Тканинозахисні пептиди і їх застосування

Реферат: Винахід належить до нових тканинозахисних пептидів, зокрема до ізольованого поліпептиду, який складається не більше ніж з 30 амінокислотних залишків, який містить 11 направлених назовні амінокислотних залишків спіралі В еритропоетину, де в одному з вказаних амінокислотних залишків здійснена консервативна або неконсервативна заміна, або його зворотний інверсний аналог. Винахід також охоплює фармацевтичну композицію, що містить ізольований пептид, спосіб захисту, збереження або посилення життєздатності чутливої клітини, тканини або органа, застосування ізольованого пептиду для одержання фармацевтичної композиції для профілактики, терапевтичного або профілактичного лікування захворювань серцево-судинної системи, легенів, нирок, репродуктивно-сечової системи, кісток, шкіри, шлунково-кишкового тракту, ендокринної системи, розладів центральної або периферичної нервової системи. UA 100222 C2 (12) UA 100222 C2 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1. Вступ Даний винахід стосується нових тканинозахисних пептидів. Тканинозахисні пептиди відповідно до винаходу можуть зв'язуватися з тканинозахисним рецепторним комплексом. Зокрема, даний винахід стосується тканинозахисних пептидів, отриманим з частин лігандів рецепторів цитокінів, включаючи еритропоетин (EPO), або таких, що мають спільні консенсусні послідовності, при цьому такі частини не задіяні в зв'язування ліганду з рецепторним комплексом, наприклад, з гомодимером рецептора EPO. Відповідно, тканинозахисні пептиди відповідно до винаходу одержують з амінокислотних послідовностей ділянок лігандів рецепторів цитокінів, що зазвичай розташовані в ділянці білка ліганду, що знаходиться на протилежній стороні від рецепторного комплексу, тобто одержують з амінокислотних послідовностей ділянок білка ліганду, що повернені в інший бік від рецепторного комплексу в той час, коли ліганд зв'язаний з рецептором. Крім того, винахід стосується консенсусних послідовностей для застосування в конструюванні синтетичного тканинозахисного пептиду. Вказані тканинозахисні пептиди також містять у собі фрагменти, химери, а також пептиди, сконструйовані для імітації просторової локалізації ключових амінокислотних залишків у лігандах тканинозахисних рецепторів, наприклад, EPO. В обсяг винаходу також входять способи лікування, профілактики або поліпшення стану при захворюванні або розладі і/або способи лікування, регенерації або зменшення ушкодження тканини з використанням тканинозахисних пептидів згідно із даним винаходом. Винахід також охоплює способи посилення функції збуджуваної тканини з використанням тканинозахисних пептидів згідно із даним винаходом. 2. Рівень техніки Еритропоетин («EPO») є глікопротеїдним гормоном, який зазвичай пов'язують з підтримкою гематокриту, а останнім часом - із захистом тканин. Зрілий білок EPO людини містить 165 амінокислот і має молекулярну масу 34 кД, при цьому глікозильні залишки складають близько 40% маси молекули. Молекула EPO містить чотири спіралі, що взаємодіють за допомогою своїх гідрофобних доменів з утворенням переважно глобулярної структури у водному оточенні (Cheetham et al., 1998, Nat. Struct. Biol. 5: 861-866, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Винахід здійснений на підставі відкриття того, що деякі амінокислоти, направлені в бік водної оболонки (тобто в бік від гідрофобного центрального ядра глобули), опосередковують захист тканини. Пептиди можуть бути отримані або сконструйовані на підставі даних про тканинозахисні ділянки, що були ідентифіковані заявниками. Як вказано вище, EPO є плюрипотентним. При здійсненні своєї гормональної функції EPO регулює гематокрит завдяки тій ролі, що він грає в дозріванні еритроїдних клітин-попередників в еритроцити. EPO діє як протиапоптозний агент у ході процесу дозрівання еритроїдних клітинпопередників, забезпечуючи можливість дозрівання клітин-попередників в еритроцити. Знижені рівні кисню в тканинах (гіпоксія) запускають підвищену продукцію еритропоетину нирками, що призводить до посилення еритропоезу. Оскільки нирки в нормі продукують велику частину еритропоетину сироватки, порушення функції нирок, таке як хронічна ниркова недостатність, призводить до зниженої продукції ЕРО і часто призводить до анемії. Подібним чином, анемія може виникати в результаті інших хронічних станів, таких як злоякісна пухлина, або способів лікування, пов'язаних з такими захворюваннями, наприклад, у результаті хіміотерапії, що безпосередньо пригнічує продукцію EPO. Єкомерційно доступний рекомбінантний еритропоетин торгових марок PROCRIT, доступний з Ortho Biotech. Inc., Raritan, NJ, і EPOGEN, доступний з Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA, і такий еритропоетин використовували для лікування анемії, що виникає на кінцевій стадії захворювання нирок, у результаті лікування AZT (зидовудином) ВІЛ-інфікованих пацієнтів, онкологічних хворих і в результаті хіміотерапії. В TM даний час є гіперглікозильований еритропоетин, ARANESP (Amgen, Thousand Oaks, CA), для лікування анемії. Крім того, вказані сполуки використовували для підвищення гематокриту у пацієнтів, які піддаються хірургічним операціям, щоб зменшити потребу в переливаннях алогенної крові. Нещодавно отримані дані показали, що EPO також функціонує локально паракриноаутокринним шляхом, мінімізуючи ушкодження тканини. Наприклад, EPO поліпшує мікрооточення клітин при гіпоксії і знижує запрограмовану загибель клітин, викликану метаболічним стресом. Обидві вказані активності частково опосередковані взаємодією EPO зі специфічним рецептором клітинної