Спосіб захисту рослин від бактеріального раку з використанням лактобацил

Реферат: Спосіб захисту рослин від бактеріального раку з використанням лактобацил полягає в тому, що для обробки рослин від захворювань використовують молочнокислі бактерії Lactobacillus plantarum, які культивують протягом 48 годин у середовищі MRS. Бактерії Lactobacillus plantarum виділяють як з рослинних поверхонь, так й з кисломолочних продуктів і неферментованих грибів, а суспензії культур залишають у рідкому середовищі MRS, в якому бактерії було вирощено, і обробляють ними дводольні рослини для захисту від бактеріального раку, спричиненого Agrobacterium tumefaciens і Agrobacterium vitis. UA 75360 U (54) СПОСІБ ЗАХИСТУ РОСЛИН ВІД БАКТЕРІАЛЬНОГО РАКУ З ВИКОРИСТАННЯМ ЛАКТОБАЦИЛ UA 75360 U UA 75360 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до способів боротьби з фітопатогенами і являє собою засіб біологічного захисту захворювань рослин. Даний спосіб може застосовуватися для знищення фітопатогенних бактерій Agrobacterium tumefaciens і Agrobacterium vitis - збудників бактеріального раку дводольних рослин. Бактеріальний рак дводольних рослин спричиняє збитки врожаям багатьох плодових та декоративних культур. Захворювання є поширеним у багатьох країнах світу, і передається на нові території з інфікованим садивним матеріалом. В Україні від бактеріального раку найбільш потерпає виноград. До 70 % молодих насаджень може загинути через розвиток цієї хвороби, що призводить до значних економічних збитків у виноградарстві. Крім того, бактеріальний рак може зустрічатися на вишні, яблуні, персику, трояндах, хризантемах та інших культурах. Це захворювання переважно розсадницьких комплексів, оскільки воно нерідко проявляється при підрощуванні садивного матеріалу, отриманого після щеплення, і розвивається на місці сполучення підщепи і прищепи через велику ранову поверхню. Особливо необхідними є обробки за допомогою запропонованого способу молодих рослин, для яких бактеріальний рак є найбільш небезпечним. Оскільки вхідними воротами для інфікування збудниками бактеріального раку є ранові поверхні, особливо доцільним є застосування запропонованого способу під час пересадки рослин. Молочнокислі бактерії, колонізуючи ранові поверхні, перешкоджають їх заселенню патогенами. Біологічний захист є нешкідливою для навколишнього середовища альтернативою хімічних обробок, до того ж хімічні препарати не проникають всередину рослин, а отже, не є достатньо ефективними по відношенню до збудників бактеріального раку, які населяють судини ксилеми. Лактобацили (бактерії роду Lactobacillus) є мікроорганізмами з найвищим рівнем безпеки для людини та навколишнього середовища. Вони є абсолютно безпечними при вживанні в їжу і їх ферментативні процеси становлять основу багатьох виробництв харчових продуктів кисломолочних продуктів, м'ясних виробів, квашених овочів. Лактобацили, зокрема види Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus salivarius населяють філосферу та ризосферу і можуть захищати рослини шляхом синтезу антагоністичних речовин - органічних кислот, перекису водню, бактеріоцинів. Відома невелика кількість способів використання молочнокислих бактерій для захисту рослин від фітопатогенів. Досягнутий рівень в області біологічних препаратів за участю бактерій роду Lactobacillus описано в наступних джерелах. Відомий спосіб захисту рослин, описаний в Wang Η., Yan Y., Wang J., Zhang Η., Qi W. Production and characterization of antifungal compounds produced by Lactobacillus plantarum IMAU10014 // PloS ONE.