Спосіб отримання трансформованих рослин м’якої пшениці методом agrobacterium-опосередкованої трансформації калюсних культур апікального походження

Реферат: Спосіб отримання трансформованих рослин м'якої пшениці методом Agrobacteriumопосередкованої трансформації калюсних культур апікального походження, включає: виділення апікальних меристем з 3-добових асептичних проростків; вирощування їх на модифікованому середовищі МС для отримання калюсу; обробку отриманого калюсу (експлантів) бактеріальною суспензією; ко-культивування з A. tumefaciens; культивування обробленого калюсу на регенераційному середовищі МС, доповненому антибіотиком для елімінації A. tumefaciens та відповідним селективним агентом (в залежності від генетичної конструкції); регенерацію пагонів-трансформантів. Експланти для трансформації використовують 18-добові калюсні культури пшениці апікального походження. UA 115633 U (12) UA 115633 U UA 115633 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології та генетичної інженерії, зокрема способу отримання трансформованих рослин м'якої пшениці методом Agrobacterium-опосередкованої трансформації in vitro, яка призначена для використання в рослинництві та сільському господарстві. Поряд із традиційними методами селекції пшениці, які спрямовані на отримання високопродуктивних сортів, широкого застосування набувають біотехнологічні прийоми. Серед біотехнологічних методів поліпшення пшениці найбільш вагоме місце займають клітинна селекція та генетична трансформація, які спрямовані на надання пшениці нових ознак: покращення якості зерна та його хлібопекарських властивостей шляхом підвищення вмісту білка, стійкість до гербіцидів, різного роду шкідників та інших стресових чинників. Переважно генетичну трансформацію пшениці здійснюють шляхом біолістичної трансформації (прямий перенос генів) [1], але в останні десятиліття, незважаючи на природну несприйнятливість однодольних і, зокрема, пшениці до Agrobacterium tumefaciens, все частіше застосовується методика Agrobacterium-опосередкованої трансформації (опосередкований перенос генів) [1]. Агробактеріальну трансформацію пшениці здійснюють як in vitro так і in planta [2], але Agrobacterium-опосередкована трансформація in planta обмежена періодом цвітіння пшениці (1-3 тижня на рік). Відомо, що на перенесення Т-ДНК в клітини рослин впливають: рослинний експлант, штам Agrobacterium, векторна конструкція, щільність суспензії агробактеріальних клітин, склад поживних середовищ, умови трансформації, антибіотики та ін. Найбільш поширеними експлантами (об'єктами) при проведенні Agrobacteriumопосередкованої трансформації пшениці in vitro є свіжо виділені незрілі зародки, прекультивовані незрілі зародки або ембріогенний калюс. Рідше використовують проростки 1-4 добового віку, колоски, апікальні меристеми зародків сухого насіння, базальні частини листя, базальні частини пагона або калюсні культури. Найбільш близьким є спосіб Agrobacterium-опосередкованої трансформації калюсних культур м'якої пшениці, який передбачає: використання в якості експлантів калюсних культур (14- або 28-добових), отриманих з апікальних меристем 3-добових асептичних проростків пшениці, вирощених на середовищі МС [3] з додаванням 2 мг/л 2,4-Д; суспензій агробактерій (які містять генетичні конструкції рСВ002 або рВі2Е) оптичної щільності OD 600=0,2; спільне культивування калюсів з агробактеріальною суспензією протягом 3 діб; елімінацію агробактерій за допомогою антибіотику цефотаксиму концентрацією 250 мг/л; пряму селекцію на середовищі, яке містить канаміцин у концентрації 100 мг/л або ступінчасту селекцію на регенераційних середовищах, концентрація антибіотика в яких підвищувалась з 50 мг/л до 75 та 100 мг/л; отримання рослин-регенерантів, стійких