Похідні бензотіазину і бензотіадіазину, спосіб їх одержання і фармацевтична композиція, яка їх містить

Даний винахід відноситься до нових похідних бензотіазину і бензотіадіазину, до способу їх приготування і фармацевтичних композицій, які їх містять. На сьогоднішній день відомо, що збуджувальні амінокислоти, особливо глутамат, відіграють ключову роль у фізіологічних процесах нейрональної пластичності і у механізмах, що лежать в основі навчання та запам'ятовування. Патофізіологічні дослідження чітко показали, що дефіцит у глутаматергічній нейротрансмісії тісно пов'язаний з розвитком хвороби Альцгеймера [Neuroscience і Biobehavioral reviews, 1992, 16, 13-24; Progress in Neurobiology, 1992, 39, 517-545]. Більше того, численні роботи за останні роки продемонстрували існування підтипів збуджувальних рецепторів амінокислот і їх функціональні взаємодії [Molecular Neuropharmacology, 1992,2, 15-31]. Серед таких рецепторів, АМРА (a-аміно-3-гідрокси-5-метил-4-ізоксазол-пропіонова кислота) рецептор виявляється таким рецептором, який найбільше залучений в явище фізіологічної нейрональної збудженості і, особливо, в явища, які залучені до процесів запам'ятовування. Наприклад, було виявлено, що процес навчання пов'язаний зі зростанням у зв'язуванні АМРА зі своїм рецептором у гіпокампі, одній з ділянок мозку, головних для процесів запам'ятовування і пізнавання. Подібним чином, ноотропні агенти, такі як анірацетам, нещодавно були описані як позитивно модулюючі АМРА рецептори нейрональних клітин [Journal Neurochemistry, 1992, 58, 1199-1204]. В літературі, сполуки, як мають структуру бензаміду, були описані як такі, що володіють тим же механізмом дії і покращують процес запам'ятовування [Synapse, 1993, 15, 326-329]. Сполука ВА 74, зокрема, являє собою найбільш активний з нових фармакологічних агентів. Нарешті, [опис патенту ЕР 692 484] розкриває похідне бензотіадіазину, яке володіє безпосередньою активністю відносно струму АМРА, і [патентна заявка WO 99/42456] описує серед інших конкретні похідні бензотіадіазину як модулятори АМРА рецепторів. Похідні бензотіазину і бензотіадіазину, до яких відноситься даний винахід, крім того, що вони є новими, несподівано виявляють фармакологічну активність відносно струму AMPА, що явно є більш переважним відносно активності сполук, які мають подібні структури, описані у попередньому рівні техніки. Вони є корисними як АМРА модулятори для лікування або запобігання розладам пам'яті і пізнавання, які пов'язані з віком, синдромами тривоги або депресії, прогресуючими нейродегенеративними захворюваннями, хворобою Альцгеймера, хворобою Піка, хореєю Хантінгтона, шизофренією, наслідками гострих нейродегенеративних захворювань, наслідками ішемії і наслідками епілепсії. Більш конкретно, даний винахід відноситься до сполук формули (І): (І) де: R1 являє собою арил або гетероарильну гр упу, R2 являє собою атом водню, атом галогену або гідроксигрупу, X являє собою атом кисню або атом сірки, Υ являє собою атом кисню, атом сірки або NR групу, де R являє собою атом водню або лінійну або розгалужену (С1-С6)алкільну гр упу, А являє собою CR4R5 гр уп у або NR4 гр упу, R3 являє собою атом водню, лінійну або розгалужену (С1-С6)алкільну групу або (С3-С7)циклоалкільну груп у, R4 являє собою атом водню або лінійну