Вірус-вакцина-2 проти інфекційної бурсальної хвороби птиці (хвороби гамборо) зі штаму “ум-93″

Реферат: Вірус-вакцина-2 проти інфекційної бурсальної хвороби птиці (хвороби Гамборо) зі штаму "УМ93" містить вірусвмісний матеріал із авірулентного штаму "УМ-93" вірусу бурсальної хвороби, як стабілізатор - захисне середовище. При цьому як вакцинний штам використовують клонований штам "УМ-93", який був адоптований до курячих ембріонів, вільних від специфічних патогенних мікроорганізмів (КЕ ВСПМ). UA 119801 U (54) ВІРУС-ВАКЦИНА-2 ПРОТИ ІНФЕКЦІЙНОЇ БУРСАЛЬНОЇ ХВОРОБИ ПТИЦІ (ХВОРОБИ ГАМБОРО) ЗІ ШТАМУ "УМ-93" UA 119801 U UA 119801 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної вірусології та біотехнології і може використовуватися для профілактичної імунізації курчат 14-21-добового віку м'ясного та яєчного напрямків проти інфекційної бурсальної хвороби (хвороба Гамборо), а основними споживачами її є дрібнотоварні птахогосподарства різної форми власності. Інфекційна бурсальна хвороба (ІБХ) - вірусна висококонтагіозна хвороба птиці, яка клінічно проявляється у курчат 2-15 тижневого віку, а найбільш уразливі курчата 3-6-тижневого віку, в яких вона протікає з високими показниками смертності. Супроводжується переважно діареєю, ураженням фабрицієвої сумки, значно менше - ураженням інших лімфоїдних органів, наявністю крововиливів в грудних м'язах, в м'язах крил, стегон та на слизовій оболонці на межі залозистого та м'язового шлунків. У курчат молодшого віку вона протікає м'якше, часто субклінічно, з можливими рецидивами захворювання внаслідок персистенції вірусу в фабрицієвій бурсі. У вітчизняному птахівництві широко використовуються вірус-вакцини як вітчизняного, так і закордонного виробництва, такі як Галівак ІБХ, ТАД Гамборо вак форте, СЕВАК ІБХЛ, Пулвак Бурсин 2 (Ветеринарні імунобіологічні препарати: довідник / За заг. ред. П.І. Вербицького, A.M. Головка - К. Реферат, 2004. - 400 с.) Недоліком всіх вище зазначених штамів вірусу ІБХ є те, що вони не є епізоотично актуальними для України, препарати, виготовлені на основі цих штамів, не гомологічні польовим вірусам, які циркулюють у нашій країні. Тому ці вакцини мають низьку антигенну та імуногенну активність. Найбільш близькою за технічною суттю до корисної моделі, що заявляється, є вакцина проти ІБХ (Патент UA № 29843, А61K 39/00, C12N 7/00 15.11.2000 р. Вакцина проти інфекційної бурсальної хвороби та спосіб її виготовлення). Для виготовлення цієї вакцини штам "УМ-93" було ізольовано з біологічного матеріалу, відібраного від курчат з птахофабрики Харківської області у 1992 році та адаптовано до гетерологічної біосистеми - перещеплювальної культури клітин нирки ембріону вівці. Ця вакцина може бути найближчим аналогом. Недоліком є те, що вірус-вакцина із штаму "УМ-93" була призначена для профілактики захворювання на ІБХ в благополучних господарствах, а в умовах неблагополучних господарств, а також при наявності високого рівня материнських антитіл, ефективність її використання була недостатня. Також недоліком є те, що отримана вірус-сировина на культурі фібробластів КЕ або перещеплювальних культурах також значно поступається за імуногенністю ембріональному варіанту. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити вірус-вакцину-2 проти інфекційної бурсальної хвороби птиці (хвороби Гамборо) зі штаму "УМ-93", яка містить вірусвмісний матеріал із авірулентного штаму "УМ-93" вірусу бурсальної хвороби, як стабілізатор - захисне середовище шляхом використання як вакцинного штаму - клонований штам "УМ-93", який був адоптований до курячих ембріонів, вільних від специфічних патогенних мікроорганізмів (КЕ ВСПМ), щоб забезпечити ефективність вакцини. Отримана таким чином вірус-вакцина була досліджена за всіма критеріями (реверсибельність, нешкідливість, антигенна активність, імуногенність, стерильність та ін.), які прописані в міжнародних рекомендаціях та стандартах. Реверсибільність