Протигрипозний засіб аргентум біс(цитрато)германат

Реферат: Винахід належить до координаційних полімерів, а саме до протигрипозного засобу аргентум біс(цитрато)германату, що виявляє противірусну активність та може використовуватись в фармацевтичній промисловості для розробки протигрипозних препаратів. Винахід стосується UA 112912 C2 (12) UA 112912 C2 низькотоксичного протигрипозного засобу аргентум біс(цитрато)германату з формулою {[Ag2Ge(HCitr)2(H2O)2]·2H2O}n і будовою: O C H2 C O C O C O O Ag O C Ge C HO O O C H2 C Ag O O CH2 C O CH2 C OH . UA 112912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до координаційних полімерів, а саме до аргентум біс(цитрато)германату, що виявляє противірусну активність, та може використовуватись в фармацевтичній промисловості для розробки протигрипозних препаратів. Біологічно важливий мікроелемент германій необхідний для забезпечення нормальної життєдіяльності організму. Він є незамінним ультрамікроелементом, що приймає участь в глобальних біохімічних процесах живої клітини, що обумовлює широкий спектр біологічної дії його органічних сполук: протипухлинної, імуномодулюючої, противірусної, антиоксидантної, тощо [1]. Однак, германійорганічні сполуки характеризуються низькою розчинністю у воді і підвищеною токсичністю. Сполуки, що містять іони аргентуму (срібла) достатньо давно використовують в медицині як протимікробні засоби. Це такі відомі препарати, як ляпіс (аргентум нітрат), протаргол, коларгол, що застосовують зовнішньо для обробки ран, лікування кон'юнктивітів, екзем; перорально в комплексі засобів для лікування респіраторних інфекцій, гастроентеритів, дизентерії та ін. Протимікробна активність срібла пов'язана з біохімічною, каталітичною та комплексоутворюючою дією іонів срібла на бактеріальні білки, ферменти, мембранні структури [2]. Суттєвим є той факт, що токсичність цих сполук для вищих організмів на 5-6 порядків менша, ніж для нижчих (простіших, бактерій, вірусів). Тобто, концентрації срібловмісних сполук, що викликають загибель мікроорганізмів, не спричиняють токсичного впливу на людину. Загальним недоліком препаратів срібла, як у вигляді колоїдних розчинів, так і з використанням металічного срібла, є низька агрегаційна стійкість розчинів, а також недостатня біодоступність його іонів [2]. Ці недоліки можна усунути, якщо вводити германій та аргентум у вигляді металокомплексів. Відомо, що введення в організм біометалів у вигляді координаційних сполук (екзогенних комплексів), тобто у формі, найбільш наближеній до тієї, в якій метали знаходяться в біологічних системах, призводить до виконання цими сполуками функцій біокоординаційних сполук природного походження (ендогенних комплексів). Такі екзогенні комплекси металів завжди менш токсичні, ніж неорганічні і органічні сполуки, їх введення дозволяє ефективно регулювати концентрацію біометалів в органах в необхідній організму формі, транспортувати лікарський засіб до джерела хвороби. Особливо ефективними є координаційні сполуки біометалів з біологічно активними органічними лігандами - природними метаболітами людського організму. До них відноситься лимонна кислоти, яка є безпосереднім учасником циклу трикарбонових кислот (циклу Кребса), сприяє прискоренню метаболізму, поліпшує енергетичний обмін, нормалізує діяльність психо-, нейро-, ендокринної та імунної систем [3]. Пандемії та епідемії грипу завжди спричиняли значні ушкодження здоров'ю населення. На протязі двадцятого сторіччя було зареєстровано три пандемії грипу А людей: 1918, 1957 та 1968 років, які були викликані різними антигенними