вплив Фенотропілу на серотонінергічну систему вимагає проведення більш детального тестування та дослідження більш низьких доз, так як виключати їх нейролептичну активність з цього тесту немає підстав. Профілактичне або випереджаюче (протекторне) застосування більш низьких доз може виявитися доцільним і при дофамінергічній патології. За впливом на відновлення M-холінергічної трансмісії (розглядається як ланка патогенезу психозів і дозволяє виявити можливість розвитку побічних реакцій на тлі застосування нейролептиків) при її депресії арекаліном (25 мг/кг підшкірно), Оланзапін в дозі 1 мг/кг достовірно зменшував тривалість тремору на 57 % (табл. 4.2.). Фенотропіл в дозах 200 і 300 мг/кг достовірно зменшував тривалість тремору на 63 і 50 % відповідно. 14 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антипаркінсонічна активність Фенотропілу на моделі галоперидолової каталепсії у мишей представлена в таблиці 4.3. Тривалість каталепсії визначали в секундах, через 60, 120 і 180 хвилин після введення препаратів. Фенотропіл вводили внутрішньочеревно в дозах 50, 100 та 300 мг/кг через 15 хвилин після галоперидолу 0,5 мг/кг. Введення галоперидолу викликало наростаючу з часом каталепсію. Фенотропіл в дозах 50 і 100 мг/кг повністю запобігав розвитку каталепсії в порівнянні з контролем через 60 хвилин після введення і в дозі 100 мг/кг каталепсія не спостерігалося. При дозі 50 мг/кг термін каталепсії через 180хв складав всього 4,8 сек в порівнянні з контролем (63,4 сек). При дозі 300 мг/кг через 60 хв після введення він підвищував вираженість галоперидолової каталепсії в порівнянні з контрольною групою, але потім вона виражено знижувалася в 2,6 рази, а через 180 хв її вираженість в порівнянні з контролем знизилася втричі. Фенотропіл виражено протидіє галоперидоловій каталепсії, що вказує на його антипаркінсонічну активність. Приклади 5: Вивчення впливу Фенотропілу (100, 200, 300 мг/кг) на рухову активність і дослідницька поведінка за методикою "відкрите поле" на мишах (16-24г) у порівнянні з Оланзапіном (1 мг/кг) представлені в таблицях 5-5.4. Оланзапін в більш високих дозах має виражену седативну активність, тому для дослідження препарат використовувався тільки при дозі 1 мг/кг порівняно з Фенотропілом. Препарати та дистильована вода контрольним групам вводилися внутрішньочеревно за 40 хвилин до дослідження. Оланзапін достовірно зменшував горизонтальну рухову активність (табл.5), знижуючи загальну величину пробігу на 36 %. Фенотропіл збільшував горизонтальну рухову активність за досліджений період часу при дозі 100 мг/кг - на 112,2 %, при дозі 200 мг/кг - на 151,8 % і при дозі 300 мг/кг - на 99,5 %. Це вказує на здатність препарату до реверсивності, на відміну від Оланзапіну. За показником вертикальної рухової активності (таблиця 5.1.) Оланзапін достовірно зменшував число стійок на 47 %. Фенотропіл при дозі 100 мг/кг збільшував сумарну вертикальну рухову активність на 237,5 %. При дозі 200 мг/кг на першій хвилині він кілька пригнічував вертикальну рухову активність, на другій хвилині вона відновлювалася до рівня контрольної групи, а на третій хвилині перевищувала контрольні показники вдвічі. У сумарному вираженні за три хвилини досліджуваний показник був дещо нижчим (-6,3 %) у порівнянні з контролем за рахунок ефекту на першій хвилині. Під впливом Фенотропілу в дозі 300 мг/кг спостерігалося достовірне зниження числа стійок на 1 хвилині (-75 %). Проте потім число стійок збільшувалася і сумарне збільшення кількості стійок за 3 хвилини склало +56 % порівняно з групою контролю, що також наочно демонструє здатність Фенотропілу до реверсивності і в часі. За показником впливу препаратів на обстеження отворів в порівнянні з контролем (таблиця 5.2.) Фенотропіл збільшував сумарний показник дослідної поведінки на 50 % при дозі 100 мг/кг, при дозі 200 мг/кг цей показник знижувався на 32 %, а при дозі 300 мг/кг сумарний показник обстежених отворів збільшився на 27 %. Оланзапін не впливав на кількість обстежень в порівнянні з контролем. За кількістю умивань (табл.5.3) Оланзапін впливав негативно, збільшуючи їх число на 150 % за 1 і 2 хвилини, і в сумарному показнику на 200 %. Фенотропіл при дозі 100 мг/кг знизив сумарний показник на 25 % порівняно з контрольною групою. При введенні Фенотропілу при дозі 200 мг/кг умовно не спостерігається. При дозі 300мг/кг на фоні Фенотропілу умовно фіксувалися тільки на 1 хвилині. Оланзапін вже при дозі 1 мг/кг (табл. 5.4) достовірно знижував число виходів тварин у центр відкритого поля на 39 % за сумарним показником. Фенотропіл при дозах 100, 200 та 300 мг/кг достовірно (на 111, 155 і 133 % відповідно) порівняно з контролем збільшував число виходів у центр, що свідчить про наявність у препарату у всіх досліджуваних дозах присутність вираженого анксіолітичного ефекту без седативного компоненту дії. Виражена нейролептична активність фенотропілу при різній симптоматиці поєднується з компонентами психостимулюючої і анксіолітичної дії з підвищенням орієнтовно дослідної поведінки у всіх досліджуваних дозах за всіма компонентами без седативного ефекту з проявом антипаркінсонічною активністю і це суттєво відрізняє з'єднання як від типових, так і від атипових нейролептиків, а також від однозначно стимулюючих і пригнічуючих препаратів. Психомодуляторна і нейромодуляторна активність сполуки запобігає розвитку побічних дій і аверсивності. Приклади 6: Вивчення впливу Фенотропілу в разових терапевтичних дозах (25-300мг/кг, Сполуки 1, 2, 3 і 4) на компоненти (первинний позитивний - Р1, первинний негативні - N1 і вторинний позитивний - Р2, і суми Р1+N1) викликаного транскалозального потенціалу (ВТКП) у кроликів (n=6) порівняно з Пірацетамом (300-500 мг/кг) і Піритинолом (50-150 мг/кг) за стандартною методикою [22, 28], вперше виявило (табл. 6) суттєві відмінності за формою і вмістом від двох останніх. 15 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ефекти Фенотропілу в період спостережень (3 години) ритмічні. У перші 30-40 хвилин на фоні використання Фенотропілу (Сполуки 1 і 3) показники компонентів збільшувалися поперемінно в середньому 35-15 % залежно від дози, а потім їх рівень не перевищував 15 % - 10 % в порівнянні з вихідними даними фону. Отримані результати можна охарактеризувати щодо Фенотропілу як біполярно асиметричне, консолідоване сполучення. Вплив Сполуки 2 менш виражений, ніж у Сполук 1 і 3, але характер впливу співрозмірний. Сполуки 1 і 3 відмінностей не мали. Ефекти Сполуки 4 не мали достовірних відмінностей від контролю з фізіологічним розчином, перебуваючи спочатку в межах 15-10 % вище фону і повертаючись до вихідного положення фону. Вплив Фенотропілу в порівнянні з Пірацетамом в досліджених дозах більш обмежений за однозначно психостимулюючим компонентом, але його психомодуляторна активність найбільш перспективна з точки зору протекції, корекції та лікування когнітивних і інших церебральних розладів. ВТКП характеризує не тільки когнітивні процеси, а й будь-які міжпівкульні взаємовдносини. Фенотропіл, на відміну від Пірацетаму та інших психостимуляторів не нівелює і не стирає природу асиметрії головного мозку, але підвищує і сполучно консолідує ці взаємовідносини, зумовлені природою, включаючи значення міжпівкульної асиметрії. В результаті досліджень на вище наведених прикладах і на сьогодні одержаних є всі підстави говорити про перевагу модуляторних ефектів Фенотропілу в порівнянні з однозначно спрямованими засобами при лікуванні і профілактиці різних психічних і неврологічних розладах, а не тільки тих, які виявлені. Фенотропіл, на відміну від Пірацетаму не є психостимулятором в традиційному розумінні психостимуляції і не може входити в групу N06B, препарати якої надають лише однозначно стимулюючу переважну активність електричного потенціалу дії або нівелюють і тим більше спотворюють його характер. Впливи Фенотропілу на мозковий кровообіг, системний артеріальний тиск (АТ) і нервову регуляцію кровообігу виконано на 6 наркотизованих кішках під загальною анестезією (уретан + хлоралоза). Фенотропіл вводився внутрішньовенно при дозі 50 мг/кг з дистильованою водою, контролем служило початковий стан кожної тварини до введення препарату. Мозковий кровотік реєстрували в загальній сонній артерії (ОМК) за допомогою електромагнітного вимірювача. Про нервові регуляції мозкового кровообігу судили за вазомоторним пресорним рефлексом (ВПР). Результати експерименту показали (таблиця 6.1), що рацемічна сполука викликає помірне збільшення мозкового кровотоку у наркотизованих тварин. Цереброваскулярний ефект супроводжується судинною гіпотензією з проявом пригнічення вазомоторного рефлексу. Двохфазність САД узгоджується і з картиною впливу на ВТКП в умовах без патології зі стабілізацією нормотонічного стану. При внутрішньочеревному і інтрагастральному введенні Фенотропілу (25-300 мг/кг) безпородним білим статевозрілим щурам обох статей, гіпотензивна активність (крововим методом через канюлю, з'єднану з сонною артерією) виявлялася через годину після введення при дозах 50-100 мг/кг і сткладала в середньому 13 % ± 2,85, а з підвищенням дози цей ефект зникає. Фенотропіл не є в прямому сенсі гіпотензивним або гіпертензивним засобом, але його модуляторна активність проявляється у схильності до нормотонії через регуляторний вплив на вазомоторний рефлекс. Даний ефект вимагає спеціального вивчення в клініці. Результати дослідження дають підставу вважати, що вплив Фенотропілу носить не тільки центральний характер, а й зустрічний від місцевого впливу, тобто від місця його присутності. Подібні ефекти препарату можуть бути особливо корисними при нестабільних станах, а також при вегетосудинній дистонії. Інсультний стан моделювали у щурів самців (270-320г) при локальному крововиливі в головному мозку - створення геморагічного інсульту (інтрацеребрально посттравматична гематома) за методикою А.