вакцинного штаму "УМ-93" була доведена шляхом наступних пасажів на 3 17-добових умовно ВСПМ курчатах шляхом випоювання з водою (ентерально в дозі 0,5 см -4,75 3 lg ЕІД 50/0,2 см ) впродовж 5 пасажів (по 10 голів). Клінічних змін впродовж 14 діб спостереження або патологоанатомічних ознак хвороби підчас розтину не виявлено. Виробничий штам вірусу ІБХ "УМ-93" до використання можна зберігати в ліофільному (сухому) стані за температури від 4 до 8 °C або рідкому стані за температури від мінус 20 до 196 °C. Порівняльний аналіз корисної моделі, що заявляється, із найближчим аналогом дозволяє зробити висновок, що вірус-вакцина на основі вакцинного клонованого штаму "УМ-93", який було адаптовано до курячих ембріонів має більш високу імуногенну активність, є нешкідливою, використовується для ревакцинації поголів'я птиці. Вакцину готують таким чином. Процес отримання вірус-сировини для виготовлення біопрепарату полягає в отриманні "Матрової розплодки". Для цього рідкий виробничий штам вірусу ІБХ "УМ-93" освіжають шляхом одноразового пасажування на КЕ (ВСП) 9-добового віку (СОУ 01.2-37-196). Перед інфікуванням КЕ овоскопують і відбирають придатні для роботи - рухомі, з добре розвинутою судинною -1 системою. Готують розведення вірусу 10 на фосфатно-сольовому буфері (ФСБ) рН 7,2±0,1 з антибіотиками, витримують впродовж 30 хв. за кімнатної температури. Після чого інфіковані КЕ інкубують у термостаті протягом 120 год. за температури 37 °C і відносній вологості (60-70) %. У процесі інкубації ембріони овоскопують раз на добу. Ембріони, які загинули впродовж перших 1 UA 119801 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 24 год., знищують. Через 120 год. інкубації усі ембріони охолоджують за температури 4 °C впродовж 18 год. Перед розтином ембріони витримують 2 год. за кімнатної температури для випаровування вологи (конденсату) з поверхні шкарлупи, потім дезінфікують 70 % спиртом. Екстраембріональну рідину (ЕЕР), яка містить вірус відбирають у стерильний скляний флакон 3 об'ємом 200 см . Отриману "Матрову розплодку" перевіряють на відповідність паспортним даним (біологічна активність, стерильність) та зберігають в замороженому стані за температури мінус 70 °C до використання. Залишки після освіження вірусу знешкоджують шляхом автоклавування за температури 132 °C, 2 атм впродовж 60 хв. Визначення біологічної активності "Матрової розплодки" проводять шляхом титрування -1 -10 вірусу на 9-10-добових КЕ. Для цього готують десятикратні розведення вірусу від 10 до 10 на ФСБ з додавання антибіотиків. На кожне розведення використовують по 4 ембріони. Ознаками біологічної активності вірусу вважають: затримку розвитку ембріонів, у порівнянні з контрольними, незараженими, крововиливи на голові, шкірі кінцівок тулуба, підшкірний набряк черевної порожнини. Титр вірусу розраховують за методом Ріда та Менча, який повинен бути не 3 менше, ніж 6 lg ЕІД 50/0,2 см . Визначення контамінації бактеріальною або грибковою мікрофлорою "Матрової розплодки" проводять згідно з ДСТУ 4483 на тіогліколевому середовищі (ТГС), а на відсутність мікоплазм з використанням середовища Едварда (0,35 % агару) впродовж 3-х послідовних пасажів. Перевірену на якість "Матрову розплодку" використовують для отримання вірусовмісної сировини для виробництва вірус-вакцини. Перед інфікуванням КЕ готують виробничу розплодку штаму вірусу інфекційної буреальної 3 хвороби Гамборо "УМ-93", шляхом розведення "Матрової розплодки" вірусу (1000 ЕІД 50/см ), 3 3 на фосфатно-сольовому буфері з антибіотиками (500 ОД/см пеніциліну, 500 мкг/см 3 стрептоміцину), 25 ОД/см ністатину та витримують 30 хв. за кімнатної температури. Отриману виробничу розплодку вірусу готують в об'ємі, потрібному для зараження даної партії КЕ 9-10добової інкубації. Масово інфікуванні КЕ "Матровою розплодкою" інкубують у термостаті протягом 120 год. за температури 37 °C і відносній вологості 60-70 %. У