-2012. - Vol. 7, # 1: e29452. doi: 10.1371/journal.pone.0029452. Запропоновано застосовувати штами Lactobacillus plantarum проти фітопатогенних грибів, в тому числі - проти представників роду Fusarium. Бактерії, які використовувалися для біологічного захисту, виділяли лише з поверхні рослин. Вплив даних бактерій на збудників бактеріального раку невідомий. Відомий спосіб використання молочнокислих бактерій, в тому числі - Lactobacillus plantarum, проти збудників гнилі овочів та фруктів при їх зберіганні (Trias R., Baneras L., Montesinos E., Badosa Ε. Lactic acid bacteria from fresh fruit and vegetables as biocontrol agents of phytopathogenic bacteria and fungi // International Microbiology.-2008. - Vol. 11. - P. 231-236). Показано, що застосування суспензії клітин Lactobacillus plantarum, виділених з овочів та фруктів, спричиняло пригнічення росту грибів Botrydis cinerea, Моnilinia laxa та бактеріального фітопатогена Xanthomonas vesicatoria. Рівень інфекції за нанесення штамів молочнокислих бактерій на плоди при їх зберіганні зменшувався на 20-50 %. Але у даному способі не застосовували вплив лактобацил на інші фітопатогенні бактерії, в тому числі - збудники бактеріального раку. Відомий спосіб застосування лактобацил у комерційних препаратах '"Біофіт-1", описаний в http://www.mtpkpanda.com/ru/preparaty/1.html, та "Активатор ґрунтової мікрофлори", описаний в Чекасина Е.В., Кандыба Е.В., Булгакова Г.М., Литвинова М.Н., Царева З.И., Долгова Р.А. Активатор почвенной микрофлоры. Патент Российской Федерации RU2108999. Опубл. 30.12.1992. Препарат "Біофіт-1" містить консорціум молочнокислих, азотфіксуючих, фотосинтезуючих, амоніфікуючих мікроорганізмів, сахароміцетів, антагоністів патогенних грибів і бактерій родів Lactobacillus, Trichoderma, Azotobacter, Azospirillium, Bradirhizobium, Rhodopseudomonas, Pseudomonas, Bacillus, Saccharomyces і Agrobacter, а препарат "Активатор ґрунтової мікрофлори" - консорціум молочнокислих термофільних бактерій Streptococcus thermophilus, Streptococcus bovis, Lactobacillus salivarius var salicinicus, Lactobacillus salivarius var salivarius, Lactobacillus acidophilus, вирощений на 10 % знежиреному молоці до рН 3,8-4,0 у 1 UA 75360 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кількості 20-25 %, у суміші з водою, аскорбіновою кислотою, натрію бензоатом, пропіонатом кальцію, сухими водоростями, сечовиною та комплексонатів металів магнію, марганцю, молібдену, кобальту, цинку та заліза у вигляді калієвих або натрієвих солей. Препарати застосовують для передпосівної обробки ґрунту або як підкормки рослин у начальний період вегетації, для обробки цеоліту у теплицях з метою підвищення врожаю і стійкості рослин до захворювань. Недоліками двох даних способів є те, що дія складових препарату щодо збудників бактеріального раку дводольних рослин не відома. Крім того, спосіб застосування бактерій роду Lactobacillus у складі препаратів "Біофіт-1" та "Активатор ґрунтової мікрофлори" передбачає обробку рослин консорціумом бактерій, а проводити компанування окремих складових консорціуму складно, оскільки представники різних бактеріальних видів мають різні ростові характеристики та потреби у поживних речовинах, а також терміни виживання на рослинних поверхнях. Найбільш близьким до запропонованого способу є спосіб, описаний в Visser R., Holzapfel W.H., Bezuidenhout J.J., Kotze J.M. Antagonism of lactic acid bacteria against phytopathogenic bacteria // Appl. Env. Microbiol.