Н.Макаренко і співавторів (1990) і при ішемії головного мозку з дистальною оклюзією середньої мозкової артерії (Chen ST, Hsu CY, Hogan EL, Maricq H., Balentine JD A model of focal ischemic stroke in the rat reproducible extensive cortical infarction//Stroke. - 1989, V.17, № 4, р.738-743) - ішемічний інсульт. Фенотропіл вводився внутрішньочеревно при геморагічному інсульті при дозі 100 мг/кг одразу ж після операції, а при ішемічному інсульті за годину до операції і через дві години після операції (при дозах 100, 200 та 300 мг/кг). Контролем служили тварини, які отримували адекватно дистильовану воду. Фенотропіл надавав виражені церебропротекторні і лікувальні ефекти при геморагічному та ішемічному інсульті у щурів (таблиці 6.2 та 6.3). Впливаючи на результат інсульту, він попереджав розвиток летального результату (спостерігали 14 діб) в 100 % випадках, надаючи лікувальну, профілактичну дію, прискорюючи процес відновлення неврологічного дефіциту в симптомокомплекс у тварин порівняно з контрольними групами інсультних тварин і помилково оперованих. Інтрацеребрально посттравматична гематома і оклюзія середньої мозкової артерії призводять до осередкового некротичного ураження головного мозку. Виявляючи 16 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нейропротекторну і церебротекторну активність при введенні до ураження головного мозку, нейротрофічну при введенні на фоні ураження і нейрометаболічну активність у всіх випадках він перешкоджає розвитку деградації в осередках ураження головного мозку, а відповідно і цілого, відновлюючи і зберігаючи пластичність і функціональність нервової системи, перешкоджаючи розвитку некрозу і ускладнень в експерименті. Це зайвий раз підкреслює поливалентну вибірковість впливу з'єднання в залежності від вихідного стану. Отже, Фенотропіл може бути корисний не тільки при цереброваскулярних, а й інших церебральних патологіях і розладах з урахуванням його виявленого співрозмірного впливу в інших, вище і нижче представлених Прикладах дослідження. Приклади 7: Фенотропіл характеризується вираженою ноотропною і мнемотропною активністю. Результати дослідження антиамнестичної активності (класична методика в установці "Lafayette Instrument Co", США) при ретроградній амнезії умовного рефлексу пасивного уникнення (УРПУ), викликаної максимальним електрошоком (ЕСШ) і скополаміном у щурів самців (180-250г) продемонстровані в таблиці 7. Ноотропна активність з'єднання виявляється і в низьких, і в більш високих досліджених дозах (25-100 мг/кг), достовірно усуваючи амнезію при одноразовому введенні. З урахуванням досліджень за методиками відкритого поля і хрестоподібного лабіринту, ноотропний компонент дії у модуляторному препараті не тільки може бути більш виражений, але і ширше за проявом в залежності від типу розладу або в незнайомих обстановочних умовах. Виражена ноотропна активність Фенотропілу (100, 200, 300 мг/кг) проявляється і у щурят обох статей 30-35 денного віку (табл.7.1) при амнезії УРПУ скополаміном. При проведенні досліджень у статевонезрілих тварин необхідно враховувати, що для вироблення УРПУ потрібно застосовувати, як встановлено, більш високі навчальні стимули (0,6 мА, 8 ударів проти 5 імпульсів по 0,45 мА у статевозрілих щурів) з повторним навчанням (через 48 годин). Розвиток амнезії вимагає і більш високої дози скополаміну (1,3 мг/кг) у щурят. При відборі щурят "недоучок" для оцінки мнемотропної активності в групи включалися нестатевозрілі тварини, у яких не вдавалося отримати позитивне значення показника дельти латентного періоду (ΔЛП=ЛП2 - ЛП1). Як випливає з таблиці 7.2, на фоні інтрагастрального введення Фенотропілу виявляється його виражена мнемотропна активність у щурят з початково негативною (ΔЛП=-6,8) тенденцією навченості. Мнемотропний ефект Фенотропілу за показником ΔЛП підвищується із збільшенням дози і становить +133 % при дозі 50 мг/кг, +504 % - при дозі 100 мг/кг і +696 % - при дозі 300 мг/кг по відношенню до контролю з фізіологічним розчином. Фенотропіл характеризується не лише психомодуляторною (Ψ-модуляторною) активністю, а й Ψ-операндмодуляторною, враховуючи, що мнемотропний ефект пов'язаний з експресією специфічних білків і генів, які відповідають за пам'ять, увагу і навчання. При одноразовому профілактичному введенні Фенотропілу (100 мг/кг) і одноразовому введенні на фоні депривації здібності до навчання скополаміном у статевозрілих щурів самців (табл. 7.3), з'єднання проявляє високу протекторну і терапевтичну ефективність на показники довготривалої пам'яті, уваги та навчання, вказуючи на те, що воно сполучно їх консолідує в якості агента попереджувального розладу і при лікувальному застосуванні на фоні їх розладів. Отримані результати мають важливе значення. У клініці частіше доводиться призначати ліки на фоні розладів. Вивчення механізмів дії профілактичного та лікувального впливу Фенотропілу (100 мг/кг) при одноразовому та субхронічному введенні (7 діб) за показниками рецепторного зв'язування з дофаміновими рецепторами (D1, D2, D3 в стріатумі), серотоніновими (5-HT2-фронтальна кора), глутаматними (NMDA в гіпокампі), ГАМКA бензодіазепіновими (БДЗ - кора) і ацетилхоліновими (nACh - кора) проводили на мембранних препаратах, виділених з різних компетентних структур мозку щурів. Методи відомі і описані [20, 26, 33]. Групами порівняння служили фонові дослідження в нормі і на фоні амнезії УРПУ, викликаної холіноблокатором скополаміном (таблиця 7.4 та 7.5). Зміна щільності (Вмах) різних рецепторів на фоні Фенотропілу пов'язано як з іонотропним, так і з метаботропним впливом на клітинні механізми. Фенотропіл включає процеси метаболізму всіх досліджених показників і при цьому з проявом співрозмірності в залежності від стану. В умовах без патології (табл. 7.5) він на 20 % знижував щільність D1 рецепторів і на 18 % - 5-НТ2, підвищуючи при цьому на 24, 30, 67, 58 і 29 % щільність D2, D3, NMDA, nACh і ГАМКA бензодіазепінових (БДЗ) рецепторів відповідно в порівнянні з групою контролю. Вироблення УРПУ в контрольній групі (табл. 7.4) знижувала в 2,7 рази щільність D1, в 2,6 рази - D2, в 4 рази - 5-НТ2 і в 1,4 рази - NMDA типів рецепторів в порівнянні з контролем без навчання (табл. 7.5), підвищуючи в 2,5 рази щільність nACh рецепторів. Введення амнестичного агенту скополаміну 17 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 після навчання УРПУ в порівнянні з групою контролю з УРПУ достовірно знижувало щільність D1 і БДЗ - підтип ГАМКА відповідно на 20 і 17 %, підвищуючи на 62 % щільність D3, на 18 % - 5НТ2, на 93 % - NMDA і на 95 % - D3 рецепторів. Введення Фенотропілу на фоні амнезії УРПУ скополаміном (табл. 7.4) проявлялося за рахунок підвищення щільності рецепторів D1, D2, D3, 5-НТ2 і ГАМКА бензодіазепінових відповідно на 16, 29, 24, 11 і 25 % зі зниженням щільності NMDA (на 12 %) і nACh (на 46 %). Отримані результати вказують на співмірність сполученого впливу нейрометаболічної активності рацемічної сполуки Фнотропілу як за метаботропним механізмом (пов'язаний з системами внутрішньоклітинних посередників, що призводять до запуску каскаду біохімічних реакцій і зміни функціонального стану клітини), так і за іонотропним механізмом (відкривати або закривати мембранні канали) з досить вираженою реверсивністю ефектів в залежності від вихідного стану організму. Отже, судити про ефективність модуляторів з співрозмірним впливом неможливо лише при дослідженні їх механізмів дії в умовах одного типу норми, як це зазвичай відбувається відносно препаратів з однозначним за перевагою напрямком впливу (або лише в сторону стимуляції, або лише в сторону пригнічення або репресії). До відкриття в рамках даного винаходу з'єднання з модуляторною активністю вважалося, що механізми дії, виявлені в нормі відповідають таким при патології і це дійсно відповідало препаратам або із стимулюючим, або з пригнічуючим ефектами, але не відповідає для оцінки співрозмірного впливу, так як характер цього впливу може змінюватися і залежно від типу норми, і залежно від типу розладу норми. З урахуванням досить широкого профілю співрозмірного впливу на досліджені компоненти і механізми дії, склад самого (RS)-2-(2-оксо-4- фенілпірролідін-1-іл)ацетамід, ймовірно, здатний виявляти модуляторну