поверхні, до складу якого входить білок рецептора еритропоетину («EPOR»). EPOR є білком з молекулярною масою близько 66 кД і є представником сімейства рецепторів цитокінів типу 1. Дане сімейство містить у собі рецептори, які згруповані разом на основі загальної гомології їх позаклітинних доменів, і включає рецептори інтерлейкіну IL-2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, IL11, колонієстимулюючого фактора гранулоцитів і 1 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 макрофагів (GM-CSF), колонієстимулюючого фактора гранулоцитів (G-CSF), інгібуючого лейкоз фактора (LIF), циліарного нейротрофічного фактора (CNTF), тромбопоетину, гормону росту і пролактину. Консервативний позаклітинний домен вказаних рецепторів має довжину приблизно 200 амінокислот, містить чотири консервативних за своїм положенням залишки цистеїну в аміно-кінцевій ділянці (Cys 294, Cys 283, Cys 248 і Cys 238, що, очевидно, важливі для th підтримки і структурної цілісності рецепторів (Murray, 1996, Harpers Biochemistry 24 ed. pp. 524526, Appilion and Lange, Ltd.; Caravella et al., 1996, Protein: Struct. Funct. Gen. 24:394-401, кожна публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі) і мотив Trp-Ser-X-TrpSer (SEQ ID NO:58), розташований поблизу трансмембранного домену. У зв'язку з еритропоезом EPOR функціонує подібно іншим рецепторам у сімействі рецепторів цитокінів типу 1. По-перше, ліганд рецептора, наприклад, EPO, зв'язується з попередньо утвореним димером EPOR, (EPOR)2. Було визначено, що EPO взаємодіє з позаклітинним доменом класичного гомодимерного рецептора (EPOR) 2 за допомогою двох окремих ділянок на поверхні ліганду: високоафінна ділянка зв'язування з рецептором (ділянка 1) і низькоафінна ділянка зв'язування з рецептором (ділянка 2). Амінокислотні послідовності EPO, зв'язані з ділянкою 1 являють собою послідовність TKVNFY, SEQ ID NO:2, що відповідає амінокислотам 44-49 у SEQ ID NO:1, і послідовність SNFLRG, SEQ ID NO:3, що відповідає амінокислотам 146-151 у SEQ ID NO:1; послідовності, зв'язані з ділянкою 2, являють собою послідовність VLERY, SEQ ID NO:4, що відповідає амінокислотам 11-15 у SEQ ID NO:1, і SGLRS, SEQ ID NO:5, що відповідає амінокислотам 100-104 у SEQ ID NO:1 (Cheetham et al., 1998, Nature Structural Biology 5: 861-866, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Активація гомодимеру EPOR призводить до фосфорилування тирозину сигнальних білків, що зв'язані з EPOR, наприклад, тирозинкіназ Jak2, що у свою чергу можуть активувати кілька різних шляхів, включаючи, наприклад, шлях кінази фосфатидилінозитолу (PI) 3, шлях Ras/MAP-кінази і/або шлях STAT. Вказані шляхи запускають протиапоптозні функції, необхідні для еритропоезу, що опосередковані еритропоетином (Kirito et al., 2002, Blood 99:102110; Livnah et al., 1999, Science 283:987-990; Naranda et al., 2002, Endocrinology 143:2293-2302; Remy et al., 1999, Science 283:990-993; і Yoshimura et al., 1996, The Oncologist 1:337-339, кожна публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Нещодавно автори винаходу виявили, що тканинозахисні властивості EPO опосередковані рецептором, що містить не тільки EPOR, але також інший білок рецептора, загальний рецептор бета («βc»). Рецептор EPOR/βc на відміну від гомодимеру (EPOR)2 є гетерокомплексом (див. нижче) і, як відомо, відіграє роль у захисті збуджуваних тканин. Див., наприклад, WO 2004/096148 і PCT № PCT/US01/49479, подану 28 грудня 2001, заявки на видачу патенту США No. 09/753132, подану 29 грудня 2000, і 10/188905, подану 3 липня 2002, кожна публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі. Хоча автори винаходу встановили, що βc-рецептор є центральним рецептором шляхів тканинного захисту таких збуджуваних тканин, структури, які активують ліганди для рецепторів, ще невідома. 3. Суть винаходу Даний винахід стосується ізольованих поліпептидів, які мають щонайменше одну активність, що захищає клітини, відносно чутливої клітини, тканини або органа, і такі поліпептиди містять амінокислотні мотиви, що включають у себе консенсусну послідовність (a) H 1-N1-(X)n-N2-H2, де n дорівнює 0, 1, 2, 3, 4 або 5; (b) H1-N1-(X)n-N2-L1, де n дорівнює 0, 1, 2, 3, 4 або 5; (c) L1-N1-(X)n-N2H1, де n дорівнює 0, 1, 2, 3, 4 або 5; (d) H1-N1-(L)n-P1-H2, де n дорівнює 0 або 1; або (e) H1-P1-(L)nN1-H2, де n дорівнює 0 або 1, і де H1 і H2 означають гідрофобні амінокислоти, N1 і N2 означають негативно заряджені амінокислоти, X означає будь-яку амінокислоту, L1 означає полярну амінокислоту і P1 означає позитивно заряджену амінокислоту. У деяких варіантах пептиди відповідно до винаходу також не мають еритропоетичну активність, наприклад, не підвищують вміст гемоглобіну або гематокрит у реципієнта. У наступних варіантах ізольовані поліпептиди відповідно до винаходу складаються не більше ніж з 10, не більше ніж з 15, не більше ніж з 20 або не більше ніж з 30 амінокислот. В інших варіантах ізольований пептид має менше ніж 90%, менше ніж 85%, менше ніж 80%, менше ніж 75%, менше ніж 70%, менше ніж 65%, менше ніж 60%, менше ніж 55%, менше ніж 50%, менше ніж 45%, менше ніж 40%, менше ніж 35%, менше ніж 30% або менше ніж 20 процентну ідентичність послідовності з будь-якою частиною амінокислотної послідовності зрілого еритропоетину («EPO») людини, вказаною в SEQ ID NO:1, при цьому вказана частина EPO містить таку ж кількість амінокислотних залишків, що і вказаний пептид. У деяких варіантах здійснення винаходу, описаних вище, в яких ізольований поліпептид містить структурний мотив (a) H1-N1-(X)n-N2-H2, де n дорівнює 0, 1, 2, 3, 4 або 5 (вказаний послідовностями з ідентифікаційними