-1986. - Vol. 52. - P. 552 555 (прототип). Спосіб полягає в тому, що бактерії Lactobacillus plantarum вирощують у рідкому середовищі MRS протягом 48 годин, а потім готують суспензії культур, що виросли, у стерильній дистильованій воді з 0,1 % Твін-80. Рослини оприскують даною суспензією лактобацил, і у результаті захворюваність рослин та прояв симптомів плямистості, спричиненої Pseudomonas syringae, зменшуються на 20-40 %. Недоліками відомого способу є те, що антагоністичний ефект Lactobacillus plantarum щодо збудників бактеріального раку дводольних - Agrobacterium tumefaciens і Agrobacterium vitis не передбачається, а також з необхідним приготування суспензії клітин лактобацил у стерильній дистильованій воді, що ускладнює процес підготовки бактерій до обробки ними рослин. Крім того, для обробки рослин у прототипі використовують лише штами лактобацил, виділені з поверхонь рослин, а виділити молочнокислі бактерії саме з цих екологічних ніш постає складним завданням через часте перебування лактобацил у філосфері в некультивованому стані. Дотепер лактобацили ще не застосовувалися для захисту рослин від бактеріального раку. Розробка нового ефективного способу для захисту рослин від бактеріального раку за допомогою лактобацил проводилась кафедрою мікробіології, вірусології та біотехнології Одеського національного університету імені І.І. Мечникова за держзамовленням Міністерства освіти і науки, молоді і спорту України (№ НУ/3-2011). В основу корисної моделі поставлена задача створити ефективний способ захисту рослин від збудників бактеріального раку винограду з використанням лактобацил Lactobacillus plantarum, виділених з різноманітних джерел. Поставлена задача вирішується тим, що для обробки рослин від захворювання використовують молочнокислі бактерії Lactobacillus plantarum, які культивують протягом 48 годин у середовищі MRS, і відрізняється тим, що бактерії Lactobacillus plantarum виділяють як з різних поверхонь, так й з молочнокислих продуктів і неферментованих грибів, а суспензії культур залишають у рідкому середовищі MRS, в якому бактерії було вирощено і обробляють ними дводольні рослини для захисту від бактеріального раку, спричиненого Agrobacterium vitis і Agrobacterium tumefaciens. Те, що бактерії залишають у середовищі культивування, дозволяє розширити спектр антагоністичних речовин, які наносяться на поверхню рослин разом з клітинами лактобацил, оскільки у культуральній рідині накопичуються корисні для захисту рослин метаболіти, а відмивання у стерильній дистильованій воді зменшує концентрацію антагоністичних речовин у бактеріальній суспензії. Крім того, зменшуються витрати часу, пов'язані з центрифугуванням, і зникає необхідність допоміжного обладнання. Загальними ознаками прототипу і запропонованого способу є те, що для обробки рослин використовують молочнокислі бактерії Lactobacillus plantarum, які культивують протягом 48 годин у середовищі MRS. Запропонований спосіб відрізняється від прототипу тим, що бактерії Lactobacillus plantarum для обробки рослин виділяють не тільки з рослинних поверхонь, а й з молочнокислих продуктів і неферментованих грибів, і суспензії культур, що виросли, не готують у стерильній дистильованій воді з 0,1 % Твін-80, а залишають у рідкому середовищі MRS, в якому бактерії було вирощено, і лактобацилами обробляють рослини для захисту від бактеріального раку дводольних, спричиненого Agrobacterium tumefaciens і Agrobacterium vitis. Отже, спосіб, що пропонується, відрізняється тим, що застосування лактобацил спрямоване саме на збудників бактеріального раку фітопатогенних Agrobacterium tumefaciens і 2 UA 75360 U 5 10 15 Agrobacterium vitis, і для успішного пригнічення розвитку хвороби достатньо застосування представників лише одного виду - Lactobacillus plantarum. Запропонований спосіб застосовували наступним чином: лактобацили Lactobacillus plantarum, виділені з поверхонь рослин, грибів та кисломолочних продуктів, вирощували 48 годин при температурі 37 °C у 10 12 рідкому середовищі MRS до досягнення концентрації клітин 10 -10 КУО/мл. Отриману суспензію бактерій наносили на поверхні рослин різними способами: розпилювали на листя і залишали до висихання, витримували чубуки у суспензії або базальними кінцями, або повністю протягом 30 хв.