Спосіб продукції флавінмононуклеотиду (фмн)

Реферат: Винахід належить до способу продукції флавінмононуклеотиду (ФМН), що включає культивування штаму-продуцента дріжджів ІMB Y-5028 Candida famata у модифікованому культуральному середовищі Беркгольдера. UA 100199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі біотехнології і є способом оптимізації умов культивування для отримання флавінмононуклеотиду (ФМН) за допомогою рекомбінантного штаму дріжджів Candida famata. 5'-ФМН (рибофлавін-5'-фосфат) відіграє важливу роль як коензим у різноманітних ферментативних реакціях у живих організмах і є ефективним засобом профілактики і лікування захворювань, пов'язаних із порушенням біосинтезу цієї сполуки. 5'-ФМН у промислових масштабах отримують шляхом фосфорилювання рибофлавіну (РФ) хімічними агентами [1], що призводить до одержання препарату, який містить побічні продукти, що можуть діяти як антивітаміни і/або як антагоністи РФ. Очищення ФМН від домішок є складним завданням. Крім того, препарату ФМН, отримані таким способом, є дуже дорогими, що знижує можливості їх широкого використання у практиці. Іншими шляхами отримання ФМН є мікробні ферментаційні процеси [2]. Препарати ФМН, отримані ферментативним способом, можуть знайти застосування як лікарські препарати, які не містять домішок із невстановленою біологічною активністю, як барвник для харчової промисловості, як компонент системи біолюмінесцентного аналізу, як реактив високого ступеня чистоти, а також як проміжний продукт для отримання флавінаденіндинуклеотиду та його похідних. Жодних природних штамів мікроорганізмів, здатних до надсинтезу ФМН, до цього часу не знайдено. Сконструйовано штами дріжджів С. famata, які, внаслідок заміни нативного промотора гена FMN1 на сильний промотор TEF1 (фактора елонгації трансляції α1), здатні до нагромадження у культуральній рідині ФМН [3, 4]. Найбільш близьким до запропонованого є спосіб підвищення продукції ФМН рекомбінантним штамом С. famata 13-76 шляхом оптимізації складу середовища, описаний [5], в якому за допомогою методів математичного моделювання експериментів встановлено, які компоненти середовища є важливими для синтезу ФМН, та підібрано концентрації цих компонентів, що забезпечують підвищення продуктивності утворення ФМН даним штамом. Нами сконструйовано рекомбінантний штам ІMB Y-5028 С. famata [4], здатний до синтезу більшої кількості ФМН, проте навіть в оптимізованому для штаму С. famata 13-76 середовищі продукція ФМН сконструйованим штамом є недостатньою для промислового виробництва цього нуклеотиду. В основу запропонованого способу поставлена задача підібрати концентрації компонентів середовища (за допомогою методу математичного моделювання експериментів) і визначити оптимальні параметри культивування (густина культури, час вирощування, температура, рН) для максимального синтезу ФМН штамом-надпродуцентом ІMB Y-5028 C. famata. Поставлена задача вирішується тим, що у способі підвищення продукції ФМН, який включає підбір концентрацій компонентів середовища за допомогою методу математичного планування експериментів, згідно з винаходом для максимального синтезу ФМН штамом-надпродуцентом ІMB Y-5028 С. famata додатково визначають оптимальні параметри культивування (густина культури, час вирощування, температура, рН). Запропонований спосіб забезпечує високу продуктивність синтезу ФМН і скорочує час ферментації. Спосіб підвищення продукції ФMH ілюструється графічним матеріалом, на якому зображено вміст ФМН у культуральній рідині рекомбінантного штаму С. famata ІMB Y-5028 при різному часі культивування. У запропонованому