номерами 6-11, відповідно, які обговорюються нижче); (b) 2 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 H1-N1-(L)n-P1-H2, де n дорівнює 0 або 1 (вказаний послідовностями с ідентифікаційними номерами 24-25, відповідно, які обговорюються нижче); або (e) H 1-P1-(L)n-N1-H2, де n дорівнює 0 або 1 (вказаний послідовностями з ідентифікаційними номерами 26-27, відповідно, які обговорюються нижче), H1 і H2 можуть бути однією і тією ж гідрофобною амінокислотою. В інших варіантах здійснення винаходу, описаних вище, в яких ізольований поліпептид містить структурні мотиви (a) H1-N1-(X)n-N2-H2, де n дорівнює 0, 1, 2, 3, 4 або 5; (d) H1-N1-(L)n-P1-H2, де n дорівнює 0 або 1; або (e) H1-P1-(L)n-N1-H2, де n дорівнює 0 або 1, H1 і H2 можуть являти собою різні гідрофобні амінокислоти. В інших варіантах винахід стосується ізольованого поліпептиду, що містить амінокислотний мотив (a) H1-N1-(X)n-N2-H2, де n дорівнює 0, 1, 2, 3, 4 або 5; (b) H1-N1(X)n-N2-L1, де n дорівнює 0, 1, 2, 3, 4 або 5; (c) L1-N1-(X)n-N2-H1, де n дорівнює 0, 1, 2, 3, 4 або 5, і де N1 і N2 можуть означати ту саму або різні негативно заряджені амінокислоти. Винахід стосується ізольованих поліпептидів, що містять амінокислотні мотиви, описані вище, при цьому вказані мотиви утворені амінокислотами, що ідуть одна за одною, в амінокислотній послідовності вказаного поліпептиду. У конкретних прикладах відповідно до даного варіанта винахід стосується ізольованого поліпептиду, що містить амінокислотний мотив H1-N1-N2-H2 (SEQ ID NO:6), H1-N1-X-N2-H2 (SEQ ID NO:7), H1-N1-X-X-N2-H2 (SEQ ID NO:8), H1-N1X-X-X-N2-H2 (SEQ ID NO:9), H1-N1-X-X-X-X-N2-H2 (SEQ ID NO:10), H1-N1-X-X-X-X-X-N2-H2 (SEQ ID NO:11), H1-N1-N2-L1 (SEQ ID NO:12), H1-N1-X-N2-L1 (SEQ ID NO:13), H1-N1-X-X-N2-L1 (SEQ ID NO:14), H1-N1-X-X-X-N2-L1 (SEQ ID NO:15), H1-N1-X-X-X-X-N2-L1 (SEQ ID NO:16), H1-N1-X-X-X-X-XN2-L1 (SEQ ID NO:17), L1-N1-N2-H2 (SEQ ID NO:18), L1-N1-X-N2-H2 (SEQ ID NO:19), L1-N1-X-X-N2-H2 (SEQ ID NO:20), L1-N1-X-X-X-N2-H2 (SEQ ID NO:21), L1-N1-X-X-X-X-N2-H2 (SEQ ID NO:22), L1-N1-XX-X-X-X-N2-H2 (SEQ ID NO:23), H1-N1-P1-H2 (SEQ ID NO:24), H1-N1-L1-P1-H2 (SEQ ID NO:25), H1P1-N1-H2 (SEQ ID NO:26) або H1-P1-L1-N1-H2 (SEQ ID NO:27), де H1 і H2 означають гідрофобні амінокислоти, N1 і N2 означають негативно заряджені амінокислоти, X означає будь-яку амінокислоту, L1 означає полярну амінокислоту, і P1 означає позитивно заряджену амінокислоту. У деяких аспектах, що відповідають даному варіанту, в яких ізольований поліпептид містить мотив, що має амінокислотні залишки H1 і H2, H1 і H2 можуть бути однаковими або можуть бути різними гідрофобними амінокислотами. В інших аспектах, що відповідають даному варіанту, в яких ізольований поліпептид містить мотив, що має амінокислотні залишки N1 і N2, N1 і N2 можуть бути однаковими або можуть бути різними негативно зарядженими амінокислотами. В інших варіантах здійснення винахід стосується ізольованих поліпептидів, в яких амінокислотний мотив утворений завдяки просторовій організації амінокислот у третинній структурі поліпептиду, тобто амінокислоти, що утворюють мотив, просторово близькі одна одній в тривимірній структурі, тобто в третинній структурі, поліпептиду, але можуть бути розділені 1 або декількома амінокислотами в первинній амінокислотній послідовності поліпептидного ланцюга. У конкретному прикладі відповідно до даного варіанта амінокислотний мотив, що містить амінокислотні залишки H1, N1, N2 і H2, аналогічний послідовності SEQ ID NO:6, обговорюваної вище, може утворитися в результаті формування третинної структури, що приймається, наприклад, завдяки білковому укладанню пептидів, що містять, наприклад, послідовності SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 або SEQ ID NO:11, в яких амінокислотні залишки між N1 і N2, наприклад (X)n, піддаються укладанню таким чином, що N1 і N2 стають лінійно близькими. Відповідно, винахід охоплює ізольовані пептиди, що містять амінокислотний мотив H1N1N2H2; H1N1N2L1; L1N1N2H1; H1N1(L)n1H2, де n дорівнює 0 або 1; або H1P1(L)n1H2, де n дорівнює 0 або 1, і вказані мотиви утворюються у результаті формування третинної структури вказаного поліпептиду. У споріднений варіантах, в яких амінокислотний мотив містить N1 і N2, третинні структури утворюються так, що відстань між карбонільними атомами вуглецю N1 і N2 складає приблизно від 3 Ǻ до 5 Ǻ, переважно приблизно від 4 Ǻ до 5 Ǻ і більш переважно приблизно від 4,4 Ǻ до 4,8 Ǻ. В інших варіантах здійснення, в яких амінокислотний мотив містить N1 і N2, третинні структури утворюються так, що відстань між N 1 і N2 просторово обмежена, так що відстань, що розділяє заряди, наприклад, заряджені бічні ланцюги двох амінокислот, складає приблизно від 6,5 Ǻ до 9 Ǻ. У спорідненому варіанті N 1 і N2 відповідно просторово обмежені в результаті того, що вони знаходяться в амінокислотній послідовності, що утворює всю або частину альфа-спіралі, і можуть бути розділені 1, 2 або більше ніж 2 амінокислотами в послідовності вказаних амінокислот, що утворюють вказану спіраль. В інших споріднених варіантах, в яких амінокислотний мотив містить N 1 і P1, третинні структури утворюються так, що відстань між карбонільними атомами вуглецю N1 і P1 складає приблизно від 3 Ǻ до 5 Ǻ, переважно приблизно від 4 Ǻ до 5 Ǻ і більш переважно приблизно від 4,4 Ǻ до 4,8 Ǻ. В інших варіантах, в яких амінокислотний мотив містить N 1 і P1, третинні структури утворюються так, що відстань між N1 і P1 просторово обмежена, так що відстань, яка 3 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розділяє заряди, наприклад, заряджені бічні ланцюги двох