активність і на інші типи і підтипи рецепторів. Його модуляторна активність може виявитися досить корисною для профілактики, корекції та лікування різних патологічних станів, пов'язаних з порушеннями клітинного метаболізму і провідності в мембранних каналах, з утворенням і накопиченням атипових білків. Вважається, що ноотропний ефект безпосередньо пов'язаний з активацією іонотропних NMDA рецепторів. Однак, показано що і сама скополамінова амнезія викликає той самий і більш ніж істотно виражений ефект у порівнянні з контролем (табл. 7.4). Отже, продовжувати однозначно стимулювати даний процес може виявитися не тільки не доцільно, а й загрожує посиленням патології за аверсивним механізмом. Застосування Фенотропілу, як показано вперше, достовірно знижує щільність цих рецепторів на фоні скополамінової амнезії і проявляє при цьому антиамнестичну дію. Отже, при порушенні когнітивних функцій питання лежить у більш глибоких клітинних структурах мнестичної метаботропності того чи іншого препарату при лікуванні деменцій різного походження, а не лише в площині стимуляції нейрометаболізму. Фенотропіл виявляє сполучний вплив на всі досліджені показники. Вираженість його тригерного впливу і напрямок впливу різний в різних експериментальних моделях, що в свою чергу вказує на присутність зміни напрямку і метаботропної активності в залежності від стану, так як деменція в переважній більшості випадків пов'язана з утворенням в клітинах атипових білків або спотворюючих, або вилучаючих і функцію рецепторів. Фенотропіл здатний не тільки запобігати цим процесам, а й надавати лікувальний ефект при різних типах деменцій. Результати дослідження наочно демонструють і те, що апроксимувати механізми дії модуляторних засобів при одному типі норми, а також лише як попереджувального агента на той чи інший розлад не тільки може бути не виправдано, але й здатне вводити в оману. Необхідно враховувати і те, що різноманіття молекулярних механізмів дії не є запорукою доказів модуляторної активності, якщо це розмаїття не співрозмірно в залежності від типу норми і типу того чи іншого розладу. Приклади 8: Фенотропіл при дозах 50 і 100 мг/кг збільшував показники орієнтовно-дослідної поведінки на 89,0 % по вертикальному компоненту і на 240,0 % - по горизонтальному у порівнянні з контрольною групою тварин (табл. 8) у дослідженнях в тредбане у мишей при автоматичному вимірі вертикальних і горизонтальних компонентів рухової активності за одиницю часу і підсилює в цих дозах психостимулюючу активність Фенаміну (3 мг/кг), а при дозі 300 мг/кг достовірно протидіє при одноразовому введенні ефектам Фенаміну, знижуючи вираженість психостимулюючу дію останньої на 14,8 % по вертикальному компоненту орієнтовно дослідної поведінки та на 42,9 % по горизонтальному, нормалізуючи орієнтовно дослідницьку поведінку мишей. За впливом на ефекти Фенаміну, Фенотропіл виявляє залежно від дози і діаметрально протилежну активність при спільному застосуванні з психостимуляторами. Даний факт необхідно враховувати при комплексному застосуванні різних фармакологічних засобів. Стимулюючу дію на тривалість плавання у холодній воді (2 °C) і в нормальній - 25 °C (табл. 8.1-8.1.1) у Фенотропілу (25 і 50 мг/кг) в порівнянні з контролем (дистильована вода) і 18 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фенаміном (2, 5 мг/кг) досліджували на білих безпородних мишах самцях (18-26г) в порівнянні з контролем (дистильована вода) при внутришньочеревному одноразовому введенні через 60 хв після введення і при курсовому введенні протягом 4-тижнів на 28 день введення (таблиця 8.1.2). Фенотропіл виражено підвищує тривалість плавання і адаптивну регуляцію мишей при одноразовому введенні, не втрачає цієї здатності при курсовому введенні. За впливом на фізичну витривалість до низьких температур навколишнього середовища Фенотропіл практично втричі перевищує Фенамін (2,5 мг/кг). При одноразовому застосуванні в умовах низьких температур (таблиця 8.1) Фенотропіл підвищує тривалість плавання мишей на 70,7 % і на 85 % в дозах 25 і 50 мг/кг відповідно в порівнянні з групою контролю, а вираженість ефекту Фенаміну становила лише 30 % в порівняні з контролем. При нормальній температурі води ефект Фенаміну не змінюється і залишається 34 %. При плаванні в воді з нормальною температурою (таблиця 8.1.1) Фенотропіл при дозі 25 мг/кг фактично не відрізняється від ефекту Фенаміну, а при дозі 50 мг/кг він підвищує тривалість плавання на 75 % і перевершує вдвічі ефект Фенаміну. При курсовому застосуванні (таблиця 8.1.2) ефект Фенотропілу не лише не втрачається, але і більш виражений, ніж при одноразовому застосуванні, як у холодному, так і в нормальному за температурою середовищі існування, складаючи 109-108 % порівняно з контрольною групою тварин. Дані дослідження показують, що на відміну від психостимуляторів, психомодулятори не тільки не виснажують резервні можливості організму при курсовому застосуванні, але і збільшують їх. Перевага психомодулятора Фенотропілу очевидна і при одноразовому, і при курсовому застосуванні за впливом на фізичну працездатність і стійкість організму, як у звичайних, так і в несприятливих температурних умовах. Транквілізуючий ефект Фенотропілу (300 мг/кг) вивчали за методом конфліктної ситуації та зіткненню двох рефлексів (Vogel, 1971; Sanger et al., 1991; File, 1995; Молодавкін, Вороніна, 1995), пов'язаних в даному випадку з прагненням задовольнити мотивацію (питну) та застосування покарання (удар електричного струму, який отримують кожен раз при спробі задовольнити мотивацію). У створюваній конфліктній ситуації тварина переживає сильний негативний стрес. Транквілізатори знижують рівень тривоги і психоемоційного напруження. Фенотропіл, в досліджуваній дозі по відношенню до контролю, знижує рівень тривоги і психоемоційне напруження в конфліктній ситуації на 291,0 %, збільшуючи час між першим і другим взяттям води і зменшуючи кількість взятих за три хвилини спостережень на 74,4 % (табл.8.2). Специфічні ефекти протисудомної активності у статевозрілих тварин представлені в таблиці 8.3. Хімічні судомні агенти (бікукулін, коразол, тіосемікарбазид, пікротоксин) і максимальний електросудомний шок (МЕШ) моделюють в експерименті різні типи судом з їх різними механізмами реалізації патологічних станів. Протисудомна активність Фенотропілу при одноразовому застосуванні на всіх досліджуваних моделях проявляється вираженим позитивним впливом на попередження летального результату в досліджених дозах 100, 300, 400, 600 мг/кг. При бікукуліновому типі судом летальність в контролі становила 70,0 %. Фенотропіл (100, 300, 600 мг/кг) в 100 % випадках ефективний. На фоні коразола летальність в контролі дорівнювала 60,0 %, а позитивний ефект Фенотропілу проти контролю склав за летальністю в залежності від дози 45-35-0 % відповідно. Летальний результат на фоні тіосемікарбазиду склав 90,0 % у контролі, на фоні Фенотропілу (100, 300, 600 мг/кг) відповідно: 60-0-0 %. У контролі з пікротоксином летальність мишей становила 50 %, а застосування Фенотропілу при дозі 300 мг/кг повністю запобігало летальному результату. При МЕШ летальність у контрольній групі була 100,0 %, а в групах з Фенотропілом (100, 300, 400 мг/кг) відповідно: 20-0-0 %. Таким чином, протисудомна активність так само значно підвищилася, в тому числі і при дозі 100,0 мг/кг, що вказує на можливість застосування більш низьких доз з метою профілактики судомних епізодів і корекції судомної готовності до маніфестації епілепсії. Протисудомний ефект Фенотропілу попереджає розвиток судом і впливає на результат судомних станів, попереджаючи смертність на всіх застосованих моделях судом у тварин. Механізми дії протисудомної активності Фенотропілу, ймовірно також співрозмірні, різноманітні і залежать від вихідного стану. Фенотропіл в досліджуваних дозах (50, 100 і 300 мг/кг) характеризується вираженою антигипоксичною активністю, істотно збільшуючи тривалість життя мишей в барокамері (таблиця 8.4). Ефект посилювався при збільшенні дози препарату, підвищуючи тривалість життя в порівнянні з контрольною групою на 65,0, 147,8 та 591,0 % відповідно. Фепірон (25-50 мг/кг) - попередник Фенотропілу не впливав на виживаність тварин, а при дозі 100 мг/кг збільшував тривалість життя на 47,8 %. Пірацетам при дозі 600 мг/кг скорочував тривалість життя в порівнянні з контрольною групою тварин на 35,0 % і лише на фоні доз 900-2000 мг/кг 19 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тривалість життя збільшувалася на 78,0 %, що істотно поступається ефектам Фенотропілу і за ефективними дозами, і за терапевтичною вираженістю. Вплив Фенотропілу на больову чутливість мишей (таблиця 8.5) за методом "гарячої пластини" характеризує аналгезуючий ефект з'єднання і проявляється в досліджуваних дозах (50, 100 і 300 мг/кг) через 30, 60 і 120 хвилин після внутрішньочеревного введення зниженням больової чутливості на: 14,3-8,3-10,8 % при дозі 50 мг/кг; 12,4-12,5-31,5 % - при дозі 100,0 мг/кг і 71,4-61,5-100, 0 % - при дозі 300,0 мг/кг. Аналгезуючий ефект присутній у всіх досліджуваних дозах і наростає зі збільшенням дози. Приклади 9: При тому, що гіпоксія є причиною розвитку різних патологічних станів в постнатальному і ранньому дитячому віці, сприяє відставанню у розвитку, в процесі проведення досліджень було встановлено, що пацюки постнатального (7-ми денного) віку обох статей більш стійкі до впливу судомних агентів і гіпоксії, ніж статевозрілі тварини. Результати дослідження представлені в таблицях 9 (гіпобарична гіпоксія) і 9.1 (гіпобарія з гіперкапнією). Препарати вводилися за 30 хв до експозиції. У щурят постнатального віку на висоті 11 000 м загибелі не спостерігалося протягом 2 годин експозиції. В умовах гіпобаричної гіпоксії у 100 % контрольних тварин на висоті 7000 м спостерігаються посмикування тілом, сильний тремор (таблиця 9). На фоні Фенотропілу (50 і 100 мг/кг) тремор спостерігався тільки на висоті 10 тис.