процесі інкубації ембріони овоскопують два рази на день, у ранці та ввечері. Через 5 діб інкубації курячі зародки охолоджують до температури 4 °C впродовж 18 год. Ембріони, які загинули впродовж перших 24 годин, знищують. Перед розтином ембріони витримують 2 год. за кімнатної температури для випарювання вологи (конденсату) з поверхні шкарлупи. Розтин і відбір вірусовмісного матеріалу (ХАО, алантоїсну рідину, тіло ембріону) проводять як зазначено вище. Вірусовмісну рідину та 3 3 ембріони збирають у стерильні скляні флакони ємністю 250 см по 450 см . Отриманий біоматеріал піддають 2-разовому заморожуванню та відтаюванню. Потім на гомогенізаторі проводять його подрібнення та подальше центрифугування впродовж 30 хв. за 5000 об/хв. Одержаний осад вилучають та знешкоджують, а надосадову рідину заморожують до використання та перевірки на якість та відповідність (титр біологічної активності, стерильність). Після перевірки якості та відповідності вірус-сировини розморожений біоматеріал в кількості 20 % від загального об'єму вакцини змішують з 1 % розчином пептону (ГОСТ 13805-76) в кількості 40 % від загального об'єму вакцини та додають знежирене молоко (1,5 %) - 40 % від загального об'єму вакцини. Сублімаційну сушку проводять впродовж 54 годин (перша фаза висушування проходила за мінусової температури - 36 год.; друга фаза проходила за плюсової температури та вакууму - 18 год. Маркування споживчої тари вірус-вакцини здійснюють згідно з ДСТУ 4614. Контроль якості та відповідності НД проводять згідно з "Інструкцією з виготовлення та контролю вірус-вакцини" у відділі біологічного контролю (ВБК) виробника біопрепарату за зовнішнім виглядом, кольором, наявністю тріщин флаконів та сторонніх домішок, плісняви, зміни консистенції, розчинності, масової частки вологи, стерильністю, нешкідливості, антигенної та імуногенної активності. Отримана таким чином вірус-вакцина була досліджена за всіма критеріями (реверсибельність, нешкідливість, антигенна активність, імуногенність, стерильність та ін.), які прописані в міжнародних рекомендаціях та стандартах. Вірус-вакцина являє собою суху, пористу масу блідо-рожевого кольору. Приклад 1. Визначення біологічної активності вірус-вакцини Дослідження щодо біологічної активності вірус-вакцини проводили у стерильних умовах -5 -10 шляхом серійного розведення імунобіологічного препарату від 10 до 10 . Кожним 2 UA 119801 U 3 5 10 15 20 25 30 35 розведенням вірусу заражали по 4 ембріони у хоріоалантоїсну порожнину в дозі 0,2 см , а 5 ембріонів використовували, як контроль, і вводили аналогічну дозу фізіологічного розчину. 3 Біологічна активність вірусу повинна бути не менше, ніж була 6,0 lg ЕІД 50/0,2 см . Приклад 2. Визначення нешкідливості та реактогенності вірус-вакцини Дослідження щодо нешкідливості та реактогенності вірус-вакцини проводили на двох групах курчат (по 10 голів) 14-добового віку. Першій групі курчат вакцину вводили інтраокулярно в дозі 3 0,2 см (10 кратна доза), а другій (контроль) фізіологічний розчин. За курчатами спостерігали впродовж 14 діб (табл. 1). Впродовж вказаного терміну у курчат обох груп не відмічені клінічні ознак ІБХ та загибелі (пригнічення, скуйовдженість пір'я, пронос). З появою високовірулентних штамів вірусу ІБХ, а також широке використанням інактивованих вакцин батьківським стадам птиці змінили і епізоотологічний прояв захворювання - інфекцію стали реєструвати у курчат в більш старшому віці (30 діб та старших вікових груп). Вакцинація птиці проти ІБХ з високим не однорідним імунітетом (пасивні антитіла) викликає формування імунітету лише у деякої частини стаду птиці, тоді як ревакцинація стимулює захисні сили у більшості поголів'я. Тому програма вакцинацій проти ІБХ, а особливо це стосується зон з високою ймовірністю прояву зазначеного збудника включає ревакцинацію поголів'я птиці. Приклад 3. Визначення імуногенності вірус-вакцини Дослідження щодо імуногенності