амінокислот, складає приблизно від 6,5 Ǻ до 9 Ǻ. У спорідненому варіанті N1 і P1 просторово обмежені в результаті того, що вони знаходяться в амінокислотній послідовності, що утворюють всю або частину альфа-спіралі, і можуть бути розділені 1, 2, або більше, ніж 2 амінокислотами в послідовності вказаних амінокислот, що утворюють вказану спіраль. У деяких варіантах амінокислоти, що утворюють мотив у третинній структурі вказаного поліпептиду, відділені одна від одної однаковою кількістю проміжних амінокислотних залишків у лінійній амінокислотній послідовності вказаного поліпептиду. В інших варіантах амінокислоти, що утворюють мотив у третинній структурі вказаного поліпептиду, відділені одна від одної різною кількістю проміжних амінокислотних залишків у лінійній амінокислотній послідовності вказаного поліпептиду. У деяких варіантах ізольований поліпептид відповідно до винаходу утворює регулярну третинну структуру, наприклад, α-спіраль або β-складчастий шар, так що поверхня вказаної структури представлена амінокислотами, що складають вказаний мотив, і в такий спосіб мотив як такий напрямлений до границі поділу структури білка і водного оточення, тобто представлена мотивом на поверхні підданого укладанню поліпептиду. У переважних варіантах третинні структури поліпептидів відповідно до винаходу утворюються у водному середовищі в фізіологічних умовах, наприклад, у PBS (13 мМ Na2PO4, 137 мМ NaCl, pН 7,4) при 37ºC. У конкретних варіантах винахід стосується ізольованих поліпептидів, що містять амінокислотні мотиви, описані вище, наприклад, пептид A (APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE, SEQ ID NO:32), пептид C (NITVPDTKVNFYAWKRMEVG, SEQ ID NO:29), пептид D (QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV, SEQ ID NO:30), пептид E (GCAEHCSLNENITVPDTKVN, SEQ ID NO:31), пептид F (RYLLUNITTGC, SEQ ID NO:33), пептид G (QEQLERALNSS, SEQ ID NO:40), пептид I (CSLNENIQEQLERALNSS, SEQ ID NO:43), пептид J (QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR, SEQ ID NO:41), пептид K (WEHVNAIQEARRLL, SEQ ID NO:35) або пептид L (KIRSDLTALTESYVKH, SEQ ID NO:37). У деяких варіантах винахід стосується ізольованих поліпептидів, що містять 1 або більше, 2 або більше, 3 або більше, 4 або більше, 5 або більше, 6 або більше або більше ніж 6 амінокислотних мотивів, описаних у даній публікації. У конкретних аспектах винаходу відповідно до даного варіанта, в яких ізольований поліпептид містить щонайменше два амінокислотних мотиви, описаних вище, вказані щонайменше два мотиви можуть бути однаковими мотивами або можуть бути різними мотивами. У деяких аспектах винахід стосується ізольованих поліпептидів, що не мають еритропоетичну активність, наприклад, що не збільшує рівень гемоглобіну у реципієнта. Переважно ізольовані поліпептиди не мають інші активності, включаючи без обмеження вазоактивну дія (наприклад, звуження кровоносних судин), гіперактивацію тромбоцитів, прокоагулянтні активності і стимуляцію проліферації і/або продукції тромбоцитів і/або залежних від еритропоезу клітин (див. Coleman et al., 2006, PNAS 103:5965-5970, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). В інших аспектах винахід стосується ізольованих поліпептидів, які мають щонайменше одну захисну відносно клітин активність. Така захисна відносно клітин активність включає без обмеження захист, збереження, посилення або відновлення функції або життєздатності чутливої клітини, тканини або органа ссавця. Відповідно, в одному аспекті даний винахід стосується застосування ізольованого поліпептиду, охарактеризованого в даному описі, для одержання фармацевтичних композицій для захисту, збереження, посилення або відновлення функції або життєздатності чутливих клітин, тканин або органів ссавців. У споріднених варіантах композиції призначені для введення суб’єкту, який потребує такого введення. У переважних варіантах вказаним суб'єктом є ссавець і переважно людина. В інших аспектах даний винахід стосується застосування ізольованого поліпептиду, охарактеризованого в даному описі, для одержання фармацевтичної композиції для захисту і/або запобігання ушкодження чутливої тканини, для відновлення або для поновлення чутливої тканини і/або чутливої функції тканини в суб’єкта, що потребує цього. В одному конкретному аспекті чутливі клітини ссавців і зв'язані з ними клітини, тканини або органи є дистальними відносно судинної мережі через щільний бар'єр, що складається з ендотеліальних клітин. В іншому конкретному аспекті клітини, тканини, органи або інші частини тіла виділені від організму ссавця, наприклад, призначені для трансплантації. Як не обмежувальні приклади чутлива клітина або тканина може являти собою нейронну клітину або тканину, клітину або тканину ока (наприклад, сітківки), жирову, сполучну, клітину або тканину волоса, зубів, слизової оболонки, підшлункової залози, ендокринну, вуха, епітеліальну, шкіри, м'язів, серця, легені, печінки, нирки, кишечнику, надниркової залози (наприклад, кори надниркових залоз, мозкової речовини надниркових залоз), капілярів, ендотелію, сім’яників, яєчника, кіст, шкіри або ендометрія. Крім 4 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 того, не обмежувальні приклади чутливих клітин включають фоторецептори (палички і колбочки), клітини нервового вузла, біполярні, горизонтальні, амакринні, Мюлеровські, Пуркін’є, міокарда, водія ритму, синусно-передсерцевого вузла, синусового вузла, сполучної тканини, атріовентрикулярного вузла, пучка Гіса, гепатоцити, зірчасті, Купфера, мезангіальні, епітеліальні клітини нирок, тубулярні інтерстиційні, бокалоподібні, кишкових крипт, ендокринні