до селективного агента [4]. Недоліком відомого способу є те, що знижується регенераційний потенціал калюсів та частота регенерації трансформантів в разі, коли як експланти використовують 14- або 28-добові калюсні культури пшениці; пригнічується регенерація пагонів за використання великих концентрацій антибіотику цефотаксиму (400 мг/л і вище) для елімінації агробактерій; не 100 % усувається бактеріальна контамінація за використання середніх концентрацій антибіотику цефотаксиму (250 мг/л), що робить неможливим використання агробактеріальної суспензії оптичною щільністю вище OD600=0,2; потрібен додатковий етап укорінення пагонів-регенерантів за використання антибіотику цефотаксиму, що збільшує час, який необхідний для отримання трансгенних рослин, а також збільшує витрати на реактиви (для приготування додаткового середовища для укорінення рослин); збільшується час селекції (ступінчаста селекція) та утруднюється відбір трансформантів за використання антибіотику канаміцину для селекції внаслідок високої чутливості пшениці до цього антибіотика. Задачею корисної моделі є удосконалення способу отримання трансформованих рослин м'якої пшениці методом агробактеріальної трансформації, який забезпечує підвищення частоти регенерації пагонів-трансформантів та прискорює отримання трансгенних рослин. Поставлена задача вирішується тим, що способом Agrobacterium-опосередкованої трансформації здійснюється отримання трансформованих рослин м'якої пшениці, що включає: виділення апікальних меристем з 3-добових асептичних проростків; вирощування їх на модифікованому середовищі МС для отримання калюсу; обробку отриманого калюсу бактеріальною суспензією; ко-культивування з A. tumefaciens; культивування обробленого калюсу на регенераційному середовищі МС, доповненому антибіотиком для елімінації A. tumefaciens та відповідним селективним агентом (в залежності від генетичної конструкції); регенерацію пагонів-трансформантів; згідно запропонованої корисної моделі, як експланти використовують 18-добовий калюс апікального походження, обробку отриманого калюсу здійснюють бактеріальною суспензією з оптичною щільністю OD 600=0,4 протягом 15 хв.; 1 UA 115633 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 оброблений калюс просушують на фільтрувальному папері; ко-культивують з А. tumefaciens 48 годин у термостаті за температури 27 °C на середовищі для ко-культивування; оброблені експланти культивують на селективному регенераційному модифікованому середовищі МС, яке містить 0,5 мг/л 6-бензиламінопурину (БАП) та 0,15 мг/л піклораму, 400 мг/л антибіотика цефтріаксону (для елімінації A. tumefaciens, прискореної регенерації трансформованих пагонів та їх одночасного укорінення) та 100 мг/л паромоміцину або 5 мг/л фосфінотрицину (в залежності від генетичної конструкції) (для селекції); селекцію проводять в один етап. Суть корисної моделі пояснюється прикладами та схемами (фіг.). Приклад №1 виконання способу Рослинний матеріал. Для одержання асептичних проростків-донорів апікальних меристем насіння послідовно стерилізували 1 %-м розчином КМnО4 протягом 3 хв, 1 %-м розчином AgNO3-2 хв, 96 %-м етиловим спиртом - 1 хв і тричі промивали стерильною дистильованою водою. Після стерилізації насіння пророщували протягом 3 діб у скляних посудинах об'ємом 200 мл за температури 24 °C і 16-годинного фотоперіоду на безгормональному середовищі МС [3]. Апікальні меристеми виділяли з 3-добових проростків і розміщували на модифікованому середовищі МС, яке містило 2 мг/л 2,4-Д і 10 мг/л AgNO3, вітаміни за Гамборгом та 20 г/л сахарози. Експланти поміщали у чашки Петрі (близько 50 шт.) так, щоб досягалася максимальна площа контакту з середовищем і культивували їх за 26 °C у темряві впродовж 18 діб для