Застосування екстрактів з vitex agnus castus, що містять фітоестроген, який селективно модулює бета-рецептори естрогену

1. Застосування фітоестрогенвмісних екстрактів з Vitex agnus castus для одержання медикаменту для селективного модулювання бета-рецептора естрогену без виникнення утеротропної дії, яке C2 2 (19) 1 3 87959 4 хоча такі екстракти не застосовували у лікуванні Щоб показати наявність фітоестрагенів в екстзамість естрогену. рактах Vitex Agnus castus (VAC), винахідники заВ період менопаузи рівень естрадіолу знижустосували метод аналізу рецепторів естрогену, ється внаслідок призупинення функції яєчників. Це згідно з яким радіоактивно маркований естрадіол призводить до уповільнення проліферативних рецепторів витісняється лігандами, які, в разі непроцесів та в гіпоталамусі - до підсилення активобхідності, приєднані до рецепторів, які надалі ності GnRH-генератора пульсу. (GnRH-генератор позначаються як модулятори. Як модулятори, з пульсу представляє собою тактовий генератор одного боку, застосовують нерадіоактивний естгіпоталамусу, він регулює розподіл LH, причому радіол, та, з іншого боку, досліджуваний екстракт. стероїди впливають на амплітуду та частоту.) В Препарат складається з цитозольної фракції матки результаті цього стимульований розподіл LH у свині, що містить обидва підтипи рецепторів естжінок клімактеричного віку призводить до небажарогену, а саме ER-альфа та ER-бета. Результати ного збільшення приливів, так званих „Hot flushes’’. типового експерименту показані на фіг. 1. При зниженні досить високого рівня естрадіоНа фіг. 1 показані криві витіснення естрадіолу лу в крові у кісній тканині переважає активність (Е2, не зафарбовані символи) та VAC-екстрактів остеокластів та внаслідок цього відбувається зме(зафарбовані символи). Вісь ординат відображає ншення маси кісток, пов'язане з підвищеною неступінь (ще наявного) приєднання радіоактивно безпекою переломів скелету. В той же час виникає маркованого естрадіолу до рецептора естрогену в небезпека утворення бляшок у судинній системі і %. Верхня вісь абсцис вказує Е2-концентрацію, в тим самим підвищується ризик інфарктів. той час як нижня вісь абсцис відображає VACНегативним виявився естрогеноподібний концентрацію. Таке витіснення, одержане при найвплив на матку, піхву, грудну тканину та печінку. нижчій концентрації досліджуваних речовин, вваНебажаним виявився той факт, що до цього часу в жають 100%-ним. Середні значення ± SEM одеррівні техніки не був описаний ніякий фітопрепарат, жують на основі потрійного аналізу. ЕС50 VAC який можна було б застосовувати для селективної становить 7,8 мкг/мл. профілактики або лікування браку естрогену. Як видно з фіг. 1, сполуки у VAC-екстрактах в Виходячи з цього рівня техніки задача даного залежності від дози "змагаються" з радіоактивно винаходу полягає у описі рослинних лікарських маркованим естрадіолом за місце приєднання засобів, що проявляють естрогеноподібну дію та рецепторів естрогену. Одержані результаті чітко не впливають або незначним чином впливають на показують, що досліджувані екстракти містять фіматку. тоестроген. Задача вирішується шляхом застосування згіДля підтвердження цих результатів, таке саме дно з п. 1. дослідження було проведене на основі препарату За допомогою екстрактів, що містять фітоестрецепторів ендометрію людини, що також містить роген, зокрема з Vitex Agnus castus, переважно обидва ER-підтипи. Результати цих досліджень плодів, згідно з даним винаходом вперше вдалося показані на фіг. 2. досягти селективної ER-beta-дії - без виникнення На фіг. 2 показані криві витіснення радіоактивутеротропної дії. Шляхом застосування екстрактів но маркованого естродіолу ER з ендометрію люVitex Agnus castus за допомогою модуляції ERдини естрадіолом (Е2, не зафарбовані символи) та beta можливо лікувати такі картини хвороб та паVAC-екстрактами (зафарбовані символи). Вісь тофізіологічні стани: ординат відображає ступінь (ще існуючого) приєд- ожиріння та можливий вплив на метаболічнання радіоактивно маркованого естрадіолу до ний синдром, зокрема гіпертонію, атеросклероз, рецептора естрогену в %. Верхня вісь абсцис вкаінфаркт міокарда, гіперандрогенемію; зує Е2-концентрацію, в той час як нижня вісь абс- порушення здатності до стримування в