клітини кишечнику, клітини клубочкової зони, клітини пучкової зони, ретикулярні, хромафінні, перицити, Лейдіга, Сертолі, сперматозоїди, Граафових пухирців, примордіальних фолікулів, острівців Лангерганса, α-клітини, β-клітини, γ-клітини, F-клітини, остеогенні клітини-попередники, остеокласти, остеобласти, строми ендометрія, ендометріальні, стовбурові та ендотеліальні клітини. Вказані приклади чутливих клітин є тільки ілюстративними. В одному аспекті чутливі клітини або зв'язані з ними клітини, тканини або органи являють собою збуджувані клітини, тканини або органи або переважно включають збуджувані клітини або тканини. У деяких аспектах винаходу збуджуваною тканиною є тканина центральної нервової системи, тканина периферичної нервової системи, тканина серця або тканина сітківки. В іншому аспекті чутлива клітина або зв'язані з нею клітини, тканини або органи є незбуджуваними клітинами, тканинами або органами, або вони переважно не містять збуджуваних клітин або тканин. Еритропоетичну і/або захисну активність клітин ізольованого поліпептиду відповідно до винаходу відносно чутливих клітин можна оцінити і/або визначити будь-яким способом, охарактеризованим у даному описі і/або відомим у даній галузі. У деяких варіантах еритропоетичну і/або захисну активність клітин визначають в аналізі in vitro. В інших варіантах еритропоетичну і/або захисну активність клітини визначають в аналізі in vivo. У спорідненому варіанті, в якому захисна активність клітини являє собою нейропротекцію, винахід стосується способу оцінки вказаної активності in vitro за допомогою (a) здійснення контакту тестованої культури первинних нейронів гіпокампа з N-метил-D-аспартатом і вказаним пептидом; і (b) визначення життєздатності клітин через 48 годин після вказаного контакту, при цьому якщо життєздатність клітин, обумовлена на стадії (b), вище, ніж у контрольній культурі під час відсутності вказаного пептиду, то пептид має захисну активність клітини. У конкретному варіанті клітина, тканина або орган ссавця, відносно яких застосовують вказаний вище ізольований пептид, являють собою клітину, тканину або орган, що протягом визначеного періоду часу піддавалися або будуть піддаватися впливу щонайменше одного стану, несприятливого для життєздатності клітини, тканини або органа. Відповідно до даного варіанта ізольовані пептиди відповідно до винаходу забезпечують захист і/або запобігають ушкодження тканини, що виникає в результаті таких станів, забезпечують відновлення або забезпечують поновлення тканини і/або функції тканини у суб’єкта, який потребує цього, до, під час або після виникнення таких станів. Такі стани включають викликану травмою гіпоксію in situ або метаболічну дисфункцію, індуковану хірургічним втручанням гіпоксію in situ або метаболічну дисфункцію або вплив токсину in situ, останнє може бути зв'язане з або хіміотерапією променевою терапією. В інших варіантах ізольовані пептиди відповідно до винаходу забезпечують захист і/або запобігають ушкодженню тканини, що виникає в результаті захворювання або розладу, забезпечують відновлення або забезпечують поновлення тканини і/або функції тканини у суб'єкта, що потребує цього, до, під час або після виникнення таких станів. У споріднених варіантах вказане ушкодження викликане епілепсією, розсіяним склерозом, інсультом, гіпертонією, зупинкою серця, ішемією, інфарктом міокарда, запаленням, пов’язаною з віком втратою когнітивної функції, радіаційним ураженням, церебральним паралічем, нейродегенеративним захворюванням, хворобою Альцгеймера, хворобою Паркінсона, мітохондріальним захворюванням, пов'язаною зі СНІДом деменцією, втратою пам'яті, бічним аміотрофічним склерозом, алкоголізмом, розладом настрою, тривожним розладом, синдромом порушення уваги, аутизмом, хворобою Крейтцфельда-Якоба, травмою або ішемією головного або спинного мозку, штучним кровообігом, хронічною серцевою недостатністю, дегенерацією жовтої плями, діабетичною нейропатією, діабетичною ретинопатією, гепатитом, панкреатитом, глаукомою, ішемією сітківки, травмою сітківки, серцевосудинним захворюванням, серцево-легеневим захворюванням, респіраторним захворюванням, хворобою нирок, хворобою сечової системи, захворюванням репродуктивної системи, захворюванням кісток, шкірною хворобою, захворюванням сполучної тканини, шлунковокишковим захворюванням, ендокринним порушенням, метаболічним порушенням або захворюванням або розладом центральної або периферичної нервової системи. В інших варіантах несприятливі стани є результатом застосування екстракорпорального кровообігу (апарата штучного кровообігу), що використовують при деяких хірургічних операціях. В інших варіантах вказане ушкодження являє собою когнітивну дисфункцію. У конкретному варіанті 5 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітина, тканина або орган ссавця, відносно якого застосовують вказаний вище ізольований пептид, експресують βc-рецептор. У деяких варіантах винахід також стосується фармацевтичних композицій, які містять вказані вище ізольовані поліпептиди для введення суб'єкту, що потребує такого введення. У конкретних аспектах даного варіанта фармацевтична композиція відповідно до винаходу додатково містить фармацевтично прийнятного носія. Такі фармацевтичні композиції можуть бути приготовлені для орального, інтраназального, очного, інгаляційного, трансдермального, ректального, під'язикового, вагінального або парентерального введення або у формі перфузованого розчину для підтримки життєздатності клітин, або тканин органів ex vivo. У споріднених варіантах здійснення винаходу суб'єктом є ссавець, переважно людина. В інших