Штам бактерії bacillus circulans b-65 – продуцент цикломальтодекстринглюканотрансферази, спосіб його виділення та застосування для одержання b-циклодекстрину

УКРАЇНА (19) UA (11) 75352 (13) C2 (51) МПК (2006) C12N 1/20 C12N 9/10 C12P 19/18 (2006.01) C08B 37/16 (2006.01) C12R 1/09 (2006.01) МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) ШТАМ БАКТЕРІЇ BACILLUS CIRCULANS B-65 - ПРОДУЦЕНТ ЦИКЛОМАЛЬТОДЕКСТРИНГЛЮКАНОЦИКЛОДЕКСТРИНУ C2 (13) 75352 (11) Сільськогосподарських та Промислових Мікроорганізмів (NCAIM) – Будапешт- під номером NCAIM (P) 001277. 5. Штам бактерії Bacillus cirсulans B-65 за п. 4, який відрізняється тим, що він продукує цикломальтодекстринглюканотрансферазу позаклітинно. 6. Штам бактерії Bacillus cirсulans B-65 за п. 5, який відрізняється тим, що він є алкаліфільним і продукує фермент при рН у межах від 7 до 12. 7. Спосіб одержання цикломальтодекстринглюканотрансферази, який відрізняється тим, що алкаліфільний штам бактерії Bacillus cirсulans B-65 культивують за аеробних умов у рідкому живильному середовищі впродовж 24-120год. при температурі у межах від 25°С до 50°С, після культивування клітини видаляють центрифугуванням і фільтруванням і позаклітинно продуковану цикломальтодекстринглюканотрансферазу концентрують шляхом ультрафільтрування. 8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, живильне середовище містить: - джерело вуглецю, таке як крохмаль (0,5-3%); - джерело азоту (0,5-6%), вибране з групи, яку складають пептон, дріжджовий екстракт, дріжджовий автолізат, рідкий кукурудзяний екстракт або їхні суміші; - джерела мінералів: K2HPO4, MgSo4*7Н2О, Na2CO3. 9. Цикломальтодекстринглюканотрансфераза, продукована способом за п.7 або п.8, яка є специфічною щодо утворення -циклодекстрину, активною при температурі до 75°С (з оптимальною температурою 60°С), стійкою при температурі до 60°С, активною при рН у межах від 4,0 до 12,0 і стійкою при рН у межах від 6,0 до 10,0. 10. Спосіб одержання -циклодекстрину, який відрізняється тим, що на крохмаль діють цикломальтодекстринглюканотрансферазою зі штаму Bacillus cirсulans B-65 при температурі від 40°С до 70°С, при значенні рН розчину у межах 6,0-12,0, впродовж періоду часу тривалістю від 20год. до UA (21) 2002108074 (22) 06.04.2000 (24) 17.04.2006 (86) PCT/YU00/00010, 06.04.2000 (31) P-153/00 (32) 14.03.2000 (33) YU (46) 17.04.2006, Бюл. № 4, 2006 р. (72) Станковіч Слободан , YU, Пешіч Драган , YU, Сіміч Драга , YU (73) АД "ЗДРАВЛЄ", YU (56) US 4477568 A, 16.10.1984 WO 8903421 A, 20.04.1989 US 5658390 A, 19.08.1997 (57) 1. Спосіб виділення бактерій для вибору бактерій Bacillus circulans B-65, що продукують цикломальтодекстринглюканотрансферазу, який відрізняється тим, що зі зразка ґрунту виділяють бактерії, суспендують у воді з нагріванням до температури 80°С впродовж 10-15хв. і наносять на чашки з агаровим живильним середовищем, що містить крохмаль, пептон, дріжджовий екстракт, K2HPO4, MgSo4, Na2CO3, фенолфталеїн, геліантин та агар, після чого інкубують впродовж 20-72год. при температурі 37°С, відбирають колонії і ці колонії культивують на рідкому живильному середовищі для подальшого вибору, у той час як спостерігається продукування ферментів, та виділяють бактерії Bacillus circulans B-65. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що бактерії Bacillus circulans B-65 продукують цикломальтодекстринглюканотрансферазу позаклітинно. 3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що бактерії Bacillus circulans B-65 є алкаліфільними та продукують фермент при рН у межах від 7 до 12. 4. Штам бактерії Bacillus cirсulans B-65 – продуцент цикломальтодекстринглюканотрансферази, виділений з ґрунту, взятого у районі місцевості Лесковац, за допомогою способу за п. 1, депонований 16 жовтня 1999 року у Національній Колекції 2 (19) 1 3 75352 4 11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що 72год., і після завершення перетворення одержаний циклодекстрин видаляють шляхом осадження застосовують 5-15% розчин крохмалю. 12. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що трихлоретиленом або толуолом, після чого оптимальна температура становить 60°С. циклодекстрин видаляють шляхом перекристалі13. -циклодекстрин, одержаний способом за зації з дистильованої води. будь-яким з пп. 10-12. Цей винахід належить до галузі біотехнології і стосується способу одержання циклодекстрину із застосуванням дії циклодекстринглюканотрансферази (рекомендована IUPAC-IUB назва - цикломальтодекстринглюканотрансфераза, у подальшому ЦГТ-аза) на крохмаль і продукування ЦГТ-ази бактерією Bacillus circulans B-65. За Міжнародною Класифікацією цей винахід віднесено до таких класів: [С08В37/16; С12Р19/18; C12N1/20; C12N9/10]. Цей винахід вирішує проблему біосинтезу ЦГТ-ази, яка є придатною для одержання циклодекстрину, а також проблему одержання циклодекстрину із застосуванням дії ЦГТ-ази на крохмаль. Біосинтез ЦГТ-ази найчастіше здійснюється бактеріями, що належать до роду Bacillus, які, переважно, продукують ЦГТ-азу, дія якої на крохмаль забезпечує одержання суміші α-, β- та γциклодекстринів у різних співвідношеннях, у той час як вихід одного циклодекстрину є невисоким, а їх відокремлення підвищує витрати на виробництво. Біосинтез ЦГТ-ази, за цим винаходом, здійснюється новою алкаліфільною бактерією Bacillus circulans B-65, що відрізняється продукуванням великої кількості ЦГТ-ази, яка є придатною для одержання циклодекстрину. Циклодекстрини одержують із застосуванням ЦГТ-ази бактерії В. circulans, що відрізняється високим ступенем перетворення крохмалю на циклодекстрини і є специфічною щодо одержання β-циклодекстрину. Циклодекстрини одержують дією ЦГТ-ази на крохмаль. Найважливішою стадією способу одержання циклодекстринів є продукування ЦГТ-ази. ЦГТ-аза продукується деякими видами бактерій, серед яких найчастіше зустрічаються бактерії, що належать до роду Bacillus: В. macerans, В. circulans, В. megaterium, В. coagulans, В. lentus, В. ohbensis, В. firmus, В. amyloliquefaciens, В. stearothermophilus, В. subtilis, В. cents. ЦГТ-аза, окрім бактерій роду Bacillus, продукується деякими іншими бактеріями, наприклад: Klebsiella pneumoniae, Micrococcus luieus, Micrococcus varians. Продуцентами ЦГТ-ази найчастіше є Bacillus macerans та алкаліфільні бактерії, що належать до роду Bacillus. ЦГТ-азу одержують шляхом культивування бактерій у рідкому живильному середовищі за аеробних умов у ферментері. Цей процес є доволі дорогим, а бактерії продукують певну кількість ЦГТ-ази. Дорогий спосіб одержання ЦГТ-ази значно впливає на високу вартість кінцевого продукту, тобто циклодекстрину, що обмежує його широке застосування у ряді промислових галузей. Оскільки циклодекстрини мають широкий діапазон можливих застосувань у великій кількості промислових галузей, а їх ціна є одним із важливих факторів, що обмежує їх застосування, вчені усього світу вишукують шляхи підвищення економічних показників способу одержання ЦГТ-ази. З цією метою вдаються до оптимізації складу живильного середовища та оптимізації фізичних і хімічних факторів культивування бактерій, ведуться роботи, спрямовані на підвищення продуктивності бактерій із застосуванням різних генетичних методів (індукований мутагенез, генна інженерія), окрім того, ведуться роботи по виділенню нових мікроорганізмів, які відрізняються високим рівнем продукування ЦГТ-ази. У способі одержання циклодекстрину дуже важливими є також характеристики ЦГТ-ази, що продукується бактеріями. Характеристики ЦГТ-аз, що продукуються різними видами бактерій, які належать до роду Bacillus, наведені у Таблиці 1. Таблиця 1 Характеристики ЦГТ-аз різних мікроорганізмів Продуцент ЦГТ-ази Bacillus coagulans (термофільна бактерія) Алкаліфільна Bacillus sp. (АТСС 21783) Bacillus macerans (IFO3490) Bacillus lentus (алкаліфільна бактерія) Bacillus sp. (алкаліфільна бактерія) Bacillus sp. (термофільна бактерія) Bacillus stearothermo-philus Bacillus macerans (IAM 1243) Bacillus macerans Bacillus macerans (IFO 3490) Bacillus megaterium Bacillus circulans Bacillus amyloliquefaciens Bacillus sp. Співвідношення одержаних α:β:γциклодекстринів Опти-мальна Термостабіль-ність ОптиСта(°С) темпе-ратура мальний рН більність рН (°С) без Са2+ з Са2+ 2:2,6:1 6,5 6,0-9,0 65 50 60 71% βциклодекстрину 71% α-циклодекстрину 1:67:1,6 переважно