Спосіб лабораторного культивування їстівних базидіальних грибів

Реферат: Спосіб лабораторного культивування їстівних базидіальних грибів включає етапи підготовки субстрату з натуральних компонентів, розміщення по колбах з додаванням води, набухання субстрату, стерилізацію, інокуляцію та подальшу інкубацію в термостаті. При цьому як субстрат використовують лушпиння соняшника, яке насипають в колбу Ерленмейєра. UA 84401 U (54) СПОСІБ ЛАБОРАТОРНОГО КУЛЬТИВУВАННЯ ЇСТІВНИХ БАЗИДІАЛЬНИХ ГРИБІВ UA 84401 U UA 84401 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до грибівництва і може бути використана для лабораторного культивування їстівних базидіальних грибів у мікологічних і виробничих лабораторіях навчальних закладів, науково-дослідних установ та грибівницьких підприємств. Відомі способи культивування грибів за лабораторних умов в пробірках, чашках Петрі, матрасах, кюветах чи колбах, що містять різні натуральні компоненти, а саме: насіння злакових рослин, висівки, тирсу [1, 2]. Недоліками цих середовищ є те, що чітко не визначене співвідношення натуральних компонентів і води саме для їстівних базидіальних грибів. Відомий спосіб культивування базидіальних грибів, що передбачає приготування рідкого живильного середовища, яке містить глюкозу, дріжджовий екстракт, пептон, мінеральні солі, пивне сусло та відвар дубової кори, з подальшою інокуляцією посівним матеріалом [3]. Недоліками цього способу є використання дефіцитних речовин, таких як глюкоза та пептон, які значно підвищують вартість проведення способу. Відомий спосіб одержання білковмісної біомаси гриба Pleurotus ostreatus шляхом глибинного культивування на живильному середовищі, яке містить джерело вуглецю, азоту та піногасник [4]. До недоліків цього способу можна віднести те, що, він дозволяє одержати лише біомасу гриба, що обмежує вивчення інших морфофізіологічних показників. Найбільш близьким за технічною суттю і досяжністю результату є лабораторний спосіб культивування грибів на субстраті з відходів макаронного виробництва, а саме битої вермішелі або відходів після просіювання борошна - крупки [5]. Але цей спосіб має декілька недоліків. Поперше, відходи борошна є цінним білково-вуглеводним субстратом, який можна використовувати як кормову домішку до раціону харчування тварин. По-друге, бита волога вермішель та крупка душе швидко контамінуються конкурентними до гливи звичайної мікроорганізмами, які зупиняють її ріст і забруднюють живильний субстрат. Також до недоліків способу культивування на відходах макаронного виробництва можна віднести те, що він є недостатньо прийнятим для вивчення морфофізіологічних показників. В основу корисної моделі поставлено задачу пошуку способу культивування їстівних базидіальних грибів за лабораторних умов шляхом використання дешевого натурального компонента субстату, а саме: лушпиння соняшника, який в Україні є найбільш розповсюдженим відходом сільського господарства та субстратом для інтенсивного культивування їстівних базидіальних грибів, для максимального визначення всіх їх морфофізіологічних показників [6]. Поставлена задача вирішується за рахунок того, що спосіб лабораторного культивування їстівних базидіальних грибів, що містить етапи підготовки субстрату з натуральних компонентів, розміщення по колбах з додаванням води, набухання субстрату, стерилізацію, інокуляцію та подальшу інкубацію в термостаті, згідно з корисною моделлю, на підготовчому етапі як субстрат використовують лушпиння соняшника, яке насипають в колбу Ерленмейєра в співвідношенні 1:5 до води, а подальшу стадію набухання субстрату