аспектах винахід стосується способу полегшення трансцитозу молекули через бар'єр з ендотеліальних клітин у суб’єкта, який потребує цього, що містить у собі введення вказаному суб'єкту композиції, що містить вказану молекулу, зв'язану з ізольованим пептидом відповідно до винаходу, описаного вище. У спорідненому варіанті зв'язок являє собою лабільний ковалентний зв'язок, стабільний ковалентний зв'язок або нековалентне зв'язування з ділянкою зв'язування для вказаної молекули. Відповідно до іншого аспекту винаходу ізольований пептид відповідно до винаходу, описаний вище, здатний долати бар'єр ендотеліальних клітин. У спорідненому варіанті бар'єр ендотеліальних клітин містить у собі гематоенцефалічний бар'єр, гематоофтальмічний бар'єр, гематотестикулярний бар'єр, гематооваріальний бар'єр, гематоплацентарний бар'єр, бар'єр кров-серце, крові-нирки, або нерви кров-спинний мозок. Відповідно до одного аспекту винаходу пропонується ізольована молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, що містить описаний вище ізольований поліпептид. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується ізольована молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність (тобто кДНК, нуклеотидну послідовність, що переривається інтронами або не переривається інтронами), яка кодує поліпептид, що містить або складається з ізольованого поліпептиду відповідно до винаходу, який описаний вище. В одному варіанті нуклеотидну послідовність, що кодує ізольований поліпептид відповідно до винаходу, синтезують, використовуючи переважні кодони, що сприяють оптимальній експресії в конкретній клітині-хазяїні. Такі переважні кодони можуть бути оптимальними для експресії в клітинах визначеного виду рослин, бактерій, дріжджів, ссавців, або грибів комах. Винахід також стосується вектора, що містить молекулу нуклеїнової кислоти. Винахід також стосується експресуючого вектора, що містить молекулу нуклеїнової кислоти і щонайменше одну регуляторну ділянку, оперативно зв'язану з молекулою нуклеїнової кислоти. В іншому варіанті винахід стосується клітини, що містить експресуючий вектор. У ще одному варіанті пропонується генетично сконструйована клітина, що містить молекулу нуклеїнової кислоти. В іншому варіанті винахід стосується способу рекомбінантного одержання ізольованого пептиду відповідно до винаходу, що описаний вище, який включає в себе культивування в середовищі клітини-хазяїна, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид відповідно до винаходу, в умовах, що підходять для експресії вказаного пептиду, і витягання і/або виділення експресуючого поліпептиду з вказаного середовища. 3.1 ТЕРМІНОЛОГІЯ У використовуваному в даному описі смислі терміни «близько» або «приблизно» при використанні в поєднанні з числом відносяться до будь-якого числа в межах 1, 5 або 10% від вказаного числа. Термін «вводиться в поєднанні з» у контексті способів відповідно до винаходу означає введення сполуки до, одночасно і/або після початку захворювання, розладу або стану. Розуміється, що термін «амінокислота» або будь-яка вказівка конкретної амінокислоти включають протеогенні амінокислоти, які зустрічаються у природі, а також амінокислоти, що не зустрічаються в природі, такі як аналоги амінокислот. Фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що таке визначення, якщо не обговорено особливо, включає протеогенні (L)-амінокислоти, що зустрічаються в природі, їх оптичні (D)-ізомери, хімічно модифіковані амінокислоти, включаючи аналоги амінокислот, такі як пеніциламін (3-меркапто-D-валін), непротеогенні амінокислоти, які зустрічаються у природі, такі як норлейцин, і хімічно синтезовані білки, що мають властивості, які, як відомо в даній галузі, характерні для амінокислоти. У використовуваному в даному описі змісті амінокислоти будуть позначені або трилітерне скорочення, або однолітерним символом у такий спосіб: аланін = Ala або A, аргінін = Arg або R, аспарагін = Asn або N, аспарагінова кислота = Asp або D, цистеїн = Cys або C, глутамінова кислота = Glu або E, глутамін = Gln або 6 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Q, гліцин = Gly або G, гістидин = His або H, ізолейцин = He або I, лейцин = Leu або L, лізин = Lys або K, метіонін = Met або M, фенілаланін = Phe або F, пролін = Pro або P, серин = Ser або S, треонін = Thr або T, триптофан = Trp або W, тирозин = Tyr або Y, і валін = Val або V. Крім того, термін «еквівалент амінокислоти» стосується сполук, що відрізняються за структурою від амінокислот, що зустрічаються в природі, але які власне кажучи мають структуру амінокислоти, так що ними можна замінити амінокислоту в пептиді, що при цьому зберігає свою біологічну активність, незважаючи на заміну. Таким чином, наприклад, еквіваленти амінокислот можуть включати амінокислоти, що мають модифікації або заміщення бічних ланцюгів, а також включають споріднені органічні кислоти, аміди або тому подібне. Розуміється, що термін «амінокислота» включає еквіваленти амінокислот. Термін «залишки» відноситься як до амінокислот, так і до еквівалентів амінокислот. Амінокислоти також можуть бути віднесені до наступних груп, що загальновідомі в даній галузі: (1) гідрофобні амінокислоти: His, Trp, Tyr, Phe, Met, Leu, Ile, Val, Ala; (2) нейтральні гідрофільні амінокислоти: Cys, Ser, Thr; (3) полярні амінокислоти: Ser, Thr, Asn, Gln; (4) кислі/негативно заряджені амінокислоти: Asp, Glu; (5) заряджені амінокислоти: Asp, Glu, Arg, Lys, His; (6) позитивно заряджені амінокислоти: Arg, Lys, His; і (7) основні амінокислоти: His, Lys, Arg. У використовуваному в даному описі змісті «збуджувана тканина» означає тканину, що містить збуджувані клітини. Збуджувані клітини являють собою клітини, які активно відповідають на електричний стимул і мають електричний заряд, що відрізняється з різних сторін їхніх клітинних мембран. Збуджувані клітини зазвичай здатні піддаватися потенціалу дії. Такі клітини зазвичай експресують канали, такі як потенціалозалежні, лігандозалежні і залежні від натягу канали, що дозволяють проходить іонам (калію, натрію, кальцію, хлориду і т.