підтипами (H1N1, H2N2 та H3N2 відповідно) і призвели до загибелі значної кількості людей [4]. Саме тому пошук нових противірусних засобів серед сполук з різними структурними характеристиками є вкрай актуальним завданням науковців. Пошук металокомплексів, які будуть проявляти противірусну активність, підтверджує перспективність їх використання у медицині. Відомі етіотропні хіміотерапевтичні засоби проти грипу за рекомендаціями ВООЗ - це похідні адамантанового ряду (амантадин, ремантадин) [5]. Недоліком цих препаратів є суттєві обмеження при застосуванні: серцева недостатність, артеріальна гіпотензія, психомоторне збудження, захворювання печінки та нирок, вагітність та годування груддю. Як противірусні засоби використовують також інгібітори нейрамінідази (занамівір, озельтамівір) [5], недоліком яких є алергічні реакції. До того ж, переважна більшість людських ізолятів вірусів грипу набувають стійкості до дії цих найбільш розповсюджених протигрипозних препаратів - ремантадину, озельтамівіру [6, 7]. Найбільш близьким за протигрипозною дією є препарат таміфлю (прототип), який є органічною сполукою, що не містить іону металу. Недоліком цього препарату є ціла низка побічних дій (печінкова недостатність, екзема, бронхоспазм, токсичний епідермальний некроліз, носова кровотеча та ін.), що обумовлені його підвищеною токсичністю. Задачею, на рішення якої спрямований винахід, є створення сполуки з низькою токсичністю та вираженою противірусною активністю. Поставлена задача вирішується протигрипозним засобом аргентум біс(цитрато)германатом, який є координаційним полімером з різними металами і карбоксилатним лігандом та відрізняється наявністю в молекулі двох біометалів (германій, аргентум) і біологічно активного ліганду (лимонна кислота) з формулою {[Ag2Ge(HCitr)2(H2O)2]·2H2O}n і будовою: 60 1 UA 112912 C2 O C H2 C O C O 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 C O O Ag O C Ge C HO O O C H2 C Ag O O CH2 C O CH2 C OH . Одержання аргентум біс(цитрато)германату здійснюється наступним чином: до суміші наважок 1,046 г (0,01 моль) діоксиду германію GeO 2 (99,999 %, Aldrich) і 4.2 г (0,02 моль) моногідрату лимонної кислоти С6Н8О7·Н2О (99 %, Aldrich) додають 400 мл води, кип'ятять до повного розчинення реагентів і упарюють на водяній бані до об'єму 25 мл (~ 4 години, 80 °C). Потім в охолоджений до кімнатної температури розчин при постійному перемішуванні вносять 3,4 г (0,02 моль) аргентум нітрату AgNO3. Осад білого кольору, що випав, через три доби відокремлюють на фільтрі Шотта, промивають холодною водою і сушать на повітрі при 2025 °C. Вихід продукту - 60 %. Ідентифікацію та дослідження фізико-хімічних властивостей аргентум біс(цитрато)германату проводили на кафедрі загальної хімії та полімерів ОНУ імені 1.1. Мечникова. Вміст металів визначали методом атомно-емісійної спектроскопії з індуктивно зв'язаною плазмою на приладі Optima 2000 DV фірми Perkin Elmer, карбону та гідрогену - за допомогою напівавтоматичного С, N, Н-аналізатора. Знайдено, %: С - 19,44; Η - 2,39; Ge-9,80; Ag-29,33. Для C12H18O18Ag2Ge розраховано, %: С 19,50; Η - 2,44; Ge-9,83; Ag-29,25. -1 ІЧ спектр поглинання (400-4000 см ) комплексу у вигляді таблеток з КВr записували на спектрофотометрі Frontier фірми Perkin Elmer. -1 ІЧ-спектр (ν, см ): 3442 ν(Η2Ο), 1702 v(C=O), 1681, 1598 νas(COO ), 1644 δ (Η2Ο), 1450, 1404 νs(COO ), 662, 628, 588 ν(Ge-O). В ΙЧ-спектрі комплексу спостерігали інтенсивні смуги ν(H2O) і δ(Η2Ο), що узгоджується з присутністю в його складі відповідно кристалізаційних і координованих молекул води. Зсув -1 смуги