способі використовуються наступні методи: центральний композиційний аналіз [6], програмний пакет Statistica® 6.0 Stat Soft, Inc. Вміст флавінів у культуральній рідині визначають на флюорометрі. Вміст ФМН у культуральній рідині визначають флюорометрично після хроматографічного розділення в 5 % Na2HPO4. Спосіб здійснюють кількома етапами. Етап 1. Визначення густини культури, найбільш сприятливої для синтезу ФМН штамом C. famata ІMB Y-5028. При засіві 0,10 мг/л тривалість культивування, яка забезпечує утворення ФМН, становить 48-60 год. Інкубація густої суспензії клітин забезпечує скорочення часу культивування культури для максимального нагромадження ФМН. Густину культури, найбільш сприятливу для синтезу ФМН штамом С. famata ІMB Y-5028, визначають при інкубації клітин у рідкому модифікованому середовищі Беркгольдера наступного складу (г/л): сахароза - 20; сечовина - 1; КН2РО4 - 4,277; MgSO4·7H2O - 0,2; СаСl2 2,786; (NH4)6Mo7O24·4H2O - 0,253; CuSO4·5H2O - 0,0025; дріжджовий екстракт - 3,205; а також біотин - 1 мг/л; мікроелементи у кінцевій концентрації: 0,2 мкМ CuSO 4; 4,5 мкМ MnSO4; 2,0 мкМ NaMоO4, 0,75 мкМ Н3ВО3; 17,5 мкМ ZnSO4 [4]. Частота перемішування становить 220 об./хв., температура - 28 °C, час інкубації - 17 год. 1 UA 100199 C2 Біосинтез ФМН за умов такої інкубації помітно залежить від початкової концентрації клітин у середовищі (Таблиця 1). Таблиця 1 Вміст флавамінів у культуральній рідині рекомбінантного штаму ІМВ Y-5028 С. famata при різній початковій густині клітин Густина клітин, мг/мл 2,0 3,0 5,0 7,5 5 10 15 20 Сумарний вміст флагінів, мг/л 155,6±0,55 332,5±0,53 328,7±0,98 376,4±1,00 ФМН, мг/л 83,9±0,22 195,5±0,41 188,0±0,81 176,9±0,55 % ФМН 53,9±5,03 58,8±2,38 57,2±1,39 47,0±4,73 Р < 0,05. Сумарний вміст флавінів зростає відповідно до зростання густини суспензії, однак, вміст ФМН є максимальним при інкубації 3 мг/мл клітин протягом 17 год. у модифікованому СБ. При цьому відсотковий вміст ФМН також є найвищим при інкубації 3 мг/л клітин. Етап 2. Визначення часу культивування для максимального синтезу ФМН штамом C. famata ІMB Y-5028. Час культивування визначають при інкубації 3 мг/мл клітин у рідкому модифікованому середовищі Беркгольдера [4] із частотою перемішування 220 об/хв та температурою 28 °C. Загальний час інкубації клітин штаму ІMB Y-5C28 C. famata становить 48 год. Як видно на наведеному графіку, синтез ФМН досягає максимального рівня - 218,2±7,73 мг/л на 21 год. інкубації 3 мг/мл клітин. Етап 3. Визначення вплину температури, рН та перемішування на біосинтез ФМН штамом C. famata ІMB Y-5028. Вплив температури та рН на біосинтез ФМН штамом С. famata ІMB Y-5028 визначають при інкубації 3 мг/мл клітин у рідкому модифікованому середовищі Беркгольдера [4] із частотою перемішування 220 об/хв, час інкубації - 21 год. (Таблиця 2). Температура культивування має суттєвий вплив на рівень синтезу ФМН. Найкращою для продукції ФМН є температура 28 °C. Вплив рН на синтез ФМН не є настільки суттєвим, як вплив температури, оптимальним значенням рН є 5,5. Таблиця 2 Вміст ФМН (мг/л) у культуральній рідині штаму C. famata ІMB Y-5028 з умов інкубації при різних значеннях температури (t, °С) і рН рН/t,°С 24 28 35 38 42 3,5 101,0±5,22 190,1±7,21 43,0±4,12 19,0±2,11 9,3±2,22 4,0 104,0±9,08 194,0±8,99 44,0±3,55 20,0±3,33 9,9±1,01 4,5 139,0±9,89 205,0±2,11 40,0±3,09 15,5±3,24 11,0±2,10 5,0 146,8±9,89 205,1±7,68 40,0±1,12 13,3±4,05 11,6±8,67 5,5 201,1±5,31 209,0±5,54 33,8±2,11 11,6±2,11 4,4±0,09 6,0 206,0±6,51 196,9±5,76 22,2±3,22 12,2±1,09 2,2±1,09 25 30 35 Найвищий рівень синтезу ФМН спостерігається при помірному перемішуванні. Серед