д.) через мембрану. Збуджувані тканини включають нервову тканину, м'язову тканину і залозисту тканину. До збуджуваних тканин відносяться без обмеження нервові тканини, такі як тканина периферичної нервової системи (вуха і сітківки) і центральної нервової системи (головного і спинного мозку); серцево-судинна тканина, така як клітини серця і пов'язаних нервів; і залозиста тканина, така як тканина підшлункової залози, в якій кальцієві канали T-типу разом із щілиноподібними міжклітинними контактами беруть участь у секреції інсуліну. Ілюстративний список збуджуваних тканин включає органи і тканини, що включають нерви, кістякові м'язи, гладку мускулатуру, серцевий м'яз, матку, центральну нервову систему, спинний мозок, головний мозок, сітківку, нюхову систему, слухову систему і т.д. Термін «клітина-хазяїн» у використовуваному в даному описі змісті стосується конкретної клітини суб'єкта, трансфікованої молекулою нуклеїнової кислоти, і потомства або потенційного потомства такої клітини. Потомство такої клітини може бути не ідентичним батьківській клітині, трансфікованій молекулою нуклеїнової кислоти, унаслідок мутацій або впливу навколишнього середовища, що можуть виникати в наступних поколіннях, або внаслідок інтеграції молекули нуклеїнової кислоти в геном клітини-хазяїна. «Ізольований» або «очищений» поліпептид власне кажучи не містить клітинних речовин або інших забруднюючих білків із клітинного або тканинного джерела, з якого білок або поліпептид одержують, або власне кажучи не містить хімічних попередників або інших хімічних речовин у випадку хімічного синтезу. Формулювання «власне кажучи не містить клітинних речовин» відноситься до препаратів поліпептиду, в яких поліпептид відділений від клітинних компонентів клітин, з яких його виділяють або в яких його рекомбінантно одержують. Таким чином, поліпептид, який власне кажучи не містить клітинних речовин, включає препарати поліпептидів, що мають менше ніж приблизно 30%, 20%, 10% або 5% (сухої маси) гетерологічного білка (також називаного в даному описі «забруднюючим білком»). У тому випадку, коли поліпептид одержують рекомбінантно, він також переважно власне кажучи не містить культурального середовища, тобто культуральне середовище складає менше ніж приблизно 20%, 10% або 5% об’єму препарат білка. У тому випадку, коли поліпептид одержують у результаті хімічного синтезу, він переважно власне кажучи не містить хімічних попередників або інших хімічних речовин, тобто відділений від хімічних попередників або інших хімічних речовин, що були використані в синтезі білка. Відповідно такі препарати поліпептиду мають менше ніж приблизно 30%, 20%, 10%, 5% (сухої маси) хімічних попередників або інших сполук, відмінних від антитіла, що представляє інтерес. У переважному варіанті поліпептиди відповідно до винаходу є ізольованими або очищеними. «Ізольована» молекула нуклеїнової кислоти являє собою молекулу, що відділена від інших молекул нуклеїнової кислоти, що присутні в природному джерелі молекули нуклеїнової кислоти. Крім того, «ізольована» молекула нуклеїнової кислоти, така як молекула кДНК, власне кажучи може не містити інших клітинних речовин або культурального середовища в тому випадку, якщо її одержують рекомбінантними способами, або власне кажучи не містити хімічних попередників 7 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 або інших хімічних речовини у випадку хімічного синтезу. У конкретному варіанті молекула(ли) нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид відповідно до винаходу, є ізольованою або очищеною. У використовуваному в даному описі змісті при вказівці структури в межах поліпептиду термін «мотив» відноситься або до набору амінокислот, що ідуть одна за одною, в амінокислотній послідовності поліпептидного ланцюга і/або до набору лінійно близько розташованих амінокислот у третинній структурі вказаного поліпептиду. Оскільки мотив цілком або частково може бути утворений у результаті фолдінга білка, то амінокислоти, що є сусідніми в описаному мотиві, можуть бути розділені 0, 1 або більше, 5 або більше, 10 або більше, 15 або більше або 20 або більше амінокислотами в лінійній амінокислотній послідовності поліпептиду. У використовуваному в даному описі змісті терміни «пептид», «поліпептид» і «білок» використовують взаємозамінно, і в широкому змісті вони відносяться до обмежених (тобто таких, що мають деякий елемент структури, наприклад, наявність амінокислот, що ініціюють βвиток або β-складчастий шар, або наприклад, циклізованних унаслідок присутності зв'язаних дисульфідним зв'язком залишків Cys) або необмежених (наприклад, лінійних) амінокислотних послідовностей. У деяких варіантах пептид відповідно до винаходу складається менше ніж з 30 амінокислот. Однак при читанні даного описі фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що не довжина конкретного пептиду, а його здатність зв'язувати тканинозахисний рецепторний комплекс і/або конкурувати за зв'язування з пептидом, охарактеризованим у даному описі, є відмітною ознакою пептиду відповідно до винаходу. Терміни «пептид», «поліпептид» і «білок» також відносяться до сполук, що містять еквіваленти або