отримання калюсу. Векторна конструкція і бактеріальний штам. У роботі використовували нопаліновий штами Agrobacterium tumefaciens ABI з векторною конструкцією р014. До Т-ДНК даного вектору входили селективний ген неоміцинфосфотрансферази - nрtII та маркерний ген синтетичного зеленого флуоресцентного білка - sgfp, підсилені промотором вірусу мозаїки цвітної капусти (Р35е), які мають термінатори нопалінсинтази (Tnos) і білка теплового шоку (Thsp) відповідно. На схемі для генів nрtII та sgfp показані місця посадки пар праймерів PSGA-PSGB та gfp2Fgfp2R відповідно. Agrobacterium tumefaciens-опосередкована трансформація пшениці. З метою одержання трансгенних рослин м'якої пшениці в якості вихідного матеріалу використовували 18-добовий калюс апікального походження. Калюс обробляли бактеріальною суспензією протягом 15 хв., потім просушували на фільтрувальному папері та переносили у чашки Петрі (близько 50 шт.) на живильне середовище для ко-культивування [5]. Ко-культивування з A. tumefaciens здійснювали протягом 48 год. у термостаті за температури 27 °C. Елімінацію агробактерій проводили на регенераційному модифікованому середовищі МС (МСР4) наступного складу: солі за МС, вітаміни за Гамборгом, 10 мг/л AgNO3, 20 г/л сахарози, 0,5 мг/л БАП та 0,15 мг/л піклораму [6], доповненому антибіотиком цефтріаксоном у концентрації 400 мг/л. Культивування оброблених калюсів здійснювали за температури 24 °C і 16-год. фотоперіоду. Селекція. Для відбору трансформантів (для селекції) оброблені експланти поміщали на середовище для регенерації МСР4, яке як селективний агент містило 100 мг/л паромоміцину, оскільки Т-ДНК генетичної конструкції р014 містить селективний ген неоміцинфосфотрасферази - nрtII. Аналіз за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Інтеграцію чужорідних генів в рослинний геном визначали за допомогою ПЛР. Геномну ДНК виділяли із частини листя рослин пшениці покоління Т0 ЦТАБ-методом [7]. Реакційні суміші включали: специфічні праймери (ген nptll: 5'-GAG-GCT-ATT-CGG-CTA-TGA-CTG-3", 5'-CAA-GCT-CTT-CAG-CAA-TAT-CAC-G-3', 647 п.н.; ген sgfp: 5'-CAG-CGT-GAA-CGG-CCA-CAA-GTT-CA-3', 5'-CGA-TGC-GGT-TCA-CCA-GGGTGT-3", 311п.н.), по 2 мкл буфера для ПЛР 10xDreamTaq™ GreenBuffer (Thermo Fisher Scientific), no 0,2 мМ кожного дезоксирибонуклеозидтрифосфата (Thermo Fisher Scientific), 0,5 од. полімерази DreamTaq™ DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific), 30 нг загальної ДНК. Реакційну суміш доводили до кінцевого об'єму 20 мкл деіонізованою водою Milli-Q. Умови ампліфікації: ПЛР для визначення трансгена nptll: початкова денатурація 3 хв. при 94 °C, 34 цикли - денатурація 30 с при 94 °C, ренатурація 30 с при 60 °C, елонгація 40 с при 72 °C, фінальна елонгація 5 хв. при 72 °C; мультиплексна низхідна (Touchdown) ПЛР для визначення послідовності гена зеленого флуоресцентного білка (sgfp): початкова денатурація 4 хв. при 94 °C, 7 циклів - денатурація 30 с при 94 °C, ренатурація 45 с при 68 °C (з кожним циклом температура зменшується на 1 °C), елонгація 30 с при 72 °C та 25 циклів - денатурація 30 с при 94 °C, ренатурація 30 с при 60 °C, елонгація 30 с при 72 °C, фінальна елонгація 5 хв. при 72 °C. Реакції ампліфікації проводили в термоциклерах Arctic Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific) і Mastercycler gradient (Eppendorf). Продукти ампліфікації розділяли в 1,2 % 2 UA 115633 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 агарозному гелі у присутності 0,5 мкг/мл бромистого етидію, візуалізували в ультрафіолетовому світлі і фотографували. Результати. В результаті експериментів отримано канаміцинстійкі рослини пшениці, які містять трансген nptll. Поява меристематичних осередків в 18-добовому калюсі розпочиналася на 5-10-й день