або розгалужену (С1-С6)алкільну гр упу, або А являє собою атом азоту і, разом з розташованою поряд -CHR3-групою, утворює кільце , де m являє собою 1, 2 або 3, R5 являє собою атом водню або галогену, до їх ізомерів і їх адитивни х солей з фармацевтично прийнятною кислотою або основою, повинно розумітись, що: - термін "арильна група", як повинно розумітись, означає ароматичну моноциклічну груп у або біциклічну груп у, в якій щонайменше одне з кілець є ароматичним, необов'язково заміщену однією або більше однаковими або різними групами, вибраними з галогену, лінійного або розгалуженого (С1-С6)алкілу, лінійного або розгалуженого (С1-С6)алкокси, лінійного або розгалуженого (С1-С6)пергалоалкілу, лінійного або розгалуженого (С1-С6)пергалоалкокси, гідрокси, ціано, нітро, аміно (необов'язково заміщеного однією або більше лінійними або розгалуженими (С1-С6)алкільними групами), аміносульфонілу (необов'язково заміщеного однією або більше лінійними або розгалуженими (С1-С6)алкільними групами), (С1-С6)алкілсульфоніламіно або фенілу (необов'язково заміщеного однією або більше однаковими або різними групами, вибраними з галогену, лінійного або розгалуженого (С1-С6)алкілу, лінійного або розгалуженого (С1-С6)пергалоалкілу, гідрокси або лінійного або розгалуженого (С1-С6)алкокси), - термін "гетероарильна група" означає ароматичну моноциклічну або біциклічну груп у, в якій щонайменше одне з кілець є ароматичним, що містить один, два або три однакових або різних гетероатоми, вибрані з азоту, кисню і сірки, необов'язково заміщену однією або більше однаковими або різними групами, вибраними з галогену, лінійного або розгалуженого (С1-С6)алкілу, лінійного або розгалуженого (С1-С6)алкокси, лінійного або розгалуженого (С1-С6)пергалоалкілу, лінійного або розгалуженого (С1-С6)пергалоалкокси, гідрокси, ціано, нітро, аміно (необов'язково заміщеного однією або більше лінійними або розгалуженими (С1-С6)алкільними групами), аміносульфонілу (необов'язково заміщеного однією або більше лінійними або розгалуженими (С1С6)алкільними групами) або (С1-С6)алкілсульфоніламіно. Серед фармацевтично прийнятних кислот можуть бути згадані, без будь-якого обмеження, хлористоводнева кислота, бромистоводнева кислота, сірчана кислота, фосфорна кислота, оцтова кислота, трифтороцтова кислота, молочна кислота, піровиноградна кислота, малонова кислота, янтарна кислота, глутарова кислота, фумарова кислота, винна кислота, малеїнова кислота, лимонна кислота, аскорбінова кислота, метансульфонова кислота, камфорна кислота і т.д. Серед фармацевтично прийнятних основ можуть бути згадані, без будь-якого обмеження, гідроксид натрію, гідроксид калію, триетиламін, трет-бутиламін і т.д. Переважна арильна група являє собою фенільну груп у. Переважна R2 група являє собою атом водню. А переважно являє собою NR4 групу або являє собою атом азоту і, разом з розташованою поряд -СNR3групою, утворює кільце , де m переважно являє собою 1. Υ переважно являє собою атом кисню або атом сірки. Винахід також відноситься до способу приготування сполук формули (І). Спосіб приготування сполук формули (І), де А являє собою NR4 групу або А являє собою атом азоту і, разом з розташованою поряд CHR3 групою, утворює кільце , де m являє собою 1, 2 або 3, який відрізняється тим, що як вихідний