періцис відображає VAC-концентрацію. Таке витісненод менопаузи; ня, одержане при найнижчій концентрації - приливи в період менопаузи, які асоціюються досліджуваних речовин, вважають 100%-ним. Сез гіперстимуляцією гіпоталамічного GnRHредні значення ± SEM одержують на основі погенератора пульсу; трійного аналізу. ЕС50 VAC становить 12,7 мкг/мл. - порушення синтезу стероїдних гормонів, зокРезультати доводять, що фітоестрогени VACрема синтезу прогестерону жовтого тіла людини ектрактів приєднані до рецепторів естрогену люяк причина наявності значної кількості лютеаліну; дини на молекулярному рівні при естрогеноподіб- хвороба Альцгеймера, пов'язана з підвищеній дії сполук з VAC в організмі людини. ною експресією бета-рецептору естрогену в гіпоЗа наявності рекомбінантних протеїнів рецепкампальних нейронах. торів можуть бути проведені різні дослідження Згідно з винаходом екстракти можуть бути зазалежно від підтипу ER (ER-альфа або ER-бета). стосовані у фармацевтично прийнятній формі, Результат у формі типової кривої витіснення ERнаприклад, у формі крапель, пігулок, пігулок в цеальфа показаний на фіг. 3. лофановій упаковці, капсул, гранул, драже, свічок, Фіг. 3 показує дозування/криві дії естрадіолу мазей, кремів або інш. (Е2, не зафарбовані символи) та VAC-екстрактів Перевагу надають екстрактам з Vitex Agnus заявника (зафарбовані символи) при проведенні Castus, зокрема їх плодів та/або листків, одержадослідження за допомогою рекомбінантного ERним шляхом екстрагування етанолом або СO2 роальфа людини. Верхня вісь абсцис вказує Е2слин або частин рослин та їх застосуванню згідно концентрацію, в той час як нижня вісь абсцис відоз винаходом. бражає VAC-концентрацію. Таке приєднання, одержане при найнижчій концентрації досліджуваних 5 87959 6 речовин, вважають 100%-ним. Середні значення ± ніякої дії. * означає значне відхилення від показниSEM одержують на основі потрійного аналізу на ків контрольної групи. Це означає: одиницю концентрації. 1. Інгібування in vitro секреції прогестерону В той час як дозування Е2 та радіоактивних ліце естрогенний ефект. гандів рецепторів не узгоджені між собою, фітоес2. Дія естрадіолу 17-бета дуже специфічна, трогени VAC-екстрактів не приєднані до ERоскільки 17-альфа естрадіол не проявляє ніякої альфа. Таким чином ЕС50 підрахувати неможливо. дії. В ER-бета-дослідженнях застосовують ті самі Дія екстрактів Vitex Agnus castus при дослісполуки, що були застосовані в ER-альфадженні секреції прогестерону після 5-годинного дослідженнях. Результати репрезанетативного інкубування показаний на фіг. 6. дослідження показані на фіг. 4. Як видно з фіг. 6, екстракт Vitex Agnus castus Фіг. 4 показує дозування/криві дії естрадіолу як і 17-бета-естрадіол природнього походження (Е2, не зафарбовані символи) та VAC-екстрактів інгібує секрецію прогестерону гранульоззаявника (зафарбовані символи) при проведенні них/лютеальних клітин людини. З фармакологічної дослідження за допомогою рекомбінантного ERточки зору це слід розцінювати як естрогенний бета людини. Верхня вісь абсцис вказує Е2ефект. * означає значне відхилення від показників концентрацію, в той час як нижня вісь абсцис відоконтрольної групи. Вказані на осі абсцис концентбражає VAC-концентрацію. Таке витіснення, одеррації означають відповідні концентрації VACжане при найнижчій концентрації досліджуваних екстракту. речовин, вважають 100%-ним. Середні значення ± Оскільки гранульозні/лютеальні клітини людиSEM одержують на основі потрійного аналізу на ни експресують переважно, але не виключно, ERодиницю концентрації. ЕС50 VAC становить 9,9 бета, дослідження повторюють з використання мкг/мл. лютеальних клітин свині, тобто клітин, які експреНа відміну від дослідження ER-альфа фітоессують виключно ER-бета. Відповідні результати трогени VAC-екстрактів заявника в залежності від показані на фіг. 7. дозування приєднані до ER-бета. Ці результати Згідно з фіг. 7 при дослідженні цих клітин Vitex без сумніву підтверджують ER-бета-селективність Agnus castus проявляє чітко виражений естрогенекстрактів Vitex Agnus castus. ний ефект, оскільки секреція прогестерону (ліва Нижче наведені приклади дослідження естрочастина графіку, перші три колонки після першого генного впливу Vitex Agnus castus на гранульозконтролю