культивування, а пагонів - на 14-й, що підтверджує прискорене отримання регенерантів. Відібрані при селекції регенеранти за розмірами, морфологією не відрізнялися від контрольних нетрансформованих пагонів. З метою підтвердження наявності послідовностей трансгенів nptll та sgfp в регенерованих рослинах пшениці проводили аналіз за допомогою ПЛР. Частота трансформації пшениці за геном nptll становить 2,4-2,7 %. Приклад №2 виконання способу Рослинний матеріал та методика проведення Agrobacterium tumefaciens-опосередкованої трансформації пшениці за прикладом №1. Векторна конструкція і бактеріальний штам. У роботі використовували нопаліновий штами Agrobacterium tumefaciens GV3101 з векторною конструкцією рСВ203. До Т-ДНК даного вектору входять селективний ген фосфінотрицин ацетил трансферази (bar) під контролем промотора нопалінсинтази (nospro) та репортерний ген β-глюкуронідази (gus) під контролем убіквітинового промотору (Ubil), які мають термінатори нопалінсинтази (nost) та інтрон кукурудзи (intr) для досягнення високого рівня експресії цих генів. На схемі для генів bar та gus показані місця посадки пар праймерів SBE F-SBE R та GUS+ - GUS-відповідно. Селекція. Для відбору трансформантів (для селекції) оброблені експланти поміщали на середовище для регенерації МСР4, яке як селективний агент містило 5 мг/л фосфінотрицину, оскільки Т-ДНК генетичної конструкції рСВ203 містить селективний ген фосфінотрицин ацетил трансферази - bar. Аналіз за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Інтеграцію чужорідних генів в рослинний геном визначали за допомогою ПЛР. Геномну ДНК виділяли із частини листя рослин пшениці покоління Т0 ЦТАБ-методом [7]. Реакційні суміші включали: специфічні праймери (ген bar. 5'-CAT-CGA-GAC-AAG-CAC-GGT-CA-3", 5'-GAA-ACC-CAC-GTC-ATG-CCA-GT-3', 405 п.н., ген GUS 5'-GGC-CCC-AAT-CCA-GTC-CAT-TAA-TGC-G-3', 5'-TGG-GTG-GAC-GAT-ATC-ACCGTG-GTG-A-3", 423 п.н.), no 2 мкл буфера для ПЛР 10xDreamTaq™ GreenBuffer (Thermo Fisher Scientific), no 0,2 мМ кожного дезоксирибонуклеозидтрифосфата (Thermo Fisher Scientific), 0,5 од. полімерази DreamTaq™ DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific), 30 нг загальної ДНК. Реакційну суміш доводили до кінцевого об'єму 20 мкл деіонізованою водою Milli-Q. Умови ампліфікації: ПЛР для визначення трансгена bar: початкова денатурація 3 хв при 94 °C, 34 цикли - денатурація 30 с при 94 °C, ренатурація 30 с при 65 °C, елонгація 1 хв при 72 °C, фінальна елонгація 5 хв при 72 °C; Умови ампліфікації: ПЛР для визначення гена GUS початкова денатурація 94 °C-3 хв, 34 цикли 94 °C - денатурація 30 с, 64 °C – відпал 30 с, 72 °C - елонгація 30 с, 72 °C - завершальна елонгація 5 хв, 22 °C-2 хв. Реакції ампліфікації проводили в термоциклерах Arctic Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific) і Mastercycler gradient (Eppendorf). Продукти ампліфікації розділяли в 1,2 % агарозному гелі у присутності 0,5 мкг/мл бромистого етидію, візуалізували в ультрафіолетовому світлі і фотографували. Результати. В результаті експериментів отримано стійкі до гербіциду фосфінотрицину рослини пшениці, які містять трансген bar. Поява меристематичних осередків в 18-добовому калюсі розпочиналася на 5-у добу культивування, а пагонів - на 10-у, що підтверджує прискорене отримання регенерантів. Відібрані при селекції регенеранти за розмірами, морфологією не відрізнялися від контрольних нетрансформованих пагонів. Трансгенна природа всіх отриманих рослин була підтверджена за допомогою ПЛР з праймерами специфічними до bar гена. Частота трансформації пшениці за геном bar становить 1,6-1,8 %. Таким чином, запропонований спосіб трансформації пшениці м'якої за допомогою A. tumefaciens штамів АВІ та GV3101 з використанням як експлантів 