β-циклодекстрин 2,7:1:1 1:2,4:1 3:3:1 95% α-циклодекстрину 1,6:4:1 6,5 та 8,5 5,5 6,5-7,5 6,0 6,5 5,0-5,5 6,0 5,4-5,8 5,0-5,7 5,0-5,7 5,5 6,0 5,5 65 6,5-8,5 6,0-11 5,0-10 5,0-8,0 53,5-9,5 8,0-10 7,0-10 6,0-9,0 6,0-9,5 55 45-55 55 50 70-75 60 60 55 55 60 70 65-70 60 55 65 50 50 60 55 45 60 65 70 60 65 5 75352 6 Продовження таблиці 1 Bacillus ohbensis Bacillus macerans (IAM 1227) Bacillus circulans (IFO3329) Bacillus coagulans (термофільна бактерія) Bacillus cereus (NCIMB 13123) Bacillus firmus (алкаліфільна бактерія) Алкаліфільна Bacillus subtilis Алкаліфільна Bacillus sp. переважно β-циклодекстрин переважно α-циклодекстрин β->α-циклодекстрин 1:0,9:0,3 22:23:0 0,08:1:0,2 0:25,1:4,7 5,7:23,5:4,7 Наведені дані показують, що ЦГТ-ази різних мікроорганізмів демонструють схожість характеристик, але є певні різниці. ЦГТ-ази, більш над усе, різняться за специфічною кількістю утворення α-, β- або γ-циклодекстрину. ЦГТ-ази переважно утворюють суміш α-, β- і γ-циклодекстринів у різному співвідношенні. Існують, однак, ЦГТ-ази, що не утворюють α- або γ-циклодекстринів. Більшість ЦГТ-аз утворює суміш циклодекстринів, де переважає β-циклодекстрин, у той час як γциклодекстрин становить найменшу кількість. Алкаліфільні мікроорганізми продукують ЦГТ-ази, які забезпечують одержання найбільшої кількості βциклодекстрину, порівняно з αта γциклодекстринами. ЦГТ-ази алкаліфільних мікроорганізмів утворюють β-циклодекстрин, який становить більше за 70% від загальної кількості циклодекстринів. Дані, наведені у Таблиці 1, дозволяють дійти висновку, що ЦГТ-ази, які продукуються штамами, що належать до виду Bacillus macerans, забезпечують найвищий вихід α-циклодекстрину, порівняно з іншими циклодекстринами. Окрім В. macerans, ЦГТ-аза, що продукується В. amyloliquefaciens AL 35, також забезпечує одержання α-циклодекстрину з виходом до 95%. На відміну від більшості ЦГТ-аз різних продуцентів, ЦГТ-аза, яка продукується Bacillus subtilis №313, утворює γ-циклодекстрин, але не утворює ні α-, ні β-циклодекстрину. Окрім того, ЦГТ-аза Bacillus sp. AL-6 забезпечує найвищий вихід γ-циклодекстрину і β-циклодекстрину, але не утворює αциклодекстрину. У способі одержання циклодекстринів із застосуванням ЦГТ-аз, які забезпечують одержання суміші, після завершення реакції одержують α-, β- і γ-циклодекстрини у різних співвідношеннях і підвищений вихід будь-якого циклодекстрину спричинює нижчий вихід інших циклодекстринів. Після завершення ферментативної реакції одержання циклодекстринів, здійснюють їх відокремлення та очищення. Оскільки відокремлення та очищення циклодекстринів підвищує вартість способу їх одержання, бажаним є виділення мікроорганізмів, що продукують ЦГТ-ази, специфічні щодо утворення одного з циклодекстринів. Біосинтез ЦГТ-ази, яку пізніше застосовують для одержання циклодекстрину, здійснюється алкаліфільною бактерією Bacillus circulans B-65. Біосинтез здійснюють шляхом культивування бактерії у ферментері у рідкому середовищі з лужною реакцією (рН10) за аеробних умов. Після завершення біосинтезу бактеріальні клітини видаляють центрифугуванням або фільтруванням, після чого позаклітинно продуковану ЦГТ-азу концентрують шляхом ультрафільтрування. Дією одержаної таким чином ЦГТ-ази на крохмаль (з концентрацією від 5% до 15%) одержують 5,5 5,5 6,0 5,0 6,5-9,5 6,5-8,5 6,0-9,5 60 50 55 40 50 40 55 50 55 циклодекстрини. Ферментативну реакцію здійснюють впродовж 24год. у живильному середовищі з лужною реакцією (рН8,0) при температурі 60°С. Новизна цього винаходу полягає у тому, що біосинтез ЦГТ-ази, що застосовується для одержання циклодекстрину, здійснюється із застосуванням алкаліфільної бактерії В. circulans B-65. Згадана бактерія була виділена зі зразка ґрунту, який було взято у районі місцевості Лесковак (Leskovac). В. circulans відібрали з-посеред приблизно 2000 бактеріальних колоній, які відрізнялись продукуванням ЦГТ-ази. Штам, який пізніше ідентифікували і позначили як В. circulans B-65, продемонстрував значно вищу активність продукування ЦГТ-ази і за цією характеристикою він чітко відрізнявся від інших штамів. Таким чином, алкаліфільна В. circulans B-65 є новим штамом, який