матеріал використовують сполуку формули (II): (IІ) де: R'1 являє собою лінійну або розгалужену (С1-С6)алкоксигрупу, R'2 являє собою атом водню, атом галогену або лінійну або розгалужену (С1-С6)алкоксигрупу, яку: (а) або піддають реакції з кислотним хлоридом формули (III) у присутності основи, у середовищі тетрагідрофурану або ацетонітрилу: (IIІ) де m є таким, як визначено для формули (І), для одержання сполуки формули (IV): (IV) де R'1, R' 2 і m є такими, як визначено вище, яку потім циклізують в основному середовищі для одержання сполуки формули (V): (V) де R'1, R' 2 і m є такими, як визначено вище, яку піддають відновленню, у середовищі спирту або диметилформаміду, у присутності боргідриду натрію, для одержання сполуки формули (VI): (VI) де R'1, R' 2 і m є такими, як визначено вище, яку піддають дії триброміду бору для одержання сполуки формули (VII): (VII) де m є таким, як визначено вище, (b) або циклізують: - у присутності амідину формули (VIII): (Vlll) де R3 є таким, як визначено для формули (І), для одержання сполуки формули (ІХ): (ІХ) де R'1, R' 2 i R3 є такими, як визначено вище, яку: - або відновлюють, використовуючи металевий гідрид, для одержання сполуки формули (X): (Х) де R'1, R' 2 і R3 є такими, як визначено вище, - або алкілують шляхом дії сильної основи у присутності алкілуючого агенту R'4 X, де R'4 являє собою лінійну або розгалужену (С1-С6)алкільну групу і X являє собою атом галогену, і потім відновлюють для одержання сполуки формули (XI): (ХІ) де R'1,R'2 , R3 і R' 4 є такими, як визначено вище, або - у присутності альдегіду формули (XII): (ХІІ) де R3 є таким, як визначено для формули (І), для одержання сполуки формули (X), описаної вище, груп у R'1 і гр упу R' 2, коли вона являє собою лінійну або розгалужену (С1-С6)алкоксигрупу, сполук у яких формул (X) або (XI) перетворюють у гідроксигрупи для одержання сполуки формули (XIII): (ХІІІ) де R2, R3 і R4 є такими, як визначено для формули (І), де сполуку формули (VII) або (XIII) піддають реакції - зі сполукою формули (Xl Va) (ХІVa) де R1, X є такими, як визначено для формули (І), і Y' являє собою атом кисню, атом сірки або NR' групу, де R' являє собою лінійну або розгалужену (С1-С6)алкільну гр упу, - або зі сполукою формули (Xl Vb) (ХІVb) де R1 і X є такими, як визначено для формули (І), для одержання сполуки формули (І/a1) або (І/а2), конкретних варіантів сполук формули (І): (l/a1) де X, Y, R 1 , R2 , R3 і R 4 є такими, як визначено для формули (І), (l/a2) де X, Y, R 1 , R2 і m є такими, як визначено для формули (І), де сполуки формул (І/а1) і (І/а2): якщо необхідно, очищують відповідно до звичайної техніки очищення, необов'язково розділяють, на їх ізомери відповідно до звичайної техніки розділення і перетворюють, якщо бажано, у їх адитивні солі з фармацевтично прийнятною кислотою або основою. Спосіб приготування сполук формули (І), де А являє собою CR4R5 груп у, який відрізняється тим, що як вихідний матеріал використовують сполуку формули (XV): (ХV) де: R'1 являє собою лінійну або розгалужену (С1-С6)алкоксигрупу, R'2 являє собою атом водню, атом галогену або лінійну або розгалужену (C1-С6)алкоксигрупу, яку піддають дії хлорацетону у присутності мінеральної основи у середовищі диметилформаміді для одержання сполуки формули (XVI): (ХVI) де