ν(C=O) = 1702 см в спектрі комплексу в порівнянні зі спектром молекули ліганду (1720 -1 см ), а також поява смуг асиметричних і симетричних валентних коливань карбоксилатних іонів, свідчили про те, що всі СООН і СОО-групи координовані германієм та аргентумом. Наявність в молекулі комплексу моно- і бідентатно зв'язаних карбоксилатних груп також знайшло відображення в його ІЧ-спектрі: розраховано два значення Δν = νas(COO) - νs(COO) = 277 і 148 -1 см . Процедурі визначення рівня противірусної активності щодо вірусів грипу людини та птахів передувало визначення рівня токсичності аргентум біс(цитрато)германату за допомогою інфузорій Colpoda steinii (виробник ООО "Відродження М", м. Одеса), оскільки у цьому випадку визначається можливий рівень токсичності водночас як на клітинному, так і на рівні цілого організму. Після визначення нетоксичної дози препарату на культурі інфузорій Colpoda steinii, токсичність цієї концентрації аргентум біс(цитрато)германату досліджували на культурі тканини хоріон-алантоїсних оболонок (ХАО) 11-14-добових курячих ембріонів та з використанням культури клітин MDCK [8]. За мінімальну токсичну дозу аргентум біс(цитрато)германату на культурі тканин ХАО приймали найменшу концентрацію сполуки, що викликала загибель 50 та більше відсотків фрагментів ХАО. За максимально переносиму концентрацію (МПК) сполуки на культурі клітин MDCK приймали її найбільшу кількість, яка не викликала цитопатичної дегенерації клітин. Протигрипозну активність аргентум біс(цитрато)германату досліджували відносно штамів вірусу грипу А/Гонконг/1/68 (H3N2) і A/PR/8/34 (H1N1), а також вірусу грипу птахів H5N3, з використанням культури тканини ХАО, оскільки цю культуру можна вважати найбільш наближеною до рівня цілого організму, яким є курячий ембріон. Крім того, використання культури тканини ХАО є більш економічним методом у порівнянні з використанням курячих ембріонів для визначення противірусної дії препаратів. Аргентум біс(цитрато)германат розчиняли у глюкозо-желатиновому підтримуючому середовищі. Після доведення рН розчину до фізіологічного значення рН 7,2-7,4 визначали протигрипозну активність препарату. Вірус-вмісну рідину, з попередньо визначеним інфекційним титром, розводили у глюкозо-желатиновому середовищі, що містила (дослід) або не містила 2 UA 112912 C2 5 10 15 20 25 30 досліджувану сполуку (контроль). Фрагменти ХАО, прикріплені до шкаралупи та розміщені у лунках полістиролових панелей, інфікували розведеннями вірус-вмісної рідини на глюкозожелатиновому підтримуючому середовищі ХАО не нижче за 100 ТІД 50 (дози, яка викликає інфікування 50 та більше відсотків фрагментів тканини ХАО). Після 24 годин термостатування при 37 °C контрольні та дослідні зразки окремо поєднувались, і в них визначали титр інфекційного вірусу. Тобто, визначали найбільше розведення вірус-вмісної рідини, при якому відбувається репродукція вірусу. З цією метою десятикратними розведеннями цих зразків інфікували фрагменти ХАО, розміщені в лунках полістиролових панелей. Панелі розташовували в термостаті при 37 °C. Після 48 годин термостатування наявність вірусу в лунках визначали за результатами реакції гемаглютинації (РГА) [9]. Оцінку противірусної активності аргентум біс(цитрато)германату з використанням методу гальмування розвитку вірус-індукованого цитопатичного ефекту проводили відповідно до загально прийнятої методики [9]. Моношарову культуру клітин MDCK, яку вирощували на протязі 24 годин у 96-лункових планшетах, двічі відмивали від ростового середовища розчином Хенкса. В лунки вносили серійні десятикратні розведення вірус-вмісної рідини на підтримуючому середовищі, яке містило (дослід) або не містило (контроль) досліджувану сполуку. Оцінку противірусної активності проводили через 48 годин за РГА. Розрахунок ТІД50 в експериментах in vitro проводили за методом Кербера в модифікації І.