відрізняється тим, що продукує велику кількість ЦГТ-ази, яка може застосовуватись для одержання циклодекстринів. Бактерію Bacillus circulans B65 депоновано у Національній Колекції Сільськогосподарських та Промислових Мікроорганізмів (NCATM) - Будапешт, під таким номером: NCATM(P) 001277. Перевага застосування ЦГТ-ази, що продукується нашим алкаліфільним штамом В. circulans B65, полягає у тому, що вона може застосовуватись для одержання β-циклодекстрину. ЦГТ-аза нашого штаму є специфічною щодо одержання βциклодекстрину і відрізняється високим ступенем перетворення крохмалю на β-циклодекстрин. За описаних умов реакції, при 5% концентрації крохмалю, ЦГТ-аза здійснює майже 45% перетворення крохмалю на циклодекстрин. Із загальної кількості одержаних циклодекстринів, кількість βциклодекстрину становить майже 95%, що є більш високим відсотком, порівняно з даними з доступної літератури. Виділення та відбір ЦГТ-аза-продукуючих бактерій ЦГТ-аза-продукуючі бактерії були виділені з 54 різних зразків ґрунту, що відбирались у районі місцевості Лесковак. Ґрунтову суспензію (від 0,5г до 1,0г) у 10мл стерильної дистильованої води нагрівали впродовж 10хв. при температурі 80°С. Після нагрівання 0,1мл ґрунтової суспензії переносили на чашку з агаровим середовищем Парка (Park), яке містило: 1% розчинного крохмалю, 0,5% пептону, 0,5% дріжджового екстракту, 0,1% K2НРО4, 0,02% MgSO4 7H2O, 1% Na2CO3, 0,03% фенолфталеїну, 0,01% геліантину, 1,5% агару, рН10,0 (Парк (Park) та інші). Інкубування здійснювали при температурі 37°С. Після 48год. інкубування відбирали та очищали колонії, які були оточені найбільшими зонами жовтого кольору на чашках з агаровим середовищем, що мали червоне забарвлення. 7 75352 8 Кількість колоній, одержаних із різних зразків, вищах з 2%, 5%, 7% і 10% NaCl. також була різною і коливалась у межах від 0 до Морфологічні і фізіологічно-хімічні характерис200. Колонії, що продукували ЦГТ-азу, були ототики штаму В-65 найбільшою мірою співпадають із чені зонами жовтого кольору різного розміру. Різні характеристиками виду Bacillus circulans. Суттєвою зразки ґрунту мали різний відсоток колоній, що характеристикою штаму В-65, однак, є те, що він продукували ЦГТ-азу. Вони становили від 0% до демонструє добрий ріст на живильному середо90% від загальної кількості колоній. Приймаючи до вищі з лужною реакцією (рН10) і не росте на живиуваги розмір зони довкола колонії, були відібрані льному середовищі з нейтральною реакцією, ната очищені 85 з 2000 колоній, що продукували приклад, на живильному бульйоні (рН6,8), що ЦГТ-азу. Після очищення на середовищі Парка, 45 відрізняє його від описаних членів виду Bacillus колоній відібрали для додаткової обробки. Відібcirculans. Штам В-65 також відрізняється від членів рані колонії перенесли на косячки агару із середовиду Bacillus circulans тим, що росте на живильновищем Хорікоші (Horikoshi) II, і після інкубування їх му середовищі з 10% NaCl. зберігали при температурі +4°С. На основі показаних характеристик штам В-65 Продукування ЦГТ-ази, для додаткового відідентифікували як член виду Bacillus circulans. Забирання штамів, здійснювали шляхом культивувдяки його здатності до хорошого росту на жививання 45 відібраних алкаліфільних штамів у рідкольному середовищі з лужною реакцією (рН10) і му середовищі у колбах Ерленмейєра з відсутністю росту на живильному середовищі з переміїпуванням. Інкубування здійснювали при нейтральною реакцією, штам В-65 було позначено температурі 37°С впродовж 48год. із постійним як алкаліфільна Bacillus circulans В-65. Характериперемішуванням (200об/хв). На третій та четверстики штаму В-65 наведені у Таблиці 2. тий день відбирали зразки і, після видалення бакТаблиця 2 теріальних клітин шляхом центрифугування (10000xg, 10хв, +4°С), визначали амілолітичну та Характеристики бактерій циклодекстриногенну активність супернатанту. Bacillus circulans (АТСС 4513) та штаму В-65 Амілолітична активність штаму знаходилась у Bacillus межах від 0,4Од/мл до 12,17Од/мл. Найбільша Морфологічні та фізіологічноcirculans Ізолят В-65 біохімічні характеристики кількість штамів демонструвала амілолітичну ак(АТСС 4513) тивність