Застосування 3-(8-оксихінолін-5-іл)пропанової кислоти, іммобілізованої на поверхні кремнезему, для визначення вільного zn2+ люмінесцентним методом

Реферат: 2+ Винахід належить до галузі визначення вільного Zn застосуванням 3-(8-оксихінолін-5-іл)пропанової кислоти, кремнезему. люмінесцентним методом з іммобілізованої на поверхні UA 102781 C2 (12) UA 102781 C2 UA 102781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Винахід відноситься до застосування 3-(8-оксихінолін-5-іл)пропанової кислоти в аналітичних 2+ та діагностичних цілях для визначення вільного цинку Zn люмінесцентним методом в 2+ 2+ + 2+ 2+ 2+ присутності Са , Mg , Na , Cu , Co та Ni шляхом її іммобілізації на поверхні пірогенного кремнезему. Цинк є дуже важливим елементом для життєдіяльності. В організмі людини за даними [1] присутнє приблизно 3000 протеїнів, що містять у своєму складі молекулу цинку(ІІ). У вільному стані цинк зустрічається при його переміщенні через цитоплазму та внутрішньоклітинні мембрани [1]. Кількість цинковмісних протеїнів у клітині пікомолярна, що вказує на вкрай незначну концентрацію цинку у клітині. Проте для еукаріотичних клітин концентрація цинку може досягати мілімолярної кількості, за рахунок присутності лізосоми, які ще називають "помешканням" цинку. Загальна ж концентрація цинку в таких клітинах складає декілька сот мікромолів, що можна вважати високою концентрацією. Реєстрація вільного цинку всередині клітини та на її мембрані є вкрай важливою задачею для розуміння міграції цинку та діагностуванні певних патологій клітини. Відомими запатентованими речовинами для аналітичного флуоресцентного визначення цинку [2] є складні ароматичні системи. Речовини виконують свою функцію завдяки координації циклічного чи поліаміну до вільного іону цинку(ІІ). Першим недоліком даних речовин є дуже складний синтез. Другий недолік це можливість визначення цинку тільки у відібраній пробі, адже після аналізу речовину не можна видалити зі зразку, що унеможливлює визначення цинку(ІІ) безпосередньо на мембрані клітини. Також для визначення вільного цинку (II) люмінесцентним методом застосовують карбонатангіндразу II виділену з людського організму [3]. Недоліком даної речовини можна вважати дуже високу ціну отримання та очистки, а також те, що визначення цинку(II) заважають 2+ 2+ 2+ інші метали Cu , Со , Ni . Найбільш близькими до запропонованого винаходу є застосування ряду речовин [4] на основі 8-гідроксихіноліну для аналітичного визначення цинку(II). Ядро 8-гідроксихіноліну проявило чудові аналітичні характеристики для визначення вільного цинку(II), проте суттєвими недоліками прототипного винаходу порівняно з запропонованим є: 1) запропоновані речовини відрізняються складною синтетичною частиною; 2) усі запропоновані речовини легко переходять в аналітичне середовище, що унеможливлює визначення цинку безпосередньо на мембрані клітини. В основу винаходу поставлено задачу більш простого та дешевого синтезу речовини, що буде гарним люмінесцентним сенсором на іон цинку(И). А також вирішення проблеми визначення цинку безпосередньо на мембрані клітини. Поставлена задача вирішується шляхом іммобілізації 3-(8-оксихінолін-5-іл)пропанової кислоти на наночастинках пірогенного кремнезему - аеросилу, що дозволяє збільшити константу зв'язування цинку і зменшити граничну концентрацію визначення цинку. Також при даному підході люмінесцентний сенсор хімічно утримується на поверхні аеросилу, що унеможливлює його перехід в аналітичне