П. Ашмаріна за формулою [10]: lgТІД50=L-d(S-0,5), де L - початкове розведення у досліді; d - різниця між послідовними lg розведень; S - сума пропорцій тест-об'єктів, які дали позитивний результат. Максимальна переносима концентрація аргентум біс(цитрато)германату на культурі інфузорій Colpoda steinii була 738 мкг/мл. На тканинній культурі ХАО та культурі клітин MDCK сполука проявляла токсичну дію у концентраціях 738 мкг/мл та 73,8 мкг/мл відповідно. Тому для визначення протигрипозної активності сполуки відносно штамів вірусу грипу людини А/Гонконг/1/68 (H3N2), A/PR/8/34 (H1N1) та вірусу грипу птахів H5N3 на культурі тканини ХАО була відібрана доза 36,9 мкг/мл. Результати досліджень у порівняння з протигрипозною дією референс-препарата таміфлю (фірма виробник Хоффманн-Ля Рош (Швейцарія), міжнародна назва - осельтамівір) (табл. 1). Таблиця 1 Препарат аргентум біс(цитрато)германат {[Ag2Ge(HCitr)2(H2O)2]·2H2O}n Таміфлю (озельтамівір) референс-препарат 35 40 45 Молярна маса, г/моль Діюча доза, мкг/мл (відповідно в моль/л) 738,6 410,0 Пригнічення репродукції вірусу (в lg) H3N2 H1N1 H5N3 36,9 мкг/мл -5 (5×10 М) 0,83 2,92 2,42 410,0 мкг/мл -3 (1×10 М) 4,17 4,17 3.75 Результати дослідження свідчать про те, що сполука у концентрації 36,9 мкг/мл пригнічувала репродукцію штаму вірусу грипу людини А/Гонконг/1/68 (H3N2) на культурі тканини ХАО незначною мірою на 0,83 lg ТІД50. Тоді як референс-препарат (Таміфлю) в кінцевій концентрації 410 мкг/мл пригнічував репродукцію вірусу повністю на 4,17 lg ТІД 50. Відносно штаму вірусу грипу людини A/PR/8/34 (H1N1) аргентум біс(цитрато)германат у тій же концентрації 36,9 мкг/мл статистично достовірно у порівнянні з контролем пригнічував репродукцію на 2,92 lg ТІД50. При цьому референс-препарат (таміфлю) у кінцевій концентрації 410мкг/мл пригнічував репродукцію вірусу повністю на 4,17 lg ТІД50. Тобто, у концентрації в десять разів нижче, ніж у референс-препарату, аргентум біс(цитрато)германат проявляв антивірусну активність у два рази нижче. У тій же концентрації 36,9 мкг/мл відносно штаму пташиного грипу H5N3 отримані результати (табл. 1), які демонструють, що аргентум біс(цитрато)германат статистично достовірно у порівнянні з контролем пригнічував репродукцію на 2,42 lg ТІД 50. При цьому референс-препарат (таміфлю) у кінцевій концентрації 410 мкг/мл пригнічував репродукцію вірусу повністю на 3,75 lg ТІД50. Слід зазначити, що у концентрації в десять разів нижче, ніж у 3 UA 112912 C2 5 10 референс-препарату, досліджувана комплексна сполука проявляла протигрипозну активність на 1,33 lg ТІД50 нижче. Аналогічним чином аргентум біс(цитрато)германат діяв і на моделі клітинної культури (MDCK). Оскільки його МПК на цій моделі була нижчою (73,8 мкг/мл), протигрипозну дію речовини вивчали у концентрації 36,9 мкг/мл (табл. 2). Репродукція вірусу грипу людини штаму А/Гонконг/1/68 (H3N2) пригнічувалась під впливом аргентум біс(цитрато)германату на 3,9 lg ТІД50 проти дії референс-препарату, яка складала 4,33 > lg ТІД50. Відносно штаму A/F R/8/34 (H1N1) інгібування репродукції було дещо нижчим і складало 1,2 lg ТІД50 проти дії референс-препарату, а саме 3,33 lg ТІД50. Але в обох випадках гальмування репродукції було статично значущим. Таблиця 2 Максимальна Молярна нетоксична Препарат маса, доза г/моль