м. Протягом знаходження на висоті 11 тис. м (2 години) у контрольних щурят відзначався періодичний тремор (11 епізодів), тоді як у тварин, які отримували Фенотропіл, тремор спостерігався одноразово (тільки при підйомі). При спостереженні за поведінкою щурят протягом 2-годин, зазначалося, що 50 % тварин контрольної групи "завмирають" (нерухомі в барокамері). Щуренята, які одержували Фенотропіл в дозах 50 і 100 мг/кг, залишаються рухливими протягом всієї експозиції. У щурят, які отримували Фенотропіл в дозі 300 мг/кг (таблиця 9.1) тремор спостерігався тільки на висоті 11 тис.м., а на висоті 12 тис.м. тремор зникав. Протягом усього експерименту у контрольних щурят відзначався періодичний тремор (8-9 епізодів), тоді як у тварин, які отримували Фенотропіл, тремор спостерігався одноразово (тільки при підйомі). Після того, як тварин витягували з барокамери, щурята, що отримали Фенотропіл, були значно активніші, ніж контрольні тварини, у всіх випадках. Проведені дослідження та особливості тварин постнатального віку вказують на те, що у разі слабо вираженого антигіпоксичного ефекту у того чи іншого препарату у дорослих особин, їх ефекти в дитячій практиці можуть взагалі не проявлятися. Фенотропіл характеризується протигіпоксичною активністю і у тварин постнатального віку. Приклади 10: Антидепресивний ефект Фенотропілу вивчався у статевозрілих щурів (185-218 г) і у щурят 28-35 денного віку (85-110 г). Препарати вводилися внутрішньочеревно в першому випадку і інтрагастрально в другому за 40 хв до експериментів. Застосовували методики поведінкового відчаю вимушеного плавання (Porsolt et al., 1978) і вимушеного плавання з колесами, що вільно обертаються (Nomura et al., 1982). Фенотропіл виявляє статистично достовірний і виражений антидепресивний ефект в обох досліджених дозах (100 і 200 мг/кг), на що вказує значне зниження тривалості імобілізації під його впливом на -79,8 % і - 72,2 % порівняно з контролем (таблиці 10 і 10.1). При дослідженні депресії за Porsolt істотних відмінностей між ефективними дозами не виявлено (таблиця 10), а за методикою Nomura ця різниця є статистично значущою. При дозі 100 мг/кг ефективність Фенотропілу становила порівняно з контролем +59,0 %. А при дозі 200 мг/кг - +30,0 % в порівнянні з контрольною групою (таблиця 10.1). Під впливом Фенотропілу тварини не відмовляються від боротьби і продовжують спроби вибратися з аверсивної ситуації. Вони в істотно меншій мірі проявляють поведінковийе відчай. За методикою Nomura досліджували вплив Фенотропілу і у статевозрілих безпородних щурів (185-218 г). Фенотропіл в дозах 10, 25, 50 і 100 мг/кг (таблиця 10.2) виявляв антидепресивний ефект, збільшуючи наполегливе прагнення вибратися з води на 15,4 %, 67 %, 104,2 % і 142,4 % відповідно. Антидепресивна активність у дорослих тварин проявляється більш виражено, ніж у статевонезрілих і в дозі 100 мг/кг перевершує вдвічі. Приклади 11: Антитоксичну-витверезну і антикревингову активність, а також вплив Фенотропілу при абстиненції вивчали на безпородних білих щурах самцях (масою 180-220 г) і мишах самцях (масою 18-24г) при хронічній алкоголізації. Встановлено, що на фоні Фенотропілу в дозах 25,0200 мг/кг токсичний вплив етанолу у мишей знижується в десятки разів за показником "бокового положення" (наркотичний стан) і за летальною дозою, а при введенні Фенотропілу на фоні етанолу, Фенотропіл характеризується протверезною дією. Алкоголізовані щури при чотирьох 20 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 місцях алкоголізації та застосування терапії Фенотропілом добровільно відмовляються від вживання алкоголю (антикревінгова активність) при вільному виборі вода і алкоголь (таблиця 11). На фоні абстиненції у щурів алкоголіків (7-ми місячна алкоголізація) добове споживання алкоголю при подальшому вільному виборі не тільки відновлюється, але істотно збільшується в контролі, а застосування Фенотропілу призводить до добровільної відмови від вживання алкоголю (таблиця 11.1) при вільному виборі. Фенотропіл характеризується не тільки антитоксичним впливом при алкогольному отруєнні або попереджає алкогольне отруєння, але і вираженою терапевтичною - дією лікування алкогольної залежності щурів, проявляючи виражену антикревінгову активність, що характеризується добровільною відмовою тварин при добровільному виборі. Ефекти Фенотропілу і як антитоксичного засобу, і як засобу терапії абстиненції та алкогольної залежності виявляються, починаючи з одноразового застосування і посилюються при курсовому застосуванні. Ймовірно, Фенотропіл за рахунок модуляторних властивостей може бути корисний не тільки при залежності до алкоголю, але і при терапії інших наркогенних патологічних залежностей, а також різних форм токсикоманії з урахуванням модуляторного впливу на нейротрансмітерні системи, описані в прикладах вище. Приклади 12: Для виявлення та оцінки протизапальної дії Фенотропілу використовували стандартну методику - каррагеніновий набряк лапи у щурів (Winter C.et.al, 1962). Фенотропілу при дозі 100 мг/кг вводили інтрагастрально за 60 хвилин до каррагеніну. Контрольним тваринам вводили дистильовану воду. Додатково досліджували зовнішнє застосування за методикою формалинового набряку (субплантарне введення 0,1мл 2 % розчину формаліну). Фенотропіл для зовнішнього застосування підготовлювали (1:1) на стандартній мазьовій основі - носії з розрахунку 100 мг/кг маси тіла кожної тварини (150-220 г). Підготований препарат втирали в лапу і накладали пластир з марлею за 2 години і за 1 годину до індукції запалення. У першому досліді Фенотропіл скорочував запалення на 52,3 % порівняно з контролем, а у другому на 64,5 % (таблиця 12). Достовірної різниці не виявлено в другому випадку між застосуванням препарату за 2 години і за 1 годину до індукції запального агента. Виявлена протизапальна активність Фенотропілу була навіть більш виражена при зовнішньому застосуванні. Встановлено, що Фенотропіл має протизапальну активність як при введенні в організм, так і при зовнішньому застосуванні. Присутність власне протизапального ефекту у Фенотропілі послужило підставою для дослідження впливу препарату на більш складні патологічні агенти. Вивчали дію різних концентрацій Фенотропілу на ріст культури мікобактерій (МБТ) in vitro у відповідності зі стандартом досліджень (тест -культура високовірулентний лабораторний штам H37Rv). Підготовлювали широкий ряд концентрацій препарату: 1ряд - 100; 50; 10 мкг/мл; 2 ряд - від 10 до 0,31 мкг/мл і 3 ряд - від 2 до 0,031 мкг/мл. Для приготування матричного розчину використовували стерильну дистильовану воду, а для отримання зазначених концентрацій живильне середовище Школьникової. Для оцінки ростових і морфологічних властивостей культури МБТ суспензія мікобактерій у відповідних концентраціях розчину Фенотропілу засівали на середовище Левенштейна-Йенсена і на середовище Школьникової (по 4 пробірки на кожну точку). Черев 2 тижні візуально визначали наявність росту в середовищі Школьникової і готували мазки з осаду. Мазки фіксували і фарбували за Цілем-Нільсеном. У мазках підраховували кількість мікобактерій і на підставі отриманих результатів визначали концентрацію препарату, при якій спостерігалося пригнічення їх росту. Кількість колоній МБТ і їх морфологічні особливості оцінювали на середовищі Левенштейна-Йенсена через чотири тижні від моменту посіву. Облік результатів так само проводився через чотири тижні після засіву. Результати дослідження представлені в таблиці 12.1. У всіх пробірках з різними концентраціями Фенотропілу в середовищі Школьникової візуально відзначалося зростання культури МБТ, як і в контрольних пробірках, де Фенотропіл був відсутній. При мікроскопії мазків встановлено наявність мікобактерій у вигляді характерних кіс у всіх полях зору в кожному з приготованих препаратів. На середовищі Левенштейна-Йенсена у всіх пробірках визначався ріст характерних колоній МБТ, проте їх кількість було неоднаковама. У контролі і в деяких дослідних пробірках ріст колоній був рясним, місцями зливним і погано піддавався рахунку. Такий ріст колоній позначали як "суцільний ріст". Менш 100 колоній спостерігалося в інтервалі концентрацій Фенотропілу від 0,25 до 5,0 мкг/мл. Найменше число колоній МБТ відзначено в діапазоні концентрацій від 0,5 до 1,0 мкг/мл. При більш низьких і більш високих розведеннях відмінностей не виявлено. Таким чином, Фенотропіл в інтервалі концентрацій від 0,5 до 1,0 мкг/мл в дослідженнях in vitro виявляв статистично достовірну бактеріостатичну активність на ріст колоній мікобактерій. 