у межах від 1Од/мл до 2Од/мл. Кількість Форма Палички Палички Розмір (мкм) штамів, що демонстрували підвищену амілолітич0,5-0,7 2-5 0,6-0,7 2-4 Рухливість + + ну активність, поступово зменшувалась, завдяки Форма спор Еліптична Еліптична чому амілолітична активність, що перевищувала Забарвлення за Грамом + + 5Од/мл, була продемонстрована лише 3 штамами. Катал аза + + Циклодекстриногенна активність знаходилась у Ріст за анаеробних умов + + Реакція Фогес-Проскауера межах від 0,019Од/мл до 0,530Од/мл. ЦиклодекстПродукування кислот з вуглеводів: риногенна активність найбільшої кількості штамів D-глюкоза + + досягала рівня 0,100Од/мл. Циклодекстриногенна L-арабіноза + + активність, що перевищувала 0,200Од/мл, була D-ксилоза + + продемонстрована лише одним штамом. Штам ВD-маніт + + Продукування газу з глюкози 65 продемонстрував амілолітичну активність на Гідроліз: желатини + + рівні 12,17Од/мл і циклодекстриногенну активність крохмалю + + на рівні 0,530Од/мл. Ці показники були значно виВикористання цитратів щими, порівняно з показниками інших штамів. Продукування індолу Морфологічні та таксономічні характеристики Ріст при рН: 6,8 (живильний бульйон) + бактерії 5,7 + З метою ідентифікування були встановлені Ріст з NaCl: морфологічні та фізіологічно-біохімічні характери2% + + стики бактерії. Результати дослідження були про5% + + 7% + + аналізовані за допомогою [довідника "Bergey's 10% + Manual of Systematic Bacteriology" (Снід (Sneath), Ріст при температурі: 1968)]. Bacillus circulans (АТСС (Американська ко30°С + + лекція типових культур) 4513) використовувалась 37°С + + як еталонний штам. 40°С + + Результати цих досліджень показали, що бакБіосинтез ЦГТ-ази В. circulans B-65 терія має форму палички, розмір 0,6-0,7 2-4мкм, є Біосинтез ЦГТ-ази В. circulans B-65 здійснюрухливою, грампозитивною, утворює еліптичні ють шляхом культивування на рідкому живильноендоспори, росте за аеробних та анаеробних умов му середовищі з лужною реакцією (рН10). Живиі продукує каталазу. Ці характеристики показали, льний бульйон містить 1% розчинного крохмалю, що згадана бактерія належить до роду Bacillus. 0,5% пептону-1, 0,5% дріжджового екстракту, 0,1% Результати цих досліджень показали, що бактерія має негативну реакцію Фогес-Проскауера, продуK2НРО4, 0,02% MgSO4 7H2O, 1% Na2CO3. кує кислоти з глюкози, арабінози, ксилози і маніту, Інокулят для продукування ЦГТ-ази одержуване продукує газу з глюкози, гідролізує желатину і ли шляхом введення культури, що відбиралась з крохмаль, не використовує цитратів, не продукує косячка агару, до рідкого живильного середовища. індолу, не росте на живильних середовищах з Інкубування здійснювали при температурі 37°С рН6,8 і 5,7 і демонструє хороший ріст на середопри постійному перемішуванні (200об./хв..) впро 9 75352 10 довж 48год. До ферментера зі свіжим живильним важлива характеристика В. circulans В-65 полягає середовищем вводили 5% інокуляту. Біосинтез у тому, що вона, окрім ЦГТ-ази, не продукує жодЦГТ-ази здійснювали впродовж 96год. при темпених інших амілолітичних ферментів. Присутність ратурі 37°C із потоком стерильного повітря (0,5 цих ферментів у препараті ЦГТ-ази у процесі одеоб'єму повітря на 1 об'єм середовища/хв.) при ржання циклодекстрину спричинила б гідроліз кро-1 швидкості обертання мішалки 300хв . Після 96год. хмалю, тобто вона б викликала зменшення концекультивування бактеріальні клітини видаляють нтрації субстрату для одержання циклодекстрину, шляхом центрифугування (10000xg, 10хв, +4°С) що мало б негативний вплив на кінцевий вихід. або відфільтровують, після чого ультрафільтванПеревага біосинтезу ЦГТ-ази В. circulans В-65, ням концентрують позаклітинно продуковану ЦГТпорівняно з деякими іншими продуцентами цього азу. Подібним чином продуковану ЦГТ-азу пізніше ферменту, полягає у тому, що біосинтез ЦГТ-ази застосовували для одержання циклодекстрину. В. circulans В-65 відбувається у живильному сереПід час згаданого процесу визначали амілолітичну довищі з дуже високою лужною реакцією (рН10), та циклодекстриногенну активність ЦГТ-ази, позазавдяки чому зменшується ризик інфікування деклітинно продукованої В. circulans