препарату на MDCK аргентум біс(цитрато)германат 73,8 мгк/мл 738,6 -4 {[Ag2Ge(HCitr)2(H2O)2·2Η2Ο}n (10 М) Таміфлю (озельтамівір) 410 мкг/мл 410 -3 референс-препарат (1×10 М) 15 20 25 30 35 40 45 Пригнічення Пригнічення Діюча доза репродукції репродукції препарату вірусу вірусу H1N1 Н3N2 в lg в lg 36,9 мкг/мл -5 (5×10 М) 205 мкг/мл -3 (0,5×10 М) 3,9 1,2 4,33 3,33 Таким чином, у порівнянні з прототипом, заявлений препарат - аргентум біс(цитрато)германат - виявляє виражену противірусну активність відносно вірусу грипу людини штамів А/Гонконг/1/68 (H3N2) та A/PR/8/34 (H1N1), а також вірусу грипу птахів H5N3 на обох застосованих моделях. Слід зазначити, що його ефективна доза в 5-10 разів нижча, ніж референс-препарату таміфлю. Це дає перспективу для подальшого дослідження цієї речовини на тваринних моделях та з метою подальшого впровадження в медичну практику. Джерела інформації: 1. Менчиков Л.Г. Биологическая активность органических соединений германия (обзор) / Л.Г.Менчиков, М.А. Игнатенко // Химико-фармацевтический журнал. - 2012. - Т. 46, № 11. - С. 36. 2. Шкиль Н.А. Антимикробные свойства, фармакотоксикологические характеристики и терапевтическая эффективность препарата арговит при желудочно-кишечных болезнях телят / Н.А. Шкиль, В.А. Бурмистров, М.Ю. Соколов // Научный журнал КубГАУ. - 2011. - № 68(04). 3. Кучеренко М.Є. Біохімія / Μ.Є. Кучеренко, Ю.Д. Бабенюк, О.М. Васильєв. - Київ: ВГЦ "Київський університет", 2002. - 480 с. 4. Weekly Epidemiological Report N 211, April 2009 [electronic resource] - Access mode: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs21 1 /ru/index.html 5. WHO (2010 February) WHO Guidelines for Pharmacological Management of Pandemic (H1N1) 2009 Influenza and other Influenza Viruses. [Electron resource] Access mode: http://vvww.who.int/csr/resources/publications/swinenu/ hlnl use antivirals 20090820/en/index.html 6. Gubareva LV, Hayden FG. M2 and neuraminidase inhibitors: anti-influenza activity, mechanisms of resistance and clinical effectiveness. In: Kawaoka Y, editor. Influenza virology: current topics. Wymondham, United Kingdom: Caister Press. - 2006. - P. 169-202. 7. Center of Diesis Control and Prevention. Oseltamivir-resistant 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus infection in two summer campers receiving prophylaxis-North Catolina, 2009. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. - 2009. - Vol. 58. - P. 969-72. 8. Пат. 15629 А Україна, МПК G01N 33/15, C12Q 1/18. Спосіб оцінки ступеня цитотоксичності біологічно активних сполук та фармакологічних препаратів / Лозицький В.П., Григорашева І.М., Федчук А.С. [та ін.]; заявник-патентоутримувач Український наук. - досл. Протичумний ін-т, ТОВ "Відродження М". - №u200512542; заявл. 26.12.05; опубл. 17.07.06, Бюл. № 7. 9. Доклинические исследования лекарственных средств: метод. Рекомендации / под. ред. чл.-кор. АМН Украины А.В.Стефанова - К.: Авіцена, 2002. - 567 с. 10. Ашмарин И.П. Вычисление ЕД50 при малом числе подопытных животных / И.П.Ашмарин // Ж. микробиол. - 1959. - №2. - С. 102-108. 4 UA 112912 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 Протигрипозний засіб аргентум біс(цитрато)германат, який є координаційним полімером з різними металами і карбоксилатним лігандом, який відрізняється наявністю в молекулі двох біометалів (германій, аргентум) і біологічно активного ліганду (лимонна кислота) з формулою {[Ag2Ge(HCitr)2(H2O)2]·2H2O}n і будовою: O C H2 C O C O C O O Ag O C Ge C HO O O C H2 C Ag O O O CH2 C OH CH2 C . Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5