середовища) значно уповільнена. Нені/лютеальні клітини людини та лютеальні клітини специфічна цитотоксична дія після визначення свині. життєздатності клітин (утворення пігменту МТТ Стероїдна секреція фолікул яєчників та жовтих згідно з відомим способами) повністю виключаєтьтіл на ендокринному рівні регулюється гормонами ся (права частина, останні три колонки після другіпофіза LH та FSH. Додатково відбувається локагого контролю середовища). Екстракт Vitex Agnus льний контроль за допомогою естрадіолу, який castus не впливає на життєздатність клітин, тобто називають паракринної регуляцією. Такий локальзниження секреції прогестерону - це специфічний ний контроль є передумової експресії рецептору естрогенний ефект. естрогену. Нові результати молекулярно* означає значне відхилення від показників кобіологічних досліджень підтверджують, що гранунтрольної групи. Вказані на осі абсцис концентральозні клітини частіше експресують підтип ER-бета ції означають відповідні концентрації VACу порівнянні з ER-альфа. А лютеальні клітини ексекстракту. пресують виключно ER-бета. Для підтвердження цього висновку клітини інЛютеальні клітини представляють собою прикубують екстрактом Vitex Agnus castus та разом з датну систему для дослідження паракринної дії тим антиестрогеном тамоксифеном. Результати у стероїдів. Такі клітини неможливо одержати з орвигляді діаграми показані на фіг. 8. ганізму людини, оскільки всі оперативні втручання, На фіг. 8 * означає значне відхилення від пов ході яких роблять біопсію, дуже часто здійснюказників контрольної групи. Вказані на осі абсцис ють у фолікульній фазі, щоб уникнути ризику несимволи означають: ТАМ = тамоксифен, показники виявленої вагітності. В рамках програм заплідненконцентрації = відповідна концентрація VACня in vitro так звані гранульозні/лютеальні клітини є екстракту та VAC+TAM = комбінація VACдоступними, вони поводять відносно рецепторів та екстракту вказаної в останньому стовпчику концесекреції як лютеалтьні клітини. За допомогою цієї нтрації з чистим VAC-екстрактом + тамоксифен. системи in vitro досліджують естроген ний ефект Згідно з фіг. 8 антиестроген тамоксифен сам Vitex Agnus castus. не впливає на секрецію прогестерону. Внаслідок Спочатку необхідно відобразити дію естрадіоприєднання тамоксифену до ER зменшується кільлу 17-бета (естрадіолу природного походження) у кість місць приєднання для складових речовин порівнянні з ізомером естрадіолу 17-альфа на сеVAC та таким чином знижується інгібування секрекрецію прогестерону гранульозних/лютеальних ції прогестерону. Цей факт підтверджує, що VAC клітини людини. Ці результати графічно показані впливає на синтез прогестерону через рецептор на фіг. 5. естрогену. Фіг. 5: 5-годинна інкубація цих клітин 17-бета Для дослідження утеротропної дії проводять естрадіолом (1 мкМ) приводить до значного інгібутакий експеримент, результати якого графічно вання секреції прогестерону, в той час як ізомер показані на фіг. 9. 17-альфа естрадіолу (також 1 мкМ) не проявляє Протягом понад 3 місяців у корм щурів жіночої статі, яких попередньо піддавали оваріектомії, та 7 87959 8 щурів чоловічої статі, яких попередньо піддавали лених естрадіолом, якщо ці тварини одержували орхіектомії, примішують VAC-екстракти двох різVAC. Результати досліджень показані на фіг. 12 та них концентрацій (100 мг/кг = VAC100 та 400 мг/кг 13. ваги тіла = VAC400). VAC на відміну від естрадіолу На фіг. 12 на осі ординат вказаний максимане проявляє уторотропну дію та не впливає на льний внутрішній тиск міхура в ммНg, визначений епителій піхви. Обидва проліферативні впливи для контролю, естрадіолу як позитивного контроестрадіолу в рамках пері- та постклімактеричного лю та VAC двох різних концентрацій. лікування естрогеном або гормонами є небажаниНа фіг. 13 на осі ординат нанесена поверхня ми у жінок після оваріектомії, оскільки при регуляпід кривою тиску [AUC] в ммНg x сек для контрорному прийомі естрогенів та недостатній регуляції лю, естрадіолу як позитивного контролю та VAC гестагенами можливість виникнення гіперплазії двох різних концентрацій. ендометрію внаслідок постійного проліферативноЗгідно з усім вищесказаним VAC-есктракти, які го впливу естрадіолу не виключається. не проявляють утеротропну дію, можуть бути