вірус-вакцини проводили на щепленій (вакцинованій у 17добовому віці та ревакцинованій через 10 діб) та контрольній птиці. Курчат обох груп (по 10 курчат) інфікували інтеранозально вірулентним штамом вірусу хвороби Гамборо "52/70" (1000 3 ЕЛД 50/0,2 см ). Спостереження за курчатами проводили впродовж 14 діб (табл. 2). Впродовж спостереження вакциновані курчата після інфікування вірулентним штамом вірусу залишились клінічно здоровими, а контрольні не вакциновані захворіли у 100 %. Приклад 4. Визначення антигенної активності вірус-вакцини. Для встановлення антигенної активності вірус-вакцини використовували дві групи курчат по 10 голів. Перша група була щеплена (вакцинована та ревакцинована), а друга була контрольна - не вакцинована. Через 14 діб після ревакцинації у курчат асептично відбирали проби крові з підкрильцевої вени. Дослідження сироваток крові на наявність антитіл до вірусу хвороби Гамборо визначали за допомогою тест-системи виробництва "IDEXX" (табл. 3). Як видно з таблиці 3, проективні титри антитіл виявлені у 100 % щепленої птиці. Таким чином, були отримані результати, які свідчать про те, що ця вірус-вакцина відповідає всім вимогам з якості, здатна викликати напрацювання специфічних антитіл у імунізованої птиці в високих титрах (антигенноактивна) та при інфікуванні птиці високовірулентним вірусом ІБХ забезпечує 100 % захист птиці проти даної інфекції і може використовуватися у птахівництві. Таблиця 1 Вірус-вакцина-2 проти інфекційної бурсальної хвороби птиці (хвороби Гамборо) зі штаму "УМ-93" Доба спостереження 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Перша група курчат ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні 3 Друга група курчат ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні UA 119801 U Таблиця 2 Вірус-вакцина-2 проти інфекційної бурсальної хвороби птиці (хвороби Гамборо) зі штаму "УМ-93" Доба спостереження 1 2 3 4 5 ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні 6 ознаки захворювання відсутні 7 ознаки захворювання відсутні 8 ознаки захворювання відсутні 9 ознаки захворювання відсутні 10 ознаки захворювання відсутні 11 ознаки захворювання відсутні 12 ознаки захворювання відсутні 13 ознаки захворювання відсутні 14 ознаки захворювання відсутні Перша група курчат Друга група курчат (контроль) ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відсутні ознаки захворювання відмічені у 2 курчати ознаки захворювання відмічені у 2 курчати ознаки захворювання відмічені у 5-х курчат ознаки захворювання відмічені у 6 курчат (2 курчати загинуло) ознаки захворювання відмічені у 7 курчат (2 курчати загинуло) ознаки захворювання відмічені у 7 курчат (3 курчат загинуло) ознаки захворювання відмічені у 6-х курчат (4 курчати загинуло) ознаки захворювання відмічені у 6-х курчат (4 курчати загинуло) ознаки захворювання відмічені у 6-х курчат (4 курчати загинуло) Таблиця 3 Вірус-вакцина-2 проти інфекційної бурсальної хвороби птиці (хвороби Гамборо) зі штаму "УМ-93" вакцинована птиця не вакцинована птиця LgT Т Результат LgT Т Результат 1 3,01 1021 + 2,25 178 ± 2 3,35 2238 + 2,00 100 3 3,12 1321 + 1,84 69 4 3,02 1043 + 2,57 369 + 5 3,31 2063 +' 2,20 158 6 3,22 1649 + 2,57 369 + 7 3,32 2110 + 2,07 117 8 3,16 1456 + 9 2,89 782 + 2,45 279 + 10 3,17 1489 + 2,25 178 ± Інтерпретація результатів ІФА Т результат до 395 включно негативний від 396 позитивний № п.п 4 UA 119801 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Вірус-вакцина-2 проти інфекційної бурсальної хвороби птиці (хвороби Гамборо) зі штаму "УМ93", яка містить вірусвмісний матеріал із авірулентного штаму "УМ-93" вірусу бурсальної хвороби, як стабілізатор - захисне середовище, яка відрізняється тим, що як вакцинний штам використовують клонований штам "УМ-93", який був адоптований до курячих ембріонів, вільних від специфічних патогенних мікроорганізмів (КЕ ВСПМ). Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5