21 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклади 13: Вплив внутрішньочеревного введення Фенотропілу при дозі 100 мг/кг на про- і антиоксидантні системи вивчали на щурах самцях ліній Вістар і Серпень, і білих безпородних щурів (масою 180-220 г, по 10 щурів у групі), що володіють різною генетичною стійкістю до негативного стресу (Ns), тобто в ds і Ds станах. Контрольним тваринам вводилася дистильована вода. Гострий і системний Ns-вплив здійснювали за методикою Н.А. Бондаренко (Н.А. Бондаренко та ін., 1999) при одноразовій і триразовій (один раз на добу) і семикратноій (сім діб) диспозиції Ns психоемоційного характеру. Визначали спектрофотометричним методом вміст ТБК (тіобарбітурова кислота) - МДА (малоновий диальдегід) у плазмі крові. Зміст НSP32 визначали за допомогою Вестерн-блот-аналізу (нг/мкг загального білка). Оцінювали на безпородних білих мишах самцях (масою 20-26г) вплив Фенотропілу на електролітний баланс плазми крові при хронічному (протягом 4-х місяців внутрішньочеревному) введенні Фенотропілу. Результати дослідження представлені в таблицях 13-13.8. Фонові дослідження показали (табл. 13), що вміст МДА у генетично високо і генетично низько ds-стійких щурів різний, що узгоджується з відомими даними. Має воно відмінності і з безпородними тваринами (контроль). Стрес -лімітуюча система щурів лінії Серпня практично на 43,0 % нижче ніж у лінії Вістар, на що вказує рівень вмісту ТВК- продуктів по МДА, але як показують дослідження, резерв цих ліній так само різний і з'єднання виявляє виборчу активність в рамках резервних можливостей кожної лінії одного виду. Ns (негативний стрес) так само надає різний вплив на рівень МДА в плазмі крові різних ліній одного виду тварин. У високо стійких тварин під впливом Ns концентрація МДА в плазмі крові достовірно знижувалася на 12,0 %, в порівнянні з безпородними тваринами, а у низько стійких підвищується на 186,0 % в порівнянні з їх початковим рівнем в умовах норми (таблиці 13.113.2). Вплив гострого Ns-впливу надає різноспрямований вплив у різних ліній тварин одного виду і виражається в позитивних чи негативних значеннях, як за знаком, так і за вираженістю відповіді організму за досліджуваними показниками. Стан співвідношення прооксидантної та антиоксидантної систем у різних ліній тварин не рівнозначно. Отже, низько стійка лінія (Серпень) більш реактивна і більш чутлива до Ns і ціна відповіді у низько стійких тварин набагато вище, має протилежний знак вираженості за показником МДА. Фенотропіл при одноразовому введенні в організм, без моделювання стрес-негативної реактивності, сам є Тs-фактором, переводячи функціонування організму на більш високий рівень, як у високо, так і у низько стійких ліній тварин і завдає відповідного впливу, що виражається в підвищенні активації стрес-лімітуючих систем у лінії Вістар на 66,0 %, а у лінії Серпень на 190,0 %, що в 2,9 рази вище в порівнянні з лінією Вістар, надаючи прооксидантну дію, що вказує на співмірність впливу Фенотропілу у генетично різних ліній. На фоні Ns-впливу, Фенотропіл знижує рівень МДА на 6,0 % порівняно з вихідним контролем без стресу у лінії Вістар, а у лінії Серпень навпаки його дія проявляється вираженим підвищенням концентрації МДА в плазмі крові в 2,2 рази в порівнянні з вихідним контролем і навіть на 17,0 % вище, ніж на фоні Фенотропілу без Ns впливу. Модуляторна активність препарату проявляється не тільки за Тsf-впливом, але і пропорційно, з діаметрально протилежним знаком на фоні негативного стрес-впливу (Ns) у різних типів генетичної стійкості. Надмірно низький вихідний рівень МДА вказує ймовірно на недостатність лімітованих систем, тому застосування засобів, які погіршують стан, може мати трохи не позитивний, а негативний ефект. Особливий інтерес представляють результати дослідження за "внутрішньовидової" активності ПОЛ у безпородних (Б/п) тварин (таблиця 13.3) та інших ліній в умовах 3-х кратної стрес-негативної напруги. Показник ПОЛ, що визначається від вихідного рівня ТВК- МДА становить 1,0 (0,99) у Б/п. По відношенню до Kt безпородних, ds підвищив показник Kt у Вістар на 10,0 %, який склав в числовому вираженні 1,1. У лінії Серпень при Ns-стані, Kt склав 2,1 по відношенню до Б/п. В умовах Ns-стану видовий Kt=1,6. На фоні Фенотропілу Kt у обох ліній тварин по відношенню до Б/п дорівнював 2,1 і отже стільки ж склав внутрішньовидовий Kt, що вказує на досить цікавий факт впливу Фенотропілу в рамках видового резерву стійкості, який в гострому експериментальному Ns-стані на фоні застосування препарату збільшився на 12,5 %, що практично відповідає лінії Вістар на фоні Ns, але з протилежно направленим знаком (12,0 %). Визнати це випадковістю неможливо в силу статистично вивіреної закономірності. Фенотропіл пропорційно впливає на різні лінії тварин не тільки в рамках генетично зумовленого умовно фенотипічного гомеостазу, а й розширує рамки видового і фенотипічного онтогенезу на специфічному генному рівні. При цьому дослідження курсового (4 тижні) введення Фенотропілу (оцінку проводили через годину після введення препарату в 1-шу, 3-тю, 7-му, 14-ту, 21-у та 28-у добу) показали, що засіб 22 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 не завдає якого-небудь помітного впливу в звичайних умовах на утримання електролітного балансу плазми крові тварин за показниками Са, К і Na (табл. 13.5), що є підтвердженням відсутності у Фенотропілі негативного впливу на збалансованість про- і антиоксидантної систем + + організму тварин, не викликаючи Na / К -Са2+-АТФази і не приводячи до енергодефіциту, а так само до порушення електролітного балансу за гіпер- або гіпо-типом. Отже, модуляторна консолідуюча дія препарату при наявності вираженого тренінг-стресу факторного впливу поширюється багаторівневим промоутмодуляторним типом дії з прямими, зворотними і перехресними залежностями, включаючи клітинну регуляцію з консолідацією сполучення відповідальних систем і посиленням регуляторного контролю за їх станом. Вплив фенотропілу у низько і високо стійких тварин за показником білка теплового шоку наочно демонструють (таблиці 13.6-13.8) тренінг-стрес факторний (Тsf) вплив у структурах головного мозку з вираженою операндмодуляторною активністю у різних лініях тварин в порівнянні з безпородними (Б/п). Фенотропіл в досліджуваній дозі знижує експресію генів у щурів лінії Вістар на 17,7 % і підвищує експресію на 16,9 % у лінії Серпень, тобто має діаметрально протилежні ефекти в залежності від вихідного генетичного стану. На фоні Nsнапруги застосування Фенотропілу збільшує експресію генів за показником НSP32 відповідно на 82 % і 99 % при одноразовому введенні, надаючи виражений нейропротекторний вплив. Стреснапруга, як негативний фактор впливу без Фенотропілу знижує рівень НSP32 у лінії Вістар на 9,1 % та підвищує у щурів лінії Серпень на 95 %. У групі Б/п тренінг-стрес-факторний вплив одноразового введення Фенотропілу було еквівалентно однократному стрес-емоційному впливу методичного впливу і становило +38,5 % порівняно з контролем. Вплив Фенотропілу і стреснегативного фактора збільшувало на 86,0 % показник Kt по відношенню до контролю без досліду. Перехід дистресу в дестрес, а також виражена модуляторна адаптогенна активність Фенотропілу наочно продемонстрована результатами дослідження в таблиці 13.8 порівняно з результатами таблиці 13.4, що говорить про високу біологічну активність сполуки, як тепер можна судити на підставі отриманих результатів. Ds, як і ds, розвивається у різних ліній тварин одного виду за власним сценарієм і не однотипно, тому й концепція про "загальний адаптаційний синдром" не може мати єдиного сценарію залежно від генетичної схильності, вона набагато різноманітніша в її реалізації навіть у різних підтипів одного виду тварин, не кажучи вже про різні підтипи одного і того ж розладу і хвороби. У безпородної групи і групи лінії Вістар рівень ТБК-продуктів у порівнянні з контрольними високий і склав відповідно +270 % та + 193,7 %, а коефіцієнт трансмісії більш ніж у три рази перевищує контрольний внутрішньолінійний. Дистрес у цих ліній тварин розвивається за гіперфунціональним напрямком, а у лінії Серпень Ds - стан переходить в гіпофункціональний і становить у порівнянні з групою власного контролю (-30,5 %). На фоні Фенотропілу модуляторний стан організму відновлюється, а модуляторна активність з'єднання проявляється діаметрально протилежним впливом з вираженим адаптивно модуляторним ефектом по діаметрально протилежним сценаріям відповідно (-73,0, -65,6 та +60,0 %) та більш кращим показником Kt ніж у контролі і у Вістар, і у Серпень, відновлюючи Kt до повної норми безпородних щурів. Отримані результати дозволяють характеризувати