B-65. Ріст клітин якими іншими мікроорганізмами, що є дуже важта продукування ЦГТ-ази В. circulans B-65 у разі ливим фактором для умов промислового виробкультивування за описаних умов наведені у Табництва. лиці 3. Характеристики ЦГТ-ази В. circulans В-65 Окрім того, що В. circulans В-65 продукує веТаблиця 3 лику кількість ЦГТ-ази, дуже важливим є те, що ця ЦГТ-аза відрізняється добрими властивостями Продукування ЦГГ-ази, ріст клітин і щодо термостабільності та оптимальної темперазміни рН під час культивування В. circulans B-65 тури її активності, а також щодо стабільності рН та Активність ЦГТ-ази (Од/мл) оптимального рН. Час Ріст клітин Амілолітична Циклодекстриногенна (год.) (610нм) ЦГТ-аза В. circulans В-65 відрізняється тим, що активність активність вона є стабільною при температурах до 55°С, а за 0 / / 0,125 присутності іону Са2+ її стабільність зростає до 24 7,30 0,20 1,677 48 9,70 0,24 1,489 температури 60°С. Окрім того, оптимальною тем72 14,85 0,38 1,497 пературою для її дії є 60°С. Завдяки високій оптимальній температурі дії та високій термостабільЦГТ-аза продукується під час росту клітин. До ності ЦГТ-ази В. circulans B-65, спосіб одержання завершення фази росту рівень циклодекстриноциклодекстрину може здійснюватись при темперагенної активності досягає 0,20Од/мл, що дещо турі 60°С. Перевага одержання циклодекстринів перевищує 30%, порівняно зі значенням активноспри високій температурі полягає у тому, що за цих ті, яке реєструється після 96год. культивування. умов реакції зменшується ризик інфікування мікПісля завершення фази росту продукування ЦГТроорганізмами. Окрім того, при високих темпераази продовжується, завдяки чому після 96год. кутурах швидкість ферментативної реакції є більльтивування циклодекстриногенна активність дошою, що скорочує тривалість процесу одержання сягає значення 0,60Од/мл, а рівень амілолітичної циклодекстрину. активності становить 23,37Од/мл. Підвищення ЦГТ-аза В. circulans B-65 відрізняється тим, що циклодекстриногенної та амілолітичної активності оптимальний для її активності показник рН знахопісля завершення фази росту становить майже диться у межах від рН5,0 до рН6,0, однак ЦГТ-аза 70% від загального значення. Таким чином, рівень зберігає свою активність у доволі широкому діапапродукування ЦГТ-ази штамом В-65 є значно визоні значень рН у живильному середовищі з лужщим після завершення фази клітинного росту. ною реакцією. ЦГТ-аза В. circulans B-65 є стійкою у Під час культивування В. circulans В-65 відбудіапазоні рН6,5-10,0. Завдяки цим властивостям вається пропорційне зростання амілолітичної та ЦГТ-ази, одержання циклодекстрину може здійсциклодекстриногенної активності, що дозволяє нюватись у широкому діапазоні значень рН. дійти висновку про те, що В. circulans В-65 продуРезультати дослідження характеристик ЦГТкує ЦГТ-азу і не продукує жодних інших амілолітиази В. circulans B-65 подані у наведеному нижче чних ферментів. тексті. Цей висновок підтверджується результатами Вплив рН на активність ЦГТ-ази визначення вмісту циклодекстринів та відновлюВплив рН на активність ЦГТ-ази досліджували ваних цукрів під час інкубування ЦГТ-ази В. у діапазоні рН від 4,0 до 10,0 при температурі circulans В-65 із крохмалем. Згадані результати 40°С. Для регулювання рН застосовували буфери показали, що утворення циклодекстрину відбуванаведеного нижче складу: 50мМ оцтовий буфер ється під час реакції, у той час як кількість віднов(рН4-5), 50мМ фосфатний буфер (рН5-8), 50мМ люваних цукрів не збільшується, що відбувалося б карбонатний буфер (рН8-10). Результати цих досу разі присутності інших амілолітичних ферментів. ліджень, наведені у Таблиці 4, показують, що опПеревага згаданого способу продукування тимальне для активності ЦГТ-ази значення рН ЦГТ-ази, яка показана наведеними результатами, знаходиться у межах від рН5,0 до рН6,0, однак полягає у тому, що біосинтез ЦГТ-ази здійснюєтьЦГТ-аза зберігає свою активність у доволі широся новою алкаліфільною бактерією В. circulans Вкому діапазоні значень рН у живильному середо65, яка відрізняється позаклітинним продукуванвищі з лужною реакцією. ням великої кількості ЦГТ-ази. Окрім