дослідженої частоти перемішування (100, 220 та 300 об/хв), найбільше ФМН (205 мг/л) синтезується при 220 об/хв. Етап 4. Оптимізація концентрації компонентів середовища культивування для максимального нагромадження ФМН штамом С. famata ІMB Y-5028. Для з'ясування, які концентрації компонентів середовища є важливими для підвищення рівня синтезу ФМН, застосовують методи математичного моделювання експериментів, зокрема, центральний композиційний аналіз. Цей процес включає наступні етапи: постановка відповідного експерименту, обчислення коефіцієнтів математичної моделі, а також передбачення відповіді та перевірка адекватності моделі. Використовують компоненти середовища, які, як було встановлено [4], мають позитивний вплив на продукцію ФМН. Кожен із досліджуваних компонентів використовують в експериментах у 5 різних концентраціях (Таблиця 3), що умовно позначаються "-2", "-1", "0", "1", "2". 2 UA 100199 C2 5 Схема матриці, експериментальні значення та теоретично розраховані значення відображено у табл. 4. Для статистичних маніпуляцій компоненти закодовані згідно з наступним рівнянням: x  x0 , Xi  i xi де X i - кодоване значення не залежної змінної xi , xi - дійсне значення незалежної змінної, x 0 - дійсне значення незалежної змінної в центральній точці, xi - покрокова різниця. Таблиця 3 Позначення та концентрації компонентів середовища для центрального композиційного аналізу з метою оптимізації синтезу ФМН штамом С. famata ІMB Y-5028 Позначення Компоненти середовища Некодовані Кодовані КН2РО4 х1 X1 СаСl2·6Н2О х2 Х2 (NH4)6Mo7O24·4Н2О х3 Х3 CuSO4·5H2O х4 Х4 Дріжджовий екстракт х5 Х5 -2 3,0000 1,5000 0,1500 0,0015 1,500 Концентрація, г/л -1 0 1 4,0000 5,0000 6,0000 2,0000 2,5000 3,0000 0,2000 0,2500 0,3000 0,0020 0,0025 0,0030 2,0000 2,5000 3,0000 2 7,0000 3,5000 0,3500 0,0035 3,5000 10 15 20 25 30 Вплив кожного компонента, їх взаємодія та статистичний аналіз отриманих передбачуваних значень визначають згідно рівняння: 2 Y=β0+ΣβіХі+ΣβіjXiXj+ΣβiіXi , де Y - передбачувана відповідь, β0 - компенсаційний коефіцієнт, βі - лінійний вплив, βiі - квадратичний вплив, βіj - ефект взаємодії, Xі та Xj - рівні незалежних змінних. Статистичний аналіз моделі здійснюють за допомогою пакету статистики ANOVA. Для цих процедур використовують програмний пакет Statistica® 6.0 Stat Soft, Inc. -1 Матриця для центрального композиційного аналізу представляє 25 план факторного експерименту із дробними репліками, що включає 11 центральних значень та 10 аксіальних значень, де одна варіанта взята в екстремальному значенні (+2 або -2), а інші - у центральних значеннях. Експериментальні дані, наведені у Таблиця 4, є поліноміальною моделлю нелінійної регресії другого порядку. Емпіричні взаємодії між відзивом та аналізованими варіантами описуються поліноміальним рівнянням другого порядку: 2 2 2 Y=334,448-7,356Х1+6,990Х2-4,560Х3+2,315Х4+15,148Х5-1,803Х1 -3,453Х2 -4,690X3 2 2 0,153Х4 +1,772Х5 -14,678Х1Х2-7,666Х1Х3-3,541Х1Х4+0,034Х1Х5+6,566Х2Х3+0,653Х2Х4+4,641Х2Х50,722Х3Х4+0,928Х3Х5+5,603Х4Х5 де Y - очікуване значення продукції ФМН (мг/л), а X1, Х2, Х3, Х4 та Х5 - кодовані значення компонентів (КН2РО4, СаС12, (NН4)6Мо7О24, CuSO4 та дріжджовий екстракт, відповідно). 