заНа фіг. 9 на вісь ординат нанесена вага маток стосовані для одержання лікарських засобів для щурів. Окремі стовпчики стосуються контрольної лікування: групи (лише оваріектомованої), позитивного конт- ожиріння та можливого впливу на метаболічролю естрадіолу, а також ефектів при застосуванний синдром, зокрема гіпертонію, атеросклероз, ня VAC-екстрактів двох різних концентрацій. інфаркт міокарда, гіперандрогенемію; В даному випадку, як і у випадку з естрадіо- порушення здатності до стримування в перілом, утеротропна дія тварин, оброблених VAC, од менопаузи; згідно з фіг. 9 не може бути визначена, це означає, - приливів в період менопаузи, які асоціюються що VAC не проліферативно впливає на тканину з гіперстимуляцією гіпоталамічного GnRHматки. генератора пульсу; Незважаючи на це при проведенні подальших - порушення синтезу стероїдних гормонів, зокдосліджень з'ясували, що VAC може проявляти рема синтезу прогестерону жовтого тіла людини естрогенний вплив на інші системи органів. як причина наявності значної кількості лютеаліну; За допомогою комп'ютерної томографії досліа також джують черевну та великогомілкову жирові ткани- хвороби Альцгеймера, пов'язаної з підвищени щурів чоловічої та жіночої статі. При Е2 та висоною експресією бета-рецептору естрогену в гіпокому дозуванні Vitex Agnus castus спостерігають кампальних нейронах. зменшення розміру двох тканин. Одночасно змеЛітература: ншується рівень сироватки лептину у оброблених 1) Hrabovszky E, Shughrue PJ, Merchenthaler I, VAC тварин. Результати цього дослідження покаHajszan T, Carpenter CD, Liposits Z, Petersen SL. зані на фіг. 10 та 11. Detection of estrogen receptor-beta messenger Фіг. 10 показує вплив естрадіолу та VAC двох ribonucleic acid and 1251-estrogen binding sites in різних концентрацій на великогомілкову жирову luteinizing hormone-reieasing hormone neurons of тканину у вигляді процентного співвідношення the rat brain. Endocrinology 2000Sep;141(9):3506-9. жирової тканини в області великогомілкової кістки 2) Hosokawa K, Ottander U, Wahlberg P, Ny T, по відношенню до контрольної групи. Cajander S, Olofsson U. Фіг. 11 показує вплив естрадіолу та VAC двох Dominant expression and distribution of oestroрізних концентрацій на вміст сироватки лептину, gen receptor beta over oestrogen receptor alpha in нанесений на вісь ординат в нг/мл. the human corpus luteum. Мої Hum Reprod 2001 Як видно з фіг. 10 та 11, при прийомі VAC споFeb;7(2): 137-45. стерігається зниження вмісту жиру в області вели3) Taylor AH, Al-Azzawi F. когомілкової кістки та зменшення концентрації сиImmunolocalisation of oestrogen receptor beta in роватки лептину. human tissues. J Mol Endocrinol 2000 Feb;24(1): За допомогою комп'ютерної томографії спо145-55. стерігають також за зміною щільності кісток (зме4) Kuiper GG, Carlsson B, Grandien K, Enmark ншення розвитку остеопорозу) на метафізі в облаE, Haggblad J, Niisson S, Gustafsson JA 1997. Comсті великогомілкової кістки у щурів чоловічої та parison of the ligand binding specificity and transcript жіночої статі. Результати показують, що при приtissue distribution of estrogen receptors alpha and йомі VAC щільність кісток зменшується значно beta. Endocrinology 138:863-870. повільніше, ніж в контрольній групі тварин. 5) Saunders PT, Maguire SM, Gaughan J, Millar Інстиляція 1 мл фізіологічного розчину хлорисMR, 1997. того натрію катетером у сечовий міхур оваріектоExpression of oestrogen receptor beta (ER beta) мованих щурів жіночої статі протягом 1 хвилини in multiple rat tissues visualised by immunohistoприводить до підвищення внутрішнього тиску міchemistry. J Endocrinol 154:R13-R16. хура. У тварин, які протягом 3 місяців одержували 6) Mäkelä S, Strauss L, Kuiper G, Valve E, Salmi Е2, збільшення тиску припиняється в приблизно в S, Santti R, Gustafsson JA, 2000. Differential expres3 рази швидше, ніж у тварин контрольної групи, які sion of estrogen receptors alpha and beta in adult rat піддали плацеболікуванню, він трохи слабший, accessory sex glands and lower urinary tract. Моl Cell але значно відрізняється від тиску тварин, обробEndocrinol 164:109-116. 9 87959 10 11 87959 12 13 Комп’ютерна верстка І. Скворцова 87959 Підписне 14 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601