R'1 і R'2 є такими, як визначено вище, яку піддають перегрупуванню в основному середовищі для одержання сполуки формули (XVII): (ХVII) де R'1 і R'2 є такими, як визначено вище, яку деацетилюють шляхом нагрівання у зворотному холодильнику у середовищі бензолу у присутності надлишку етиленгліколю і каталітичної кількості р-толуолсульфонової кислоти для одержання сполуки формули (XVIII): (ХVIII) де R'1 і R'2 є такими, як визначено вище, яку піддають гідролізу у середовищі кислоти для одержання сполуки формули (ХІХа): (ХIXa) де R'1і R'2 є такими, як визначено вище, атом азоту якої необов'язково, коли R3 є іншим, ніж атом водню, захищають захисною групою і яку потім, після обробки сильною основою, обробляють сполукою формули R'3-P, де R'3 являє собою лінійну або розгалужену (С1-С6)алкільну групу або (С3-С7)циклоалкільну групу і Ρ являє собою відхідну груп у, для одержання, після зняття захисту атома азоту, сполуки формули (ХІХ'а) (ХІХ'а) де R'1, R' 2 і R'3 є такими, як визначено вище, де сполуку формули (ХІХа) або (ХІХ'а), представлену формулою (XIX): (ХІХ) де R'1 і R'2 є мають такі ж значення, і R 3 є таким, як визначено для формули (І): - або піддають каталітичному відновленню для одержання сполуки формули (XX): (ХХ) де R'1 і R'2 є такими, як визначено вище, або перетворюють у спирт дією гідриду, гідроксигрупу якого перетворюють в атом галогену дією відповідного реагенту для одержання сполуки формули (XXI): (ХХІ) де R'1 i R'2 є такими, як визначено вище, і R'5 являє собою атом галогену, - або піддають дії магнійорганічної сполуки R'4MgBr, де R'4 являє собою лінійну або розгалужену (С1C6)алкільну груп у, для одержання сполуки формули (ХІХb): (ХІХb) де R'1, R' 2 і R'4 є такими, як визначено вище, де сполуку формули (ХІХb) - або піддають каталітичному відновленню для одержання сполуки формули (XXII): (ХХІI) де R'1, R' 2 і R'4 є такими, як визначено вище, - або її гідроксигрупу перетворюють в атом галогену дією відповідного реагенту для одержання сполуки формули (XXIII): (ХХІІІ) де R'1, R' 2 і R' 4 Є такими, як визначено вище, і R'5 являє собою атом галогену, груп у R'i і груп у R' 2 , коли вона являє собою лінійну або розгалужену (С1-С6)алкоксигрупу, сполуки формул (XX)-(XXIII) яких перетворюють у гідроксигрупи для одержання сполуки формули (XXIV): (ХХІV) де R2, R4 і R5 є такими, як визначено для формули (І), де сполуку формули (XXIV) піддають реакції - зі сполукою формули (Xl Va) (ХІVa) де R1, X є такими, як визначено для формули (І), і Y1 являє собою атом кисню, атом сірки або NR' групу, де R являє собою лінійну або розгалужену (С1-С6)алкільну гр упу, - або зі сполукою формули (Xl Vb) (ХІVb) де R1 і X є такими, як визначено для формули (І), для одержання сполуки формули (І/b), конкретного варіанту сполуки формули (І): 1 (І/b) де X, Y, R1, R2, R3, R4, R5 є такими, як визначено для формули (І), яку очи щують, якщо необхідно, відповідно до звичайної техніки очищення, необов'язково розділяють на її ізомери відповідно до звичайної техніки розділення і перетворюють, якщо бажано, у її адитивні солі з фармацевтично прийнятною кислотою або основою. Винахід також відноситься до фармацевтичних композицій, які містять, як активний інгредієнт, сполуку формули (І) з одним або більше відповідними інертними, нетоксичними ексципієнтами. Серед фармацевтичних композицій відповідно до даного винаходу можуть бути згадані більш конкретно ті, які прийнятні для орального, парентерального (внутрішньовенного або підшкірного) або назального введення, таблетки або драже, під'язикові таблетки, желатинові капсули, коржики, супозиторії, креми, мазі, дермальні гелі, ін'єктовані препарати, питні суспензії і т.