35 3 UA 100199 C2 Таблиця 4 Матриця для центрального композиційного аналізу та продукція ФМН штамом C. famata IMB Y-5028 як результат аналізу № п/п 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 5 10 X1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 1 1 1 -2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Концентрації компонентів Х2 Х3 Х4 -1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 1 -1 1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 1 -1 1 1 1 -1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 -2 0 0 2 0 0 0 -2 0 0 2 0 0 0 -2 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ФМН, мг/л Експериментальні 309,1 309,6 299,2 322,8 337,1 381,1 375,7 353,7 342,6 351,4 305,8 285,4 330,6 300,9 297,6 328,3 333,3 317,9 321,8 316,3 317,9 310,2 327,3 337,1 293,7 386,1 336,1 336,6 341,5 336,6 333,3 333,3 336,6 341,5 323,4 325,0 336,1 X5 1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 -2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Прогнозовані 313,3 306,0 298,1 329,8 325,0 377,1 374,1 344,3 342,4 359,3 316,1 288,0 329,9 292,4 291,6 330,5 341,9 312,5 306,7 334,6 324,8 306,6 329.2 338,5 311.2 371,8 334,4 334,4 334,4 334,4 334,4 334,4 334,4 334,4 334,4 334,4 334,4 Центральний композиційним аналіз та аналіз "на поверхні відзиву" дали змогу визначити оптимальні для синтезу ФМН концентрації компонентів середовища, а саме: КН2РО4 - 4,999 г/л; СаСl2·6Н2О - 2,600 г/л; (NH4)6Mo7O24·4H2O - 0,240 г/л; CuSO4·5H2O - 0,0013 г/л; дріжджовий екстракт - 2,198 г/л. Прогнозований максимум продукції ФМН згідно з цими значеннями становив 328,25 мг/л. Порівняно зі складом середовища, використаного раніше [4], дане оптимізоване середовище містить на 15 % більше КН 2РО4, на 7% менше СаСl2, на 5% менше (NH4)6Mo7O24, вдвічі менше CuSO4 та на 31% менше дріжджового екстракту. Для перевірки даних центрального композиційного аналізу 3 мг/мл клітин дріжджів інкубували у 100 мл колбах, що містять 10 мл середовища оптимізованого складу (згідно прогнозованих даних моделі) (г/л): сахароза - 20; сечовина - 1; КН2РО4 – 4,999; MgSO4·7H2O 0,2; СаСl2 - 2,600; (NH4)6Mo7O24·4H2O - 0,240; CuSQ4·5H2O - 0,0013; дріжджовий екстракт - 2,198; а також біотин - 1 мг/л; мікроелементи у кінцевій концентрації: 0,2 мкМ CuSO 4; 4,5 мкМ MnSO4; 4 UA 100199 C2 5 10 15 20 2,0 мкМ NaMoO4, 0,75 мкМ Н3ВО3; 17,5 мкМ ZnSO4. Частота перемішування становила 220 об/хв, температура - 28 °C, час інкубації - 21 год, рН 5,5. Результати, отримані у трьох окремих експериментах, були близькими до прогнозованих результатів. Передбачувана продукції ФМН становила 328,25 мг/л, тоді як експериментально отримано 318,2±7,411 мг/л ФМН. Це підтверджує достовірність теоретичної моделі. Джерела інформації: 1. Березовский В.М. Химия витаминов. - М.: Пищевая промышленность, 1973. - 632 с. 2. Stahmann K.P. et al. Microbiol. and Biotechnol. - 2000. - Vol.53, N5 - P. 509-516. 3. Патент України на винахід № 87684 МПК С12Р25/00, С12N15/00, опублік. 10.08.2009 p. 4. Yatsyshyn V.Y. et al. Metabol. Eng. - 2009. - Vol. 11, №. 3. - P. 163-167. 5. Yatsyshyn V.Y. et al. Biochem. Eng. J. - 2010. - Vol. 49, № 1. - P. 52-60. 6. Montgomery D.С Design and Analysis of Experiments / D.С Montgomery. - [4-th edn.]. - NY: Wiley, 1997. - 196 p. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Спосіб продукції флавінмононуклеотиду (ФМН), що включає культивування штаму-продуцента IMB Y-5028 Candida famata у культуральному середовищі, який відрізняється тим, що культивують штам-продуцент у середовищі наступного складу в г/л: сахароза - 20; сечовина - 1; KH2PO4 - 4,999; MgSO4 7H2O - 0,2; CaCl2 - 2,6000; (NH4)6Mo7O24 4H2O - 0,240; CuSO4 5H2O 0,0013; дріжджовий екстракт - 2,198; а також біотин - 1 мг/л; мікроелементи у кінцевій концентрації: 0,2 мкМ CuSO4; 4,5 мкМ MnSO4; 2,0 мкМ NaMoO4, 0,75 мкМ Н3ВО3; 17,5 мкМ ZnSO4, при початковій густині культури 3 мг/мл, температурі 28 С, рН середовища 4,5-5,5 та часі інкубації 21 год. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5