-1 години, а потім висаджували оброблені чубуки у ґрунт. Ефективність запропонованого способу підтверджується прикладами. Приклад № 1. На поверхні стебел молодих тест-рослин Kalanchoe daigremontiana наносили надрізи довжиною 1 см для створення ранових поверхонь для сприяння штучного інфікування збудниками бактеріального раку. На рану наносили 100 мкл 48-годинної культури L. plantarum 10 Ро-2 у концентрації 2,0  10 КУО/мл у середовищі культивування, первинно виділену з поверхні неферментованих грибів. Через 15 хвилин після нанесення лактобацил на раневу 8 поверхню розпилювали суспензію клітин патогена А. tumefaciens C58 у концентрації 8,0  10 КУО/мл. У контролях на ранову поверхню наносили культури патогена, лактобацил та стерильну воду. Через 60 днів оцінювали рівень розвитку бактеріального раку, для чого зважували пухлинну тканину дослідних рослин і порівнювали з такою у контролі. Результати досліджень наведені у таблиці 1. 20 Таблиця 1 Вплив культуральної рідини лактобацил L. plantarum Ро-2 на утворення пухлин за штучного інфікування бактеріальним раком Варіант обробки Позитивний контроль - нанесення клітин A. tumefaciens С58 Дослід - нанесення клітин лактобацил перед інфікуванням клітинами A. tumefaciens C58 Негативний контроль - нанесення клітин L. plantarum Ро-2 Негативний контроль - нанесення стерильної дистильованої води 25 30 35 Вага пухлинної тканини, г Відсоток ваги пухлинної тканини від контрольної, % 0,083±0,013 100 % 0,036±0,009 43,4 % 0 0% 0 0% Отже, як видно з таблиці, зменшення ваги пухлинних тканин, тобто пригнічення рівня проявів симптомів складало 56,6 %, що для бактеріального раку є дуже високим показником, оскільки це захворювання є таким, що важко піддається лікуванню та профілактиці. Використання запропонованого способу дозволило зменшити прояв захворювання у 2,3 рази. Приклад № 2. Чубуки винограду у кількості по сто штук для кожного з варіантів відбирали для дослідження ранньою весною та обробляли наступним чином. Дослідну частину чубуків зі свіжими рановими поверхнями витримували базальними кінцями одну годину у суміші 50:50 суспензій клітин L. plantarum OL-87 і A. tumefaciens C58. Застосовували 48-годинну суспензію 12 штаму лактобацил L. plantarum OL-87 у концентрації 1,5  10 КУО/мл у середовищі культивування, первинно виділену з молочнокислих продуктів. Також протягом однієї години частину чубуків витримували у суспензії штаму фітопатогена А. tumefaciens C58, і такі чубуки складали позитивний контроль. Негативним контролем слугувала вода, в якій витримували частину чубуків також протягом однієї години. Чубуки висаджували у ґрунт та укорінювали в умовах теплиці (25 °C, вологість 85 %). Через 30 днів оцінювали стан піддослідних рослин (табл. 2). 