здійснюють протягом однієї доби. Спосіб лабораторного культивування їстівних базидіальних грибів, що його пропонують, дозволяє визначити всі важливі морфофізіологічні характеристики цих грибів, а саме: швидкість обростання субстрату міцелієм, ініціацію, утворення плодових тіл, кількість примордіїв та плодових тіл, врожайність та ефективність використання вуглецевого субстрату. Перевага запропонованого способу порівняно з найближчим аналогом полягає в тому, що для культивування їстівних грибів та для визначення їх морфофізіологічних особливостей використовується дешевий та найбільш розповсюджений субстрат в Україні - лушпиння соняшнику. Таким чином, запропонований спосіб лабораторного культивування їстівних базидіальних грибів забезпечує оптимальні умови для плодоношення їстівних базидіоміцетів і дозволяє визначити важливі морфофізіологічні характеристики цих грибів та ефективність використання ними вуглецевого субстрату.Приклад конкретного виконання. Для роботи було взято ізоляти їстівного гриба Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kummer Д-29, K99, P-01, P-12, СПД, Ст-22, Ю-12, 025, BO-3, B-99, BK-2000, P-15, BT-2, C-2000, KE-2001, BC-1, які не перевірено за здатністю до плодоношення, і два штами Д-140 (для перевірки здатності до плодоношення за лабораторних умов) і НК-35 (як контроль). Культивування гриба P. ostreatus було проведено на твердому субстраті, лушпинні соняшника, в колбах Ерленмейєра ємністю 250 мл. Для цього субстрат масою 10 г насипали у колби і додавали 50 мл водопровідної води, достатньо для повного зволоження субстрату, і залишали для набухання протягом доби. Отриману суміш стерилізували в автоклаві протягом 1 години під тиском 1,4-1,8 атм за температури 125,4-130,6 °C. Після цього проводили інокуляцію культурами гриба P. ostreatus і ставили в термостат з температурою 26 °C. 1 UA 84401 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Після повного обростання субстрату міцелієм гриба P. ostreatus колби з ізолятами виставляли під освітлювальну установку. Протягом досліду фіксували термін появи примордіїв, утворення плодових тіл, кількість примордіїв та плодових тіл. Урожайність розраховували через відношення сухої маси плодових тіл до маси сухого субстрату (г/кг). Біологічну ефективність плодових тіл (БЕ, %) визначали за формулою [7]: m ÁÅ  100 , m1 де m - маса свіжих плодових тіл, г; m1 - маса сухого субстрату, г. Ефективність використання вуглецевого субстрату (Е, %) підраховували за формулою [8]: m  m2 Å 1  100 , m1 де m1 - початкова маса субстрату, г; m2 - маса залишкового субстрату, г. Коефіцієнт використання субстрату (k) визначали за формулою [8]: Y , K 100  m де Y - суха маса плодових тіл (г), зібрана за вирощування гливи на субстраті з початковою сухою масою 100 г; m - суха маса залишкового субстрату після збору урожаю. Статистичну обробку даних проводили за допомогою дисперсійного аналізу і множинного порівняння середніх за Данетом [9]. Результати досліджень лабораторного культивування штамів і ізолятів показали, що всі вони відрізнялися за показниками продуктивності і ефективності використання субстрату (табл. 1). Так, найбільші показники врожайності плодових були в ізолятів С-05 і В-99 (84,0 і 81,7 г/кг, відповідно), що перевищувало значення контрольного штаму НК-35 (61,2 г/кг). Дещо нижчі показники врожайності тіл виявлено у культур К-99 і UX, що складало 75,5 і 74,3 г/кг, відповідно. Найменша врожайність плодових тіл була в ізолятів КЕ-2001 і Ю-12 і становила 10,3 і 9,0 г/кг, відповідно. Така ж закономірність спостерігалася і для наступного показника