вплив Фенотропілу не тільки як тренінгстрес факторного модулятора, але і як модулятора співрозмірно спонукаючого і співрозмірно консолідуючого стреслімітування системи на рівні клітинного метаболізму про- і антиоксидантних систем, а також як клітинного операндмодулятора на рівні експресії генів за показником білка теплового шоку. Отже, промоутмодуляторний тип активності поширюється у даного з'єднання і на внутрішньоклітинний рівень як операндмодуляторний, а також як мембраностабілізуючий і цитомодуляторний з вираженою трансмісією. Ефекти Фенотропілу на метаболізм носять не стимулюючий або пригнічуючий характер, властивий двом традиційним типам препаратів (стимулятори і пресори або депресори), чиє дія заснована тільки на одному чи лише на іншому провідному ефекті, а модуляторний, що виражається як про-, так і антиоксидантною активністю, а антиоксидантна активність і вплив на білки теплового шоку так само модуляторні залежно від вихідного стану та генетичної схильності. При вираженому впливі залежно від вихідного стану на про- і антиоксидантні системи, а так само на білки теплового шоку HSP32 при збереженні показників електролітного балансу і при хронічному введенні, унікальність пропорційно консолідуючого впливу Фенотропілу очевидна з представлених результатів дослідження. Приклади 14: Вивчення фармакокінетичних параметрів розподілу Фенотропілу (100мг/кг - 1 % водний розчин перорально) у білих безпородних щурів обох статей з масою тіла 220-260г (табл. 14) не виявили істотних змін в гомогенату органів (метод визначення - ГЖГХ) з раніше відомим у 23 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фенотропілі, що вказує на здатність родинних домішок конкурувати за місця зв'язування в органах і тканинах, але не впливає на процеси всмоктування, розподілу і виведення діючого з'єднання. Рівень вмісту з'єднання і розподілу в нирках і печінці в різні інтервали часу близький до рівня вмісту в плазмі крові, в той час, як у серці і особливо в мозку його рівень значно нижчий. Ступінь тропності з'єднання в різних органах за кількісним вмістом неоднакова і розподіляється в порядку спадання послідовності: печінка, нирки, серце, мозок. Швидке проникнення в мозок підтверджує хорошу кінетичну здатність проникати через гематоенцефалічний бар'єр. Через 0,25 години його присутність виявляється в мозку, серці, печінці та нирках. У мозку, печінці та нирках максимальний вміст досягається через годину і через 6 годин після перорального введення з'єднання не виявляється. У серці максимальний вміст виявляється через 1 годину 50 хв і виводиться повністю через 8 годин. Максимальний вміст Фенотропілу в міокарді виявляється пізніше, ніж у мозку, але і виводиться з міокарда на дві години пізніше. У печінці максимальний вміст виявлено через годину і потім концентрація поступово знижується. Через годину після введення вміст у нирках досягає максимуму з поступовим зниженням надалі. На щурах-самцях лінії Вістар масою 195-250г виявлена виражена активність Фенотропілу (25, 50, 100, 300 мг/кг) при введенні по експресії HSP70 в міокарді через 60хв після введення в норму і в умовах після стрес- негативного впливу за методикою Н.А. Бондаренко (Н.А. Бондаренко та ін., 1999) у порівнянні з контрольними групами тварин (дистильована вода). Визначення НSP70 (нг/мкг загального білка) вивчали на препаратах міокарда за допомогою Вестерн-блот-аналізу. Результати представлені в таблиці 14.1. Рівень вмісту НSP70 в міокарді при контрольних дослідженнях без впливу негативного стресу склав 0,11±0,007нг/мкг (таблиця 14.1). Внутрішньочеревне введення фенотропілу в дозах 25, 50, 100 і 300 мг/кг підвищувало вміст НSP70 в серці на 65, 82, 73 і 273 % відповідно. Стрес негативний стан в групі контрольних тварин викликало підвищення НSP70 на 164 % (0,29±0,007 нг/мкг загального білка) порівняно з вихідним контролем. На фоні Фенотропілу в дозах 25, 50, 100 і 300 мг/кг при стрес-негативному стані рівень НSP70 збільшився в міокарді в порівнянні з групою досліджуваного контролю на: 38; 41,4; 62 і 89,7 % відповідно. Патологоанатомічні і мікроструктурні дослідження міокарду не виявили деструктивного впливу Фенотропілу на стан міокарда, що було явно виражено у щурів у контрольній групі на фоні негативного стресу без Фенотропілу. Фенотропіл в низьких і високих разових дозах в умовах норми володіє вираженою Tsfактивністю, а в ds-умовах забезпечує організму більш високий захист на клітинному і органному рівні. З урахуванням ролі цитопротекторних білків HSP70 і їх поширеністю в тканинах різних органів, можна говорити про роль Фенотропілу в організації антиапоптозних механізмів та експресії мобілізаційних генів не тільки клітин головного мозку, а й міокарду, що вказує на можливість відсутності тканьоспецифічності у з'єднання. Протизапальна активність Фенотропілу при зовнішньому застосуванні і деякий вплив на ріст колоній мікобактерій вказують на надзвичайно широкий спектр його можливих ефектів. Фенотропіл може знайти застосування, з урахуванням отриманих результатів, не тільки в психіатрії та неврології, а й в кардіології, а так само в інших областях, так як він кінетично розподіляється по різним органам і тканинам і здатний завдавати місцевого впливу. Приклад 15: Адаптогенну дію Фенотропілу, його енантіомерів і препаратів різних класів і груп вивчали на моделі 14 добової іммобілізації (з 17 годин до 10 годин) в антиортостатичному положенні о (АНОГ-45 ) щурів самців лінії Вістар (187-260 г) в спеціальних клітках - пеналах для кожної тварини. З 10 до 17 годин тварини знаходилися в звичайних умовах і мали вільний доступ до їжі і води при звичайному вмісті. У попередніх дослідженнях було встановлено, що Ns-очікування не менш агресивний за впливом, ніж монотонний вплив безвиході. Необхідно враховувати і те, що пацюки відносяться до видів з активною поведінкою в нічний час доби. Фенотропіл в дозах 100, 50, 25 мг/кг та його ізомери в дозах 25 мг/кг з препаратами порівняння (Седуксен - 2 мг/кг, Пірацетам-200, 400, 600 мг/кг, Фенибут - 100 і 50 мг/кг, ізомери Фенибуту - 50 мг/кг, Фепірон 200, 100 і 50 мг/кг, ізомери Фепірону - 200 мг/кг) вводилися один раз на добу внутрішньочеревно з фізіологічним розчином в ранкові години. Групі контрольних тварин вводився фізіологічний розчин. Друга контрольна група весь цей час перебувала в звичайних умовах в окремому приміщенні і не була свідком експерименту. Після закінчення досліду на дослідження забиралися тимус (Т), селезінка (С) і наднирники, зважувалися з визначенням їх маси на 100 грам вихідної маси тіла кожної тварини і обчислювалися масовідношення селезінки до тимусу і наднирників, а також відношення тимусу до надниркових залоз за показником Kt. У першому випадку отримували показник трансмісії взаємовідношень імунної та кровотворної систем, у 24 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 другому - імунної та гормональної, а в третьому - імунно-гормональне співвідношення. Результати дослідження представлені в таблиці 15. З урахуванням того, що у вищеописаних результатах дослідження вперше встановлено здатність енантіомерів до конформації, присутність (+) і (-) у таблиці 15 у назв Фенотропілу характеризує тільки їх початковий стан до введення. У контрольній групі без досліду співвідношення показників (Kt) за С/Т, С/Н і Т/Н, складали відповідно 1,1, 9,9 і 7,7. Дестрес змінив ці співвідношення відповідно: 6,2-7,3-2,5. Ds призводить не тільки до виснаження стрес-лімітуючих систем, а й до неузгодженості, дезорганізації їх взаємовідносин. Всі досліджувані препарати, крім груп тварин з Фенотропілом і його енантіомерами, не здійснювали консолідуючої дії і погіршували в різному ступені нестабільність показників гуморальних систем з виснаженням ендокриних та імунних ланок з нераціональним використанням імунної системи за типом виснаження протизапальної спрямованості при недостачі гормональної ланки на певному етапі за рахунок збільшення навантаження на відділ селезінки, що призводило до значного підвищення балансу С/Т, зниження балансу С/Н та схильністю до нокаут-функціонуванння співвідношення Т/Н. Фенотропіл і обидва його оптично активних ізомери в досліджених дозах не просто перешкоджали схильністю до нокаутвиснаження гормональної та імунної ланок, але й не допускали перенавантаження роботи кровотворної, імунної та гормональної систем, зберігаючи їх пластичну консолідованість і спрямовуючи на відновлення тренінг-стрес стану. Ефекти енантіомерів Фенотропілу практично не розрізнялися в досліджуваних дозах, але були нижче за ефективністю дози 50 мг/кг рацемічної сполуки Фенотропілу, а також виражено нижче інших доз рацемічного з'єднання за співвідношенням до імунно-ендокринної систем. Фенотропіл і його енантіомери в даному їх співвідношенні, як в досліджуваному засобі, так і при монотерапії енантіомерами, зберігали і виявлену математичну збалансованість показників кровотворного, імунного та гормонального статусу, наближаючись до показників норми співвідношень. Фенотропіл високо ефективний при хронічній депресії стану