3 UA 75360 U Таблиця 2 Вплив культуральної рідини лактобацил L. plantarum OL-87 на стан рослин винограду за штучного інфікування Rhizobium radiobacter C58 Дослід Обробка патогеном A. tumefaciens C58 Обробка сумішшю L. plantarum OL-87: A. tumefaciens C58 Вода рН 6,0 5 10 15 20 Кількість життєздатних пагонів, % Кількість бруньок, що розпустилися, % Кількість пагонів на чубук, шт. Приріст пагонів на чубук, см 76,2 % 42,35 % 0,65 44,7 95 % 76,3 % 1,65 61,1 100 % 54,35 % 2,04 55,5 Як видно зданих експерименту, наведених у таблиці 2, обробка клітинами патогена призвела до значного зменшення кількості життєздатних пагонів, бруньок, що розпустилися, та таких показників, як кількість пагонів на чубук і приріст пагонів на чубук. Обробка лактобацилами одночасно з обробкою суспензією фітопатогена дозволила підвищити такий показник, як кількість життєздатних пагонів, а за рештою показників рослини, оброблені фітопатогенами, були кращими, ніж необроблені у негативному контролі, витримані лише у воді. Приклад № 3. Чубуки винограду по сто у кожному варіанті обробляли наступним чином. У негативному контролі увесь чубук занурювали на 1 годину у воду з водогону, рН 6. Одну з частин дослідних чубуків обробляли патогенним штамом Rhizobium vitis U6. 8 Концентрація клітин у суспензії, що застосовувалася для цього досліду, становила 5,0  10 КУО/мл. Чубуки повністю занурювали у суспензію патогена і залишали на 30 хв. Штам збудника бактеріального раку R. vitis U6 було виділено з ґрунту виноградників Одеської області, тобто він є типовим для півдня України. Обробку лактобацилами для попередження інфікування збудниками бактеріального раку проводили наступним чином. Застосовували штам L. plantarum S12. Концентрація клітин 10 лактобацил добової культури для обробки становила 1,2  10 КУО/мл. Даний штам L. plantarum був виділений з поверхонь ягід винограду, що культивується у цьому ж регіоні. Частину чубуків спочатку інфікували R. vitis U6 протягом 30 хв., а потім одну годину витримували у суспензії L. plantarum S12. Чубуки висаджували у ґрунт та протягом місяця утримували у теплиці (25° С, вологість 85 %), а потім оцінювали стан піддослідних рослин (табл. 3). 25 Таблиця 3 Вплив культуральної рідини лактобацил L. plantarum S12 на стан рослин винограду за штучного інфікування Rhizobium vitis Дослід R. vitis U6 30 хв. 30 хв. R. vitis U6, а потім 1 година L. plantarum S12 Вода рН 6,0 30 Кількість життєздатних пагонів, % 88 % Кількість бруньок, що розпустилися, % 65 % Кількість пагонів на чубук, шт. 0,50 Приріст пагонів на чубук, cм 4,01 100 % 65 % 0,73 5,99 100 % 48 % 0,70 2,50 Отримані результати вказують на те, що обробка лактобацилами позитивно відобразилася на стані піддослідних рослин, зменшивши прояви інфекції збудниками бактеріального раку. Обробка молочнокислими бактеріями після зараження призвела до збільшення показників стану рослин у порівнянні з такими ж при обробці лише суспензією патогена. Збільшилася кількість життєздатних пагонів і кількість пагонів, а також приріст пагонів на чубук навіть у порівнянні з негативним контролем - обробкою водою. 4 UA 75360 U Таким чином встановлено, що запропонований спосіб є менш витратним у часі, ніж прототип, дозволяє застосовувати для обробки рослин ширший спектр штамів та має виражений ефект пригнічення розвитку бактеріального раку дводольних. 5 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб захисту рослин від бактеріального раку з використанням лактобацил, який полягає в тому, що для обробки рослин від захворювань використовують молочнокислі бактерії Lactobacillus plantarum, які культивують протягом 48 годин у середовищі MRS, який відрізняється тим, що бактерії Lactobacillus plantarum виділяють як з рослинних поверхонь, так й з кисломолочних продуктів і неферментованих грибів, а суспензії культур залишають у рідкому середовищі MRS, в якому бактерії було вирощено, і обробляють ними дводольні рослини для захисту від бактеріального раку, спричиненого Agrobacterium tumefaciens і Agrobacterium vitis. 15 Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5