продуктивності плодових тіл - біологічної ефективності. Найбільшою БЕ була в ізолятів С-05 і В-99 (77,3 і 55,3 %, відповідно), що в 1,2-1,7 раза вище порівняно з контролем (45,7 %). Найменшою була в ізолятів КЕ-2001 і Ю-12 і була нижче контроля в 16-30 разів. У ході дослідження встановлено (табл. 1), що показники продуктивності у культур P. ostreatus взаємозалежні з показниками використання субстрату. Найбільш продуктивні культури В-99, С-05 і К-99 мали і найбільші показники коефіцієнта використання субстрату (k), який дорівнював 0,18, 0,15 і 0,15, відповідно, що перевищувало значення даного показника у контрольного штаму НК-35 (0,10 у.о.) в 1,8 і 1,5 раза. Середні показники коефіцієнта використання субстрату були в ізолятів UX та Ст-22 (0,14 і 0,10) і відповідали середнім показникам їх продуктивності. Менш продуктивні ізоляти КЕ-2001, Ю-12 і СПД мали найменші значення показника коефіцієнта використання субстрату - 0,02, 0,02 і 0,01, відповідно. З табл. 1 видно, що обраховані значення ефективності використання субстрату прямо пропорційні показникам врожайності плодових тіл гриба. Найбільші значення даного показника були в ізолятів В-99, С-05, UX та К-99 (57,0, 54,3, 53,0 і 52,3 %, відповідно). У контрольного штаму НК-35 значення показника Ε дорівнювало 50,7 %. Найменші значення показника Ε було у штамі 420 і ізоляті Р-15 (39,0 %). На підставі отриманих даних було встановлено залежність між урожайністю плодових тіл культур і ефективністю використання субстрату, яка описується рівнянням у=42,54+0,121x з коефіцієнтом кореляції R=0,67 (фіг. 1). На фіг. 1 показано залежність між ефективністю використання субстрату (Е, %) і урожайністю (г/кг) штамів гриба P. ostreatus. Отримані дані свідчать про те, що чим ефективніше культура гриба використовує живильні речовини субстрату, тим більше її урожайність. Це підтверджується знайденою залежністю між урожайністю досліджених культур гриба P. ostreatus і іншим показником використання субстрату - коефіцієнтом використання субстрату, яка описується лінійним рівнянням з високим коефіцієнтом кореляції R=0,95 (фіг. 2). На фіг. 2. показано залежність між коефіцієнтом використання субстрату та урожайністю культур гриба P. ostreatus. 2 UA 84401 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 З отриманих даних видно, що спостерігається пряма лінійна залежність між урожайністю і коефіцієнтом використання субстрату (k) гриба P. ostreatus, тобто більш урожайні культури більш ефективно споживали речовини субстрату для своєї життєдіяльності. З наведених даних видно, що коефіцієнт використання субстрату (фіг. 2) є більш вірогідним показником ефективності споживання живильних речовин субстрату культурами гриба P. ostreatus. На підставі отриманих даних було встановлено залежність з коефіцієнтом кореляції R=0,75 між двома показниками використання субстрату: коефіцієнтом використання субстрату і ефективністю використання субстрату, яка описується рівнянням у=-0,307+0,008x (фіг. 3). На фіг. 3 показано залежність між величинами використання субстрату культурами гриба P. ostreatus. Отримана кореляція є додатковим підтвердженням висновку про те, що чим ефективніше культура гриба використовує живильний субстрат, тим більша її врожайність. Результатами досліджень доведено, що запропонований спосіб лабораторного культивування гриба P. ostreatus дозволяє виявити морфобіологічні особливості штамів і ізолятів даного гриба за мінімальних економічних витрат. За запропонованою корисною моделлю спосіб має значні переваги і створює оптимальні умови для культивування грибів з використанням доступного та дешевого натурального компонента лушпиння соняшника. Джерела інформації: 1. Дудка И.