стрес-лімітованих систем або зміни їх балансу в силу вікових особливостей при правильному підборі відповідних доз препарату. Енантіомери Фенотропілу характеризуються вираженою біологічною адаптогенною активністю і ймовірно за модуляторним типом, проявляючи тригерну трансмісію з співрозмірним сполученням функціональних систем. Окремо досліджувалася протиульцерогенна дія Фенотропілу за цією методикою (таблиця 15.1). Препарати застосовувалися в якості терапевтичних засобів після 14-ти добового впливу. Противиразкова активність Фенотропілу в Ds-умовах в досліджуваних дозах становить в порівнянні з контролем (5 % розчин глюкози) і залежно від дози (25, 50 і 100 мг/кг): -45, -63 і 80 % відповідно. Протиульцерогенна активність Фенотропілу проявляється репаративними і регенеративними ефектами при ураженнях шлунка в умовах негативного стресу, проявляючи досить високу терапевтичну ефективність. Результати проведених досліджень так само вперше показують, що при вираженому дестресі (Ds) ні Фенибут і його енантіомери, ні Фепірон і його енантіомери, ні Пірацетам, ні Седуксен не здатні забезпечити консолідовано оптимальну пластичність стрес-лімітованих систем і це не тільки змінює уявлення про адаптогенну дію ноотропів, а й ставить наявність його у цих препаратах під сумнів у Ds умовах. Фактично всі досліджувані засоби, крім Фенотропілу і його енантіомерів, продемонстрували результати виражено гірше ніж на фоні застосування фізіологічного розчину в групі дослідченого контролю, посилюючи ситуацію стрес-дезорганізації в 2-7 разів за різних співвідносних показникам. Раніше вважалося самими же авторами данних досліджень, що Фенибут найбільш активний за показником адаптогенної дії, але ці висновки грунтувалися на сукупності показників функціональних систем в умовах дистресу, оскільки, поперше, не було самого поняття дистрес, а так же препаратів, що забезпечують адаптацію за модуляторним типом дії, тобто характеризуються адаптивно-модуляторною активністю і вираженою тренінг-стрес факторною активністю з пропорційним впливом, що характеризуються до того ж і промоутмодуляторною і юнімодуляторною активністю. Раніше вважали, що дистрес відразу ж переходить в напрямок аут стану (за класичною методикою Г.Сельє), але це далеко не так, що досить яскраво продемонстровано результатами цього дослідження. Показано, що модулятори істотно відрізняються за адаптогенною активністю як від анксиолітиків, так і від власне ноотропів, а також від анксиолітиків з ноотропним компонентом дії. Отримані результати дослідження вказують на те, що для забезпечення гострої адаптації і протидестресорної (Ds) дії за адаптогенно-модуляторним типом недостатньо присутності раніше відомих ефектів. Пірацетам, Фенибут і його енантіомери, Фепірон і його енантіомери, що характеризуються, як відомо, різними спектрами нейротропної і психотропної активності з присутністю ноотропного ефекту у визначених для них дозах, погіршують загальний 25 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 функціональний стан в умовах Ds за співвідношенням кровотворної ланки до імунної та гормональної ланонк і за співвідношенням імунної до гормональної, незважаючи на те, що одні з них відносяться до ряду стимуляторів, а інші до ряду транквілізаторів з ноотропним компонентом дії. Седуксен, на відміну від власне ноотропів, виявився навіть більш ефективним, але однонаправлена анксиолітична активність посилює Ds. Співвідношення імунної та гормональної ланок також має позитивний стан тільки на фоні Фенотропілу і його енантіомерів. Ймовірно для забезпечення консолідованого балансу сполучення прямих і зворотних, перехресних взаємозв'язків недостатньо присутності тільки нейротропної активності будь-якої спрямованості, крім модуляторної, включаючи і психомодуляцію. Фенотропіл характеризується і вираженою протиульцерогенною активністю в умовах дистресу. Отже, психостимулятори і депресори або пресори, що навіть мають ноотропний компонент дії, не здатні забезпечувати довготривалу адаптацію, а також переводити термінову в довготривалу. Їх ефекти можна характеризувати фермативним типом дії. При цьому необхідно досліджувати адаптогенну дію і в період гострої адаптації у різних ліній тварин одного виду. Розбалансування співвідношення всіх функціональних систем на клітинному, тканинному і органному рівнях вимагає присутності не тільки нейромодуляторної, а й психомодуляторної, інкретомодуляторної та імуномодуляторної, а також і ймовірно - операндмодуляторної активності, так як ds і Ds стану не можуть благополучно або негативно вирішуватися без участі експресії генів. Вперше також показано і те, що оптично активні енантіомери Фенотропілу характерихзуються вираженою біологічною активністю модуляторного типу дії при стані Ds, а їх сукупна присутність не погіршує, а покращує досліджувані показники. При цьому збалансованість (R:S) енантіомерів Фенотропілу ефективніша за модуляторною активністю, ніж на фоні окремих його енантіомерів. Оптично чисті сполуки схильні до рацемізації, тому для проведення їх досліджень та встановлення їх достовірних властивостей і характеристик необхідне проведення спеціальної процедури стабілізації сполук, яка набагато складніше, ніж для рацемату. Судячи з показників співвідношення досліджуваних параметрів, Фенотропіл характеризується модуляторною активністю як на нейрогуморальному рівні, так і на рівні вищих психічних функцій, так як дана модель включає елементи не тільки гострого психічного ситуаційного напруження, але і психічного впливу - стреснегативний стан очікування, де ноотропи і транквілізатор виявилися не ефективні. Промоутмодуляторний тип активності Фенотропілу на психічному, нейрональному, імунному, гормональному, кровотворному та, ймовірно, генному рівнях забезпечує позитивний результат при хронічному патологічному стані, не тільки перешкоджаючи розвитку негативного стану, але і запобігаючи виснаженню, консолідуючи нейрогуморальні стрес-лімітовані системи та вищі психічні функції на відміну від власне ноотропів і препаратів, що містять ноотропний компонент дії. Беручи до уваги, що і власне ноотропи проявляють адаптогенний і ноотропний ефекти лише в більш низьких дозах, ніж притаманна їм ведуча активність, то є підстави говорити про те, що і вони не являються ноотропними препаратами як такими, а їх ноотропний ефект є тільки одним з компонентів. Ефективність промоутмодуляторної активності Фенотропілу залежить від дози. Відповідно до отриманих результатів, можна зробити висновок, що судити про наявність адаптогенної активності неможливо у відсутності співвідношення компонент стрес-лімітованих систем навіть при наявності сукупності показників, а відсутність у препаратів модуляторної активності промоутмодуляторного типу не здатна повною мірою забезпечувати адаптогенний ефект в Ds умовах. Фенотропіл і його енантіомери характеризуються адаптогенною активністю промоутмодуляторного типу дії, включаючи різні рівні і від різних рівнів співрозмірного впливу з їх консолідованим сполученням. Виявлено, що провідною активністю Фенотропілу і в даному випадку є модуляторна з співрозмірним впливом, що відрізняє його від препаратів лише стимулюючого або лише пригнічуючого типу дії, включаючи і ті, що здатні проявляти стимулюючу дію лише в низьких дозах (фенибут, фепірон, седуксен). Всі препарати, включаючи і дивергенти, крім Фенотропілу і його енантіомерів, характеризуються не формантивним, а фермативним характером дії, а відповідно і організації пластичності функціональних систем та їх взаємовідносин, що, в кінцевому рахунку, призводить до дезорганізації і порушення балансових відносин. Приклад 16: Беручи до уваги, що Фенотропіл, є хімічно похідним діапіролідину- діапірілідону і родинним з'єднанням фепірону, а також має у своїй структурі формальні елементи схожості з "рацетамом" - ахірального похідного піролідину-піролідону (Пірацетам), були проведені їх порівняльні дослідження на статевозрілих безпородних, білих мишах самцях масою 18-24г (по 20 мишей в кожній групі) за методикою електроболевого подразнення кінцівок у одиночних і попарно 26 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 згрупованих тварин на електричному майданчику. У тестових дослідженнях визначали пороги реакцій (у вольтах) кожної тварини, а через добу у попарно згрупованих, поміщених на електричному майданчику. Фіксували поріг чутливості без звукового прояву (завмирання - поріг уваги) - Пу, поріг першого писку (поріг емоційного реагування) - Пп і поріг агресії (бійка), спрямованої по відношенню один до одного - Па. Препарати (Фенотропіл і Фепірон в дозах 25, 50 і 100 мг/кг; Пірацетам в дозах 100, 200 та 300 мг/кг) вводилися внутрішньочеревно з фізіологічним розчином за годину до дослідження. Контрольним групам вводився фізіологічний розчин. Для чистоти експерименту всі досліджувані препарати застосовувалися хімічно чистими з вмістом діючих речовин не менше 99,8 %. Результати представлені в таблиці 16. На фоні Пірацетаму відбувалося виражене зниження порогу больової чутливості на 43,6 % при дозі 100 