того, інша 11 75352 Таблиця 4 Циклодекстриногенна Активність ЦГТ-ази при різних значеннях рН рН Буфер (50мМ) 4 Оцтовий 4,5 5 5,5 6 Фосфатний 6,5 7 8 9 Карбонатний 10 Циклодекстриногенна активність (Од/мл) 0,18 0,74 0,92 0,91 0,89 0,76 0,66 0,56 0,42 0,26 Відносна активність (%)1 19,8 80,4 100 98,9 96,7 82,6 71,7 60,3 45,2 28,6 1 Відносну активність виражають як відсоток відносно максимальної активності, визначеної при рН5,0 Вплив рН на стабільність ЦГТ-ази Вплив рН на стабільність ЦГТ-ази досліджували у діапазоні значень рН від 4,0 до 12,0. Для регулювання рН застосовували такі буфери: 50мМ оцтовий буфер (рН4-5), 50мМ фосфатний буфер (рН6-7), 50мМ трис-НСІ буфер (рН8-10) і 50мМ гліциновий-NaOH буфер (рН11-12). ЦГТ-азу інкубували при різних значеннях рН впродовж 1год. при температурі 40°С, після чого рН доводили до 6,0 і визначали залишкову активність ферменту. Результати цих досліджень, наведені у Таблиці 5, показали, що ЦГТ-аза зберігала стійкість у широкому діапазоні значень рН від 6,5 до 10,0. Таблиця 5 Залишкова активність ЦГТ-ази після інкубування при різних значеннях рН РН 4 5 6 6,5 7 8 9 10 11 12 Буфер (50мМ) Оцтовий Фосфатний трис-НСl Гліцин-NaOH Залишкова активність (%) 0 39,1 90,7 97,6 100 100 97,3 97,3 18,1 6,3 Вплив температури на активність ЦГТ-ази Вплив температури на активність ЦГТ-ази визначали у діапазоні температур від 30°С до 75°С при рН6,0. Результати цих досліджень показали, що оптимальною температурою для активності ЦГТ-ази є температура 60°С (Таблиця 6). Таблиця 6 Активність ЦГТ-ази при різних температурах Температура (°С) 30 40 45 50 55 60 65 70 75 Відносна активність (%) 23,1 36,2 49,8 71,7 85 100 94,7 45,3 15,9 12 Вплив температури на стійкість ЦГТ-ази Вплив температури на стійкість ЦГТ-ази визначали у діапазоні температур від 30°С до 80°С. Дослідження термостабільності ЦГТ-ази здійсню2+ вали з/без іона Са з концентрацією 10мМ. ЦГТазу інкубували впродовж 30хв. при різних температурах при рН8,5, після чого рН доводили до 6,0 і визначали залишкову активність ферменту. Результати досліджень (Таблиця 7) показали, що ЦГТ-аза залишалась стабільною у діапазоні температур до 55°С і що у присутності іона Са2+ її стабільність підвищувалась до температури 60°С. Таблиця 7 Залишкова активність ЦГТ-ази після інкубування при різних температурах Температура (°С) 30 40 50 55 60 65 70 75 80 Залишкова актив-ність (%) без Са2+ 97 98,3 96 95 52,8 17,2 3 Залишкова активність (%) з Са2+ 97,3 96,8 96,8 98,2 96,8 81,7 19,0 0 0 Одержання циклодекстрину Циклодекстрин одержували шляхом дії ЦГТази В. circulans B-65 на крохмаль із концентрацією у межах від 5% до 15%. Завдяки високій оптимальній температурі під час дії та високій термостабільності ЦГТ-ази В. circulans B-65, спосіб одержання циклодекстрину можна було здійснювати при температурі до 60°С. Щодо значень рН, одержання циклодекстрину можна було здійснювати у широкому діапазоні від рН6,5 до рН10,0. Вихід циклодекстрину під час інкубування 5% розчину крохмалю з різними концентраціями ЦГТази при температурі 40°С і рН6,5 наведено у Таблиці 8. Таблиця 8 Вихід циклодекстринів при різних концентраціях ЦГТ-ази1 Концентрація ферментів (Од/г крохмалю) Час інку- Цикло- Вихід циклобування декстрин декстрину2 ЦиклодекстриАмілолітична (год.) (г/л) (%) ногенна активактивність ність 0,6 23,4 24 10,8 21,6 1,2 46,8 24 11,2 22,3 1,8 70,2 24 11,7 23,3 2,4 93,6 24 12,1 24,2 3,0 117 24 14,8 29,5 48 19,2 38,4 4,5 175 24 17,8 35,6 48 19,7 39,4 6,0 234 24 21,7 . 43,3 48 22,5 44,9 7,5 293 24 21,1 42,2 48 20,3 40,6 1 Реакційну суміш, що містила крохмаль (5%) і відповідну концентрацію ферменту, інкубували впродовж 48год. при температурі 40°С. 2 Вихід циклодекстрину виражає ступінь перетворення крохмалю на циклодекстрин. 