д. Прийнятне дозування може розрізнятись в залежності від природи і складності захворювання, шляху введення, віку і ваги пацієнта. Дозування знаходиться в діапазоні від 1 до 500 мг на день за одне або більше введень. Наступні приклади демонструють даний винахід і жодним чином не обмежують його об'єму. Як вихідні матеріали використовують продукти, які відомі або виготовляються відповідно до відомих способів приготування. Структури сполук, описані у Прикладах, були визначені відповідно до звичайної спектрофотометричної техніки (інфрачервоне випромінювання, ЯМР, мас-спектрометрія ...). Приклад 1: 5,5-Діоксидо-2,3,3а,4-тетрагідро-1Н-піроло[2,1-с][1,2,4]-бензотіадіазин-7-іл феніл карбонат Стадія А: N-[2-(Аміносульфоніл)-4-метоксифеніл-4-хлорбутанамід 144ммол триетиламіну і потім, краплями, розчин, який містить 135ммол 4-хлорбутанового кислотного хлориду в 30мл тетрагідрофурану (ТГФ), додають до розчину, який містить 96,4ммол 2-аміно-5метоксибензолсульфонаміду в 200мл ТГФ. Після перемішування протягом ночі при температурі навколишнього середовища ТГФ випаровують і залишок додають у воду. Після екстрагування етилацетатом, органічну фазу промивають і висушують. Після випаровування очікуваний продукт одержують у формі олії. Стадія В: 5,5-Діоксо-7-метокси-2,3-дигідро-1Н-піроло[2,1-с][1,2,41-бензотіадіазин Продукт, одержаний на попередній Стадії, перемішують протягом ночі при температурі навколишнього середовища в 320мл водного 1N розчину гідроксиду натрію. Після додавання 50мл етилацетату і енергійного перемішування очікуваний продукт, який випав в осад, відфільтровують, промивають і висушують. Стадія С: 5,5-Діоксидо-7-метокси-2,3,За,4-тетрагідро-1Н-піроло[2,1-с][1,2,41бензотіадіазин 106,5ммол боргідриду натрію додають до суспензії, яка містить 35,5ммол продукту, одержаного на попередній Стадії, в 40мл диметилформаміду (ДМФ). Після перемішування протягом ночі при температурі навколишнього середовища реакційну суміш о холоджують і потім 150мл замороженого розчину 1N хлористоводневої кислоти додають до вищезазначеної суміші. Очікуваний продукт випадає в осад і його відфільтровують. Точка плавлення: 193-198°С Стадія D: 5,5-Діоксидо-2,3,3а,4-тетрагідро-1Н-піроло[2,1-с][1,2,4]-бензотіадіазин-7-ол 79,3ммол триброміду бору додають краплями до суспензії, яка містить 26,7ммол продукту, одержаного на попередній Стадії, у 350мл дихлорметану, який підтримують при -60°С під азотом. Температуру підтримують протягом однієї години і потім все повертають до температури навколишнього середовища і перемішують протягом ночі. Після охолодження реакційної суміші на льодяній бані додають 100 мл води і сформовану двофазну систему енергійно перемішують. Суспензію, сформовану таким чином, фільтрують. Одержану білу тверду речовину промивають водою, ефіром, і висушують, одержуючи очікуваний продукт. Точка плавлення: 237-242°С Стадія Е: 