мг/кг, на 48,1 % - при дозі 200 мг/кг і на 19,9 % - при дозі 300 мг/кг за тестом тривожного стану (Пу) і зростанню емоційного реагування зі зниженням порога емоційної реактивності (Пп) на 23,5 і 47,0 % відповідно дозам 100 і 200 мг/кг, що вказує на пряму психостимулюючу активність, що приводить до нестабільного психоемоційного стану зі зниженням порогів реагування та зниженою чутливістю до больового впливу. Зниження порогу агресії (Пa) склало 11,3 % при дозі 100мг/кг, підвищення на 25,7 % - при дозі 200 мг/кг і 7,4 % при дозі 300 мг/кг. Пірацетам знижує стабільність реакцій тривоги і емоційного реагування, підвищуючи в низьких для нього дозах і поріг агресії, а також викликає нестабільність психоемоційного стану з пониженням їх порогів, що є негативним проявом його психотропної дії. Рацемічна сполука Фепірону має істотну перевагу за порогом агресії, який підвищується в два рази, в порівнянні з контролем, при дозі 100 мг/кг і на 48-84 % відповідно при дозах 25 і 50 мг/кг. Пороги тривоги і емоційного реагування фактично не зазнають змін в порівнянні з контролем. Фенотропіл підвищує поріг больової чутливості (Пу) на 74 %, 65 % і 57 % відповідно дозам 25, 50 і 100 мг/кг. Поріг емоційного реагування підвищується на 40 %, 76 % і 82 % відповідно, а поріг агресії підвищується на 8,7 %, 4,0 % і 7,6 % відповідно дозам 25, 50 і 100 мг/кг. У порівнянні з Пірацетамом поріг агресії на фоні Фенотропілу стабільний і Фенотропіл не знижує його, а навіть дещо підвищує зі збереженням об'єктивного реагування в конфліктній ситуації. На відміну від Пірацетаму (психостимулятор), Фенотропіл стабільно у всіх досліджуваних дозах поліпшував психоемоційний стан і спричиняв співрозмірну консолідуючу дію на всі компоненти психоемоційних реакцій, проявляючи і знеболюючий ефект. Враховуючи високу нейролептичну, ноотропну і мнемотропну, адаптогенну активність, специфічний вплив на ВТКП і результати даного досліду, можна говорити про те, що ефекти, які виникають з модуляторної активності, більш органічні, ніж ефекти стимуляторів і пригнічуючих засобів. Виражені відмінні ефекти від Фепірону (транквілізатор) і Пірацетаму (психостимулятор) вказують на те, що препарат здатний бути ефективним при біполярних психічних розладах, а також проявляти знеболюючий ефект при болях різної етіології та генезу, а також проявляти справжні адаптогенні властивості. Приклад 17: Результати досліджень на середню тривалість життя (СТЖ) безпородних білих мишей обох статей при роздільному режимі утримання (самок і самців) представлені в таблиці 17. У групи (по 30 мишей, по 15 самок і 15 самців) були включені миші віком 610 днів без зовнішніх ознак гострих і хронічних захворювань. Відповідно до багаторічних статистичним спостереженням середня тривалість життя мишей становить 1,5-2,0 року, що відповідає 547-730 календарним дням. Фенотропіл в дозах 50, 100, 200 і 300 мг/кг з дистильованою водою вводили перорально один раз на добу в ранкові години протягом усього періоду життя мишей. Контрольна група одержувала дистильовану воду і друга контрольна крупа не піддавалася експериментальному впливу, щоб виключити або оцінити вплив експериментального стресу при впливі процедури введення в організм речовин. Перша серія досліджень не мала успіху у зв'язку з ураженням мишей в контрольних групах респіраторною вірусною інфекцією (грип, джерело було встановлене) через десять днів після початку експерименту, але виявила противірусну та протизапальну активність Фенотропілу. У контрольних групах загинули всі тварини. У групах на фоні Фенотропілу сукупно загинуло 15 % мишей. З тих, що вижили мишей, 46 % не захворіли, а 54 % перехворіли, але вижили. Відмінностей впливу за статевою ознакою не виявлено. За результатами досліджень впливу Фенотропілу на середню тривалість життя мишей (таблиця 17) в контрольних групах без змін і отримувавших щодня перорально дистильовану воду достовірних відмінностей за СТЖ не виявлено (різниця склала в межах 3,0 %), що вказує на відсутність експериментально стресуючих факторів при проведенні досліджень. Введення 27 UA 111981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фенотропілу в дозах нижче 50,0 мг/кг сприяло підвищенню СТЖ в межах 8,0-10,0 % і ці дані не були включені в таблицю у зв'язку незначності результату для поставлених цілей. Відомо, що в межах 10,0 % впливають на СТЖ тварин адаптогени рослинного походження (В.Є.Чернілевський, В.Н.Крутько. Історія вивчення засобів продовження життя. Ж. Профілактика старіння, вип.3, 2000р.), які фактично є психостимуляторами з накопичувальним ефектом (ефект проявляється при тривалих курсах застосування). Фенотропіл характеризувався достовірним впливом на тривалість життя мишей обох статей при введенні в дозах 50, 100, 200 і 300 мг/кг. СТЖ була достовірно вище, ніж у групі дослідного контролю та контролю без досліду. По відношенню до дослідного контролю СТЖ мишей збільшилася на 15,3 %, 29,3 %, 12,5 % і 19,6 % відповідно, що відповідало 12, 20,6, 9,3 і 6,24 % у порівнянні з контролем без досліду. Найбільший ефект за показником СТЖ був отриманий в даній серії досліджень на фоні застосування Фенотропілу при дозі 100 мг/кг. Необхідно відзначити, що на фоні тривалого курсового застосування Фенотропілу при дозі 300 мг/кг, візуально миші виглядали дещо "неохайними" і дещо менш активними. Статистично достовірної різниці між СТЖ самок і самців не виявлено, що вказує на відсутність вибірковості реювенаціонної активності з'єднання і у відношенні статі тварин за показниками СТЖ. Приклади 18: Максимальна тривалість життя (МТЖ) мишей відповідно до наших багаторічних статистичних спостережень складає 2,7-3,2 роки, тобто в середньому 2,95 року або 1077 календарних днів. Для даного дослідження в групи (по 10 особин) відбиралися миші-самці домінантної поведінки в змішаних групах, які благополучно дожили до 985 днів без ознак вираженого старіння і з задовільним орієнтовно-дослідною поведінкою, що визначається за методикою "відкрите поле". Фенотропіл в дозах 25, 50 і 100 мг/кг вводили перорально з 5,0 % розчином глюкози. Розчин глюкози використовували виключно в цілях підвищення розчинності препарату. Одна контрольна група отримувала розчин глюкози і друга - дистильовану воду. Третя контрольна група не піддавалася впливу. Результати дослідження представлені в таблиці 18. Контрольні тварини всіх трьох груп, незважаючи на збалансований корм і хороші умови утримання і догляду, не пережили виявлену раніше межу МТЖ. Макроскопічне дослідження при розтині виявило у 95,0 % самців контрольних груп спонтанні пухлини різних органів, тобто навіть спеціально відібрані "довгожителі" фактично були приречені помирати не без участі шкідливого дії канцерогенезу (таблиця 18.1). На фоні застосування Фенотропілу значимо збільшилася тривалість життя у всіх експериментальних групах, яка в середньому склала 22,0 %. Найбільший ефект (таблиця 18) виявлено на фоні застосування Фенотропілу в дозах 25 мг/кг (на 23,3 %) і 100 мг/кг (на 24,0 %). Поширеність і вираженість спонтанних пухлин у мишей з Фенотропілом була значно нижче (у 2,37 рази) при дозі 100 мг/кг (таблиця 18.1). При вибірці в 30 особин в сукупності по трьом групам, можна говорити про високу вірогідність результатів. Фенотропіл впливає на максимальну тривалість і якість життя тварин з включенням не тільки функціональних ланок різного рівня, але і генетичної ланки, перешкоджає розвитку онкогенезу. Попередження розвитку феноптозу вказує на те, що він попереджає розвиток апоптозу та органоптозу, так як без сукупності всіх трьох компонентів неможливо отримати позитивний результат за МТЖ. Дослідження впливу Фенотропілу на масу тіла при курсовому інтрагастральному введенні протягом місяця проводили при дозах 25, 50, 100, 200 і 300 мг/кг/добу у білих безпородних щурів обох статей з вираженими ознаками ожиріння (380-430 г) без зміни режиму харчування і поведінки. Кожна тварина розміщувалась в звичайну окрему клітку. Реєстрували масу тіла, об'єм споживаної води та корму за добу. На фоні Фенотропілу об'єм споживаного корму та води не змінився, але маса тіла тварин (таблиця 18.2) залежно від дози препарату достовірно змінювалася. Поведінка тварин також ставала активнішою. Фенотропіл не проявляє анорексигенної дії, як вважали раніше. Його вплив при ожирінні проявляється слендерною, а не анорексигенною активністю. Слендерний ефект по зниженню маси тіла склав відповідно 14, 25, 33,3, 35 і 32 % по відношенню до контрольної групи тварин, які отримували дистильовану воду. Приклад 19: Вивчення впливу Фенотропілу на фертильність мишей проведено у весняний період на самках віком 510 днів (по 30 особин в групі). Закінчення репродуктивного віку яких встановлювалося шляхом підсадки кожних трьох самок до фертильного самця. Покриття встановлювали за наявністю вагінальних пробок. Не покритих протягом місяця самок включали в дослідження. Протягом усього періоду дослідження (32 дні) один раз на добу дослідній групі інтрагастрально вводився Фенотропіл при дозі 100 мг/кг з дистильованою водою, контрольній 28