13 75352 14 Найкращі результати одержали при концентванні (200об./хв.). рації ЦГТ-ази 6,0Од (циклодекстриногенна активДо ферментера, що містив 9л живильного сеність)/г крохмалю. При цій концентрації ЦГТ-аза редовища Хорікоші II, вводили 450мл інокуляту. перетворювала на циклодекстрини майже 45% Культивування здійснювали впродовж 96год. при крохмалю. температурі 37°C із потоком стерильного повітря Після завершення ферментативної реакції для (0,5 об'єму повітря на 1 об'єм середовища/хв.) при одержання циклодекстринів, вони можуть видаляшвидкості обертання мішалки 300хв-1. Під час кутись із реакційної суміші, наприклад, осадженням, льтивування відбирали зразки і визначали амілоза допомогою трихлоретилену або толуолу. З осалітичну і циклодекстриногенну активність супернаджених циклодекстринів β-циклодекстрин може танту. Після 96год. культивування бактеріальні видалятись шляхом кристалізації завдяки тому, клітини видаляли шляхом центрифугування що він є значно менше розчинним порівняно з ін(10000xg, 10хв., +4°С) з подальшим концентруваншими циклодекстринами. Циклодекстрини, одерням позаклітинно продукованої ЦГТ-ази шляхом жані шляхом осадження, розчиняють у дистильоультрафільтрування. ваній воді з нагріванням при температурі 100°С з В. circulans B-65, культивована таким чином, подальшою кристалізацією β-циклодекстрину через 96год. позаклітинно продукувала ЦГТ-азу з шляхом повільного зниження температурі до 20амілолітичною активністю 23,4Од/мл і циклодекст25°С з обережним перемішуванням. Після цього риногенною активністю 0,6Од/мл. Після конценткристали β-циклодекстрину відфільтровують, прорації ферменту шляхом ультрафільтрування, амімивають невеликою кількістю холодної води і сулолітична активність становила 450Од/мл і шать при температурі 70°С. циклодекстриногенна активність становила Шляхом аналізу одержаних у кінці процесу ци12Од/мл. клодекстринів спектрофотометричними методами Приклад 2 та засобами високоефективної рідинної хроматогОдержання циклодекстрину рафії було встановлено, що ЦГТ-аза В. circulans BРозчинний крохмаль (300г) розводили у 6л во65, за умов, опис яких було наведено вище, переди з нагріванням. Температуру доводили до 40°С, творює на циклодекстрини (головним чином, на βрН до 6,5. До розчину крохмалю додавали ЦГТ-азу циклодекстрин) до 45% крохмалю. Кількість βз концентрацією 6Од (циклодекстриногенна активциклодекстрину серед одержаних циклодекстринів ність)/г крохмалю. Інкубування здійснювали впростановить близько 95%, у той час як кількість αдовж 30год. при температурі 40°С. циклодекстрину становить 2-3%, а кількість γПісля 30год. інкубування реакцію припиняли циклодекстрину становить 0,6-3%. шляхом нагрівання реакційної суміші впродовж ЦГТ-аза В. circulans B-65 відрізняється тим, що 10хв. при температурі 100°С. Після цього реакційвона є специфічною щодо утворення βну суміш знебарвлювали активованим деревним циклодекстрину і перетворює на β-циклодекстрин вугіллям. Після відфільтровування активованого високий відсоток крохмалю. Унаслідок цього, задеревного вугілля, циклодекстрини осаджували з стосування ЦГТ-ази нашого штаму має значні переакційної суміші (6л) за допомогою трихлеретиреваги для одержання β-циклодекстрину, порівнялену (1,2л). Осаджені циклодекстрини після цього но з ЦГТ-азами інших відомих бактерій. відфільтровували, потім сушили при температурі Наведені нижче приклади ілюструють цей ви70°С. Кінцевий вихід становив 107г циклодекстринахід без його обмеження. нів із 300г крохмалю. Приклад 1 Одержані циклодекстрини розчиняли у 500мл Продукування ЦГТ-ази дистильованої води з нагріванням при температурі ЦГТ-азу одержували шляхом культивування В. 100°С. Після цього здійснювали кристалізацію βcirculans B-65 у рідкому живильному середовищі, циклодекстрину шляхом поступового зниження що містило: 1% розчинного крохмалю, 0,5% пептемператури до 20-25°С з обережним перемішутону, 0,5% дріжджового екстракту, 0,1% K2НРО4, ванням. Після відстоювання впродовж ночі при температурі +4°С кристали відфільтровували, 0,02% MgSO4 7H2O, 1% Na2CO3. Інокулят для промивали невеликою кількістю холодної дистипродукування ЦГТ-ази одержували шляхом ввельованої води і сушили при температурі 70°С. Подення культури, що відбиралась з косячка агару, дібним чином одержали 75,2г β-циклодекстрину у до 450мл рідкого живильного середовища Хорікоформі кристалів білого кольору. ші II. Інкубування здійснювали впродовж 48год. при температурі 37°C при постійному перемішу Комп’ютерна верстка Т. Чепелева Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601