А. Грибы: Справочник миколога и грибника / И.А. Дудка, С.П. Вассер. - К.: Наукова думка, 1987. - 536 с. 2. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. Справочник / С.М. Семенов. - М.: ВО "Агропромиздат", 1990. - 240 с. 3. Пат. 71179 Україна МПК C12N 1/00 C12R 1/645. Спосіб культивування вищих базидіальних грибів роду Coriolus / Клечак І.Р, Антоненко Л.О.; заявитель и патентоутримувач Нац. техн. ун-т України "Київський політехнічний інститут" - № u201113922; заявл. 25.11.2011; опубл. 10.07.2012, Бюл. № 13. 4. Пат. 6142 Україна МПК С12Р 21/00 C12R 1/645. Спосіб одержання білоквмісної біомаси гриба Pleurotus ostreatus / Зубарева І.Μ., Лапустіна О.В.; заявитель и патентоутримувач ДВНЗ "Український державний хіміко-технологічний університет" - № u201013860; заявл. 22.11.2011; опубл. 11.07.2012, Бюл. № 13. 5. Пат. 63646 Україна МПК A01G 1/04. Субстрат для вирощування грибів / Круподьорова Τ.Α., Барнштейн В.Ю.; заявитель и патентоутримувач ДУ "Інститут харчової біотехнологіїї та геноміки НАН України" - № u201105462; заявл. 29.04.2010; опубл. 10.10.2011, Бюл. № 19 (найближчий аналог). 6. Ломберг М.Л. Лікарські макроміцети у поверхневій та глибинній культурі: автореф. дис. на здобуття наук. ступ. канд. біол. наук: спец. 03.00.24 "Мікологія" / М.Л. Ломберг. - Київ, 2005. - 20 с. 7. Diehle D.A. Shiitake cultivation on sawdust: evaluation of selected genotypes for biological efficiency and mushroom size / D.A. Diehle, D.J. Royse // Mycologia. - 1986. - Vol. 78, N 6. - P. 929933. 8. Мануковский Н.С. Использование остаточного субстрата при выращивании вешенки Pleurotus Florida Fovose / H.С. Мануковский, В.С. Ковалев, И.В. Грибовская // Микол. и фитопатол. - 1998. Т. 32, вып. 6. - С. 43-46. 9. Приседський Ю.Г. Статистична обробка результатів біологічних експериментів / Ю.Г. Приседський. - Донецьк: Кассиопея, 1999. - 210 с. 3 UA 84401 U Таблиця 1 Показники продуктивності гриба P. ostreatus за лабораторного культивування на лушпинні соняшника № з/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Біологічна Штам Урожайність, ефективність (БЕ), (ізолят) г/кг % НК-35* 61,2±4,4 45,7±1,91 420 42,8±6,3 49,1±2,2 Д-140 21,8±2,4 32,1±3,3 С-05 84,0±2,1 77,3±3,8 UX 74,3±4,2 36,5±4,9 Д-29 42,7±3,8 19,4±1,9 К-99 75,5±2,9 47,9±5,3 Р-01 11,6±0,9 6,4±0,1 Р-12 42,3±2,7 30,6±1,1 СПД 15,7±0,4 10,2±0,9 Ст-22 50,9±5,2 20,2±2,7 Ю-12 9,0±1,1 2,9±0,5 025 15,5±2,3 8,4±1,2 В-99 81,7±5,9 55,3±1,5 ВК-2000 40,6±3,1 18,70±1,5 Р-15 22,2±2,1 32,1±3,00 С-2000 22,0±1,8 6,4±1,1 КЕ-2001 10,3±1,4 1,5±0,3 Коефіцієнт використання субстрату (к), у.о. 0,10 0,03 0,04 0,15 0,14 0,09 0,15 0,07 0,08 0,01 0,10 0,02 0,04 0,18 0,07 0,05 0,04 0,02 Ефективність використання субстрату (Е), % 50,7 39,0 49,0 54,3 53,0 44,3 52 3 44,3 49,0 47,3 49,7 46,3 44,0 57,0 48,7 39,0 47,7 46,7 * - контроль * Примітка до фіг. 1-3: (нумерація ізолятів і штамів 1-18 згідно табл. 1) 5 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб лабораторного культивування їстівних базидіальних грибів, що містить етапи підготовки субстрату з натуральних компонентів, розміщення по колбах з додаванням води, набухання субстрату, стерилізацію, інокуляцію та подальшу інкубацію в термостаті, який відрізняється тим, що на підготовчому етапі як субстрат використовують лушпиння соняшника, яке насипають в колбу Ерленмейєра в співвідношенні 1:5 до води, а подальшу стадію набухання субстрату здійснюють протягом однієї доби. 4 UA 84401 U Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5