середовище. Саме така сукупність суттєвих ознак є необхідною і достатньою для досягнення технічного результату - створення нового флуоресцентного сенсора для визначення вільного цинку. Приклад реалізації способу. Приклад. Схема І ілюструє хід синтезу речовини. До реактора помістили 0,14 г (0,65 ммоль 30 % надлишок) 3-(8-оксихінолін-5-іл)пропанову кислоту і залили 10 мл ДМФА та витримали до повного розчинення. До отриманого розчину додали двократний надлишок CDI (карбодіімідазол) для активації карбоксильної групи у реакції нуклеофільного заміщення. Схема I HO N O N O O H2N O N N HN OH N Si N N N N OH OH 50 1 Si UA 102781 C2 5 10 Реакційну суміш витримували, інтенсивно перемішуючи та нагріваючи до 80 °C протягом 1 год. Після цього до розчину додали 1,0 г аміноповерхні. Реакційну суміш інтенсивно перемішували і нагрівали на масляній бані протягом ще 4 годин. Після чого суміш охолодили, відфільтрували та кілька разів промили на скляному фільтрі ДМФА. Після цього відмили в екстракторі "Сокслета". Отриману речовину висушили на повітрі, а потім у сушильній шафі протягом 2 годин при температурі 110 °C. Концентрація іммобілізованого сенсора встановлена методом ізотермічної гравіметрії і дорівнює - 0,31 ммоль/г. Люмінесцентні спектри та спектри збудження отримані при рН 7,4 у буферному розчині, який 2+ 2+ + + моделює зовнішньо клітинне середовище (рН7.4, 2mM Ca , 2mM Mg , 4.8mM K , 140mM Na , 150mМ СІ ).На фіг. 1 представлений спектр поглинання синтезованих люмінесцентних систем. На фіг. 2 представлений ЕПР спектр комплексів купруму(II), що є додатковою характеристикою синтезованої речовини. Розраховані параметри ЕПР спектра наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Комплекс L-Cu dII 2,225 g┴ 2,053 g0 2,110 4 -1 АIIх10 см 190 15 20 25 30 На фіг. 3 представлені спектри люмінесценції синтезованих речовин у присутності катіонів 2+ 2+ 2+ 2+ 3 металів Си , Со , Mn , Zn у концентрації 10- моль/л. Як видно, тільки іон цинку запалює 2+ люмінесценцію сенсора, що є запорукою селективності визначення Zn . На фіг. 4 представлений люмінесцентний спектр, збуджений при 325 нм, синтезованого сенсора в залежності від концентрації цинку, а на фіг. 5 представлена залежність інтенсивності сигналу від концентрації цинку на довжині хвилі 525 нм. Таким чином синтез запропонованого біосеносора є легким і дешевим, а аналітичні характеристики є набагато вищими за наявні аналоги. Джерела інформації: 1. Vallee B.L., Falchuk K.H. The biochemical basis of zinc physiology // Physiological Rev.-1993. Vol. 73, No. 1. - P. 79-118. 2. Pat. Us 7,074,823 B2 United States patent. Fluorescent Probe for Zinc / Nagano Т., Kikuch K., Hirano Т.; Assignee Daiichi Pure Chemicals CO., LTD, Tokyo (JP)- 11.07.2006. 3. Pat. Publication US 2004/0185518 Al United States patent. Excitation Ratiometric Flurescent Biosensor For Zinc Ion at Picomolar Levels / Thompson R., Cramer M, Fierke C.F., Zeng H.H., Bozym R.; 23.09.2004 4. Pat. US 7,589,209 B2 United States patent. 8 hydroxyquinoline tripodal metal ion probes / Canary J.W., Royzen M.; Assignee New York University, New York, NY (US). - # US2005/0227365 Al; 23.03.05; 13.10.05. 35 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Застосування 3-(8-оксихінолін-5-іл)пропанової кислоти, іммобілізованої на поверхні кремнезему, 2+ для визначення вільного Zn люмінесцентним методом. 2 UA 102781 C2 3 UA 102781 C2 5 4 UA 102781 C2 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5