5,5-Діоксидо-2,3,3а,4-тетрагідро-1Н-піроло[2,1-с][1,2,4]-бензотіадіазин-7-іл феніл карбонат 0,175мл триетиламіну, 5мг 4-диметиламінопіридину і, краплями, 0,136мл феніл хлорформіату, розчиненого у 2мл дихлорметану (СН2Сl2), додають до суспензії, яка містить 0.83 ммол сполуки, описаної на попередній Стадії, у 30мл СН 2Сl2. Після перемішування протягом однієї ночі при температурі навколишнього середовища, розчин промивають 1N хлористоводневою кислотою і потім насиченим розчином хлориду натрію, висушують і випаровують. Після додавання залишку в ефір очікуваний продукт одержують фільтруванням. Точка плавлення: 197-198°С Елементний мікроаналіз: % теоретично % емпірично C 56,66 56,44 H 4,47 4,55 N 7,77 7,61 S 8,90 9,02 Наступні Приклади були одержані відповідно до методики, описаної у Прикладі 1, використовуючи відповідні вихідні матеріали. Приклад 2: О-(5,5-Діоксидо-2,3,3а,4-тетрагідро-1Н-піроло[2,1-с][1,2,4]-бензотіадіазин-7-іл) О-феніл тіокарбонат Очікуваний продукт одержують за допомогою заміщення феніл хлорформіату на Стадії Ε феніл тіонхлорформіатом. Точка плавлення: 252-254°С Елементний мікроаналіз: % теоретично % емпірично C 54,24 53,55 H 4,28 5,02 N 7,44 7,39 S 17,03 17,47 Приклад 3: О-(5,5-Діоксидо-2,3,3а,4-тетрагідро-1Н-піроло[2,1-с][1,2,4]бензотіадіазин-7-іл) S-феніл дитіокарбонат Очікуваний продукт одержують за допомогою заміщення феніл хлорформіату на Стадії Ε феніл дитіохлорформіатом. Точка плавлення: 210-214°С Елементний мікроаналіз: % теоретично % емпірично C 52,02 51,85 H 4,11 4,10 N 7,14 7,36 S 24,51 24,69 Приклад 4: О-(5,5-Діоксидо-2,3,3а,4-тетрагідро-1Н-піроло[2,1-с][1,2,4]бензотіадіазин-7-іл О-(4-хлорфеніл) тіокарбонат Очікуваний продукт одержують за допомогою заміщення феніл хлорформіату на Стадії Ε 4-хлорфеніл тіонхлорформіатом. Точка плавлення: 189-194°С Елементний мікроаналіз: C H % теоретично 49,69 3,68 % емпірично 49,39 3,64 N S 6,82 15,61 7,02 16,20 Cl 8,63 9,70 Приклад 5: О-(4-Етил-1,1-діоксидо-3,4-дигідро-2Н-1,2,4-бензотіадіазин-7-іл О-феніл тіокарбонат Стадія А: 7-Метокси-4Н-1,2,4-бензотіадіазин 1,1-діоксид Суспензію 3,0г 2-аміно-5-метоксибензол-сульфонаміду перемішують протягом однієї ночі при 80°С у присутності 1,31г формамідин гідрохлориду і 2,27мл триетиламіну в 50мл толуолу. Толуол випаровують у вакуумі. Залишок додають у воду і осад відфільтровують. Стадія В: 7-Метокси-4-метил-4Н-1,2,4-бензотіадіазин 1,1-діоксид 2,88г продукту, одержаного на попередній Стадії, додають порціями до суспензії 9мл ДМФ, яка містить 570мг 60% NaH в мінеральному маслі. Суміш перемішують протягом 30хв., поки не одержують чорний розчин. 929μл йодоетану потім додають краплями. Перемішування продовжують протягом 1 год. і реакційну суміш осаджують за допомогою додавання води. Осад відфільтровують і промивають водою і потім ефіром, щоб одержати очікуваний продукт. Стадія С: 7-Метокси-4-метил-3,4-дигідро-2Н-1,2,4-бензотіадіазин 1,1-діоксид 1,19г боргідриду натрію додають до суспензії 2,37г продукту попередній Стадії у 40мл етанолу. Суміш поступово стає однорідною. Після реакції протягом 1год. при температурі навколишнього середовища суміш охолоджують на льодяній бані і нейтралізують додаванням 1N HCl. Білий осад перемішують протягом 15хв. і вказаний у заголовку продукт відфільтровують. Стадія D: 4-Етил-3,4-дигідро-2Н-1,2,4-бензотіадіазин-7-ол 