18-добового калюсу апікального походження дає наступні переваги: використання антибіотику цефтріаксону як елімінуючого агробактерії агента прискорює процес регенерації пагонів, підвищує частоту утворення регенерантів та усуває додатковий етап вкорінення пагонів-трансформантів, в результаті чого спрощується та прискорюється процес отримання трансформованих рослин, зменшуються фінансові витрати на процес отримання рослин з трансформованим геномом; використання антибіотику паромоміцину (за використання векторної конструкції р014, яка 3 UA 115633 U 5 10 15 20 містить ген nрtII) для селекції трансформантів прискорює процес селекції в результаті одноетапності процесу. Джерела інформації: 1. Горбатюк І.Р., Щербак Н.Л., Банникова М.О., Великожон Л.Г., Кучук М.В., Моргун Б.В. Отримання стійких до гербіциду фосфінотрицину трансгенних рослин пшениці сорту Зимоярка трансформацією in vitro II Физиология растений и генетика. - 2016. - Т. 48 (1). - С. 65-74. 2. Горбатюк I.P., Бавол А.В., Банникова М.О., Моргун Б.В. Agrobacterium-опосередкована трансформація in planta пшениці м'якої озимого сорту Подолянка // Вісник Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна. Серія: Біологія. - 2015. - Вип. 24 (1153). - С. 4753. 3. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - 15. - P. 473-497. 4. Бавол А.В., Воронова C.C., Дубровна О.В. Оптимізація умов AgrobacteriumonoceipQRKOBaHo'i трансформації калюсів м'якої пшениці // Физиология растений и генетика. 2015. - Т.47, №1. - С. 58-65. - прототип 5. SidorovV., Duncan D. Agrobacterium-mediated maize transformation: immature embryos versus callus // Methods Мої. Biol. - 2009. - Vol. 526. -P. 47-58. 6. Горбатюк І.Р. Гнатюк І.С., Банникова М.О., Тараненко A.M., Моргун Б.В. Вплив регуляторів росту на регенераційну здатність калюсу м'якої пшениці сорту Зимоярка // Физиология растений и генетика. - 2015. -Т. 47 (6). - С. 514-525. 7. Дрейпер Дж., Скотт Р. Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений. В кн. Генная инженерия растений. М.: Мир, 1991. - С. 241-245. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 35 40 1. Спосіб отримання трансформованих рослин м'якої пшениці методом Agrobacteriumопосередкованої трансформації калюсних культур апікального походження, який включає: виділення апікальних меристем з 3-добових асептичних проростків; вирощування їх на модифікованому середовищі МС для отримання калюсу; обробку отриманого калюсу (експлантів) бактеріальною суспензією; ко-культивування з A. tumefaciens; культивування обробленого калюсу на регенераційному середовищі МС, доповненому антибіотиком для елімінації A. tumefaciens та відповідним селективним агентом (в залежності від генетичної конструкції); регенерацію пагонів-трансформантів, який відрізняється тим, що як експланти для трансформації використовують 18-добові калюсні культури пшениці апікального походження; обробку отриманого калюсу здійснюють бактеріальною суспензією з оптичною щільністю OD600=0,4 протягом 15 хв.; просушують на фільтрувальному папері; ко-культивують з A. tumefaciens 48 годин за температури 27 °C; оброблені експланти культивують за температури 24 °C і 16-год. фотоперіоду на селективному регенераційному середовищі МС, яке містить 0,5 мг/л БАП та 0,15 мг/л піклораму, 400 мг/л антибіотика цефтріаксону (для елімінації А. tumefaciens, прискореної регенерації трансформованих пагонів та їх одночасного укорінення) та селективний агент в залежності від генетичної конструкції; селекцію трансформантів здійснюють в один етап. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як селективний агент використовують антибіотик паромоміцин (100 мг/л) або гербіцид фосфінотрицин (5 мг/л). 4 UA 115633 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5