1,1-діоксид 79,3ммол триброміду бору додають краплями до суспензії, яка містить 2г продукту, одержаного на попередній Стадії, у 200мл дихлорметану, який підтримують при -60°С під азотом. Температуру підтримують протягом однієї години і потім все повертають до температури навколишнього середовища і перемішують протягом ночі. Після охолодження реакційної суміші на льодяній бані додають 100мл води і двофазну систему енергійно перемішують. Суспензію, сформовану таким чином, фільтрують. Одержану тверду речовину промивають водою, ефіром, і висушують, одержуючи очікуваний продукт. Точка плавлення: 214-218°С Стадія Е: O-(4-Етил-1,1-діоксидо-3,4-дигідро-2Н-1,2,4-бензотіадіазин-7-іл) О-феніл тіокарбонат Очікуваний продукт одержують відповідно до методики, описаної на Стадії Ε Прикладу 1, заміщуючи феніл хлорформіат феніл тіонхлорформіатом. Точка плавлення: 173-175°С Елементний мікроаналіз: % теоретично % емпірично C 52,73 52,81 H 4,43 4,68 N 7,69 7,66 S 17,60 17,75 Приклад 6; О-(4-Етил-1,1-діоксидо-3,4-дигідро-2Н-1,2,4-бензотіадіазин-7-іл) S-феніл дитіокарбонат Очікуваний продукт одержують відповідно до методики, описаної для Прикладу 5, заміщуючи феніл тіонхлорформіат на Стадії Ε феніл дитіохлорформіатом. Точка плавлення: 228-232°С Елементний мікроаналіз: % теоретично % емпірично C 50,50 50,07 H 4,24 4,09 N 7,36 7,57 S 25,28 25,31 Приклад 7: О-(4-Етил-1,1-діоксидо-3,4-дигідро-2Н-1,2,4-бензотіадіазин-7-іл) О-(4-хлорфеніл) тіокарбонат Очікуваний продукт одержують відповідно до методики, описаної для Прикладу 5, заміщуючи феніл тіонхлорформіат на Стадії Ε 4-хлорфеніл тіонхлорформіатом. Точка плавлення: 155-156°С Елементний мікроаналіз: C H % теоретично 48,18 3,79 % емпірично 48,64 3,93 N S 7,02 16,08 6,91 16,08 Cl 8,89 8,98 Фармакологічні дослідження продуктів за даним винаходом Дослідження збуджувальних токів, викликаних АМРА в ооцитах Xenopus а - Спосіб: мРНК одержують з кори головного мозку чоловічих щурів Wistar способом гуанідин тіоціанат/фенол/хлороформ. Полі (А+) мРНК відділяли хроматографією на оліго-dT целюлозі та ін'єктують в кількості 50нг на ооцит. Ооцити залишають інкубуватись протягом 2-3 днів при 18°С, щоб дозволити вираження рецепторів, і потім зберігають при 8-10°С. Проводять електрофізіологічну реєстрацію у камері Plexiglass ® при 20-24°С у середовищі OR2 [J. Exp. Zool., 1973, 184, 321-334] способом "напруга-фіксація" з використанням двох електродів, з третім електродом, розміщеним у ванні, яка служить як зразок. Всі сполуки вводять через середовище інкубації і електричний струм вимірюють в кінці періоду введення. АМРА використовують у концентрації 10μΜ. Для кожної досліджуваної сполуки визначають концентрацію, яка подвоює (ЕС2Х) або збільшує у п'ять разів (ЕС5Х) силу струм у, викликаного самим АМРА (від 5 до 50нА). b - Результати: Сполуки за даним винаходом підсилюють збуджувальні ефекти АМРА до дуже значних рівнів і їх активність є дуже переважною у порівнянні зі сполуками, на які є посилання. Сполука Прикладу 2, особливо, має значення ЕС2Х на рівні 1,8μΜ і значення ЕС5Х на рівні 9,6μΜ. Фармакологічна композиція Формула для приготування 1000 таблеток, кожна з яких містить 100мг сполука Прикладу 1 100г гідроксипропілцелюлоза 2г пшеничний крохмаль 10г лактоза 100г стеарат магнію 3г тальк 3г