амінокислот інші неамінокислотні групи, але при цьому ще зберігає необхідну функціональну активність пептиду. Еквіваленти пептидів можуть відрізнятися від звичайних пептидів заміною однієї або декількох амінокислот спорідненими органічними кислотами (такими як PABA), амінокислотами або тому подібним або заміною чи модифікацією бічних ланцюгів або функціональних груп. Термін «профілактика захворювання, розладу або стану» стосується затримки початку, затримки прогресування, затримки прояву, захисту, пригнічення або виключення виникнення або зменшення частоти такого захворювання, розладу або стану. Використання терміна «профілактика» не означає, що мається на увазі, що у всіх пацієнтів у популяції пацієнтів, яким проводять профілактичну терапію, ніколи не розів'ється захворювання, розлад або стан, що є метою профілактики, але в популяції пацієнтів буде зменшена частота зустрічання захворювання, розладу або стану. Наприклад, багато вакцин проти грипу не на 100% ефективні для профілактики грипу в пацієнтів, яким уводять вакцину. Фахівець у даній галузі легко може ідентифікувати пацієнтів і ситуації, при яких профілактичне лікування може бути корисним, наприклад, але не обмежуючи вказаним, може ідентифікувати людей, що мають намір здійснювати діяльність, яка може призвести до травми й ушкодження (наприклад, солдати, що беруть участь у воєнних діях, водії гоночних автомобілів і т.д.), пацієнтів, яким запланована операція, пацієнтів, для яких існує ризик появи спадкових хвороб, розладів або станів, пацієнтів, для яких існує ризик виникнення захворювань, розладів або станів, обумовлених факторами навколишнього середовища, або частин популяції, для яких існує ризик розвитку конкретних захворювань, розладів або станів, таких як люди похилого віку, немовлята або люди з послабленою імунною системою, або пацієнти з генетичними або іншими факторами ризику розвитку захворювання, розладу або стану. У використовуваному в даному описі змісті терміни «суб'єкт» і «пацієнт» використовують взаємозамінно. У використовуваному в даному описі змісті, терміни «суб'єкт» і «суб'єкти» відносяться до тварини, переважно ссавця, включаючи тварину, відмінну від приматів (наприклад, корова, свиня, кінь, кішка, собака, щур і миша) і примата (наприклад, мавпа або людина), і більш переважно до людини. У використовуваному в даному описі змісті терміни «захисна відносно тканини активність» або «захист тканини» відносяться до ефекту інгібування або відстрочення ушкодження або загибелі клітини, тканини або органа. Якщо не обговорено особливо, «відстрочення» або ушкодження загибелі клітини, тканини або органа оцінюють у порівнянні з контрольними умовами під час відсутності пептиду відповідно до винаходу. Захисна відносно тканини активність застосовні для різних станів, захворювань і ушкоджень клітини, органа і/або тканини, що, наприклад, описані в розділі 5.3. Захисна відносно тканини активність специфічна для тканини, клітин і/або органів, що експресують тканинозахисний рецепторний комплекс (тобто, для чутливої тканини, клітини і/або органа, відповідно), таких як, без обмеження, тканини центральної нервовий системи. У конкретних варіантах, чутливі клітини не є клітинамипопередниками еритроцитів. 8 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін «тканинозахисний рецепторний комплекс» у використовуваному в даному описі змісті означає комплекс, що містить щонайменше одну субодиницю рецептора еритропоетину і щонайменше одну загальну бета-субодиницю рецептора. Тканинозахисний рецепторний комплекс може містити декілька субодиниць рецептора еритропоетину і/або загальних бетасубодиниць рецептора, а також інші типи рецепторів або білків. Див. WO 2004/096148, що включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі. Щоб визначити відсоток ідентичності двох амінокислотних послідовностей послідовності вирівнюють з метою оптимального порівняння. Потім порівнюють амінокислотні залишки у відповідних положеннях амінокислот. Якщо положення в першій послідовності зайнято таким же амінокислотним залишком, що і відповідне положення в другій послідовності, то молекули ідентичні за даним положенням. Ідентичність у відсотках між двома послідовностями є функцією кількості ідентичних положень у послідовностях (тобто, % ідентичності = кількість ідентичних співпадаючих положень/загальна кількість положень  100%). В одному варіанті дві послідовності мають однакову довжину. В альтернативному варіанті послідовності мають різну довжину, і відповідно ідентичність у відсотках стосується порівняння більш короткої послідовності з частиною більш довгої послідовності, при цьому вказана частина має таку ж довжину, як і вказана більш коротка послідовність. 4. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР На фіг.1 зображені результати, отримані на моделі ушкодження сідничного нерва in vivo при порівнянні ефективності пептиду J (SEQ ID NO:41) із тканинозахисною молекулою карбамілованого EPO (CEPO), при цьому пептид J, SEQ ID NO:41, є химерним пептидом, що складається з амінокислот, розташованих на зовнішній поверхні спіралі B EPO (тобто, пептид G, SEQ ID NO:40), об'єднаних з амфіпатичною спіраллю з панкреатичного поліпептиду (LRRYINMLTRP, SEQ ID NO:28). На фіг.2 зображений тканинозахисний вплив пептидів відповідно до винаходу, що тестували в моделі ушкодження сідничного нерва in vivo. В аналізі ушкоджували правий сідничний нерв у щурів (n=6 на групу) і тварині негайно вводили дози PBS або PBS, що містять рівні молярні концентрації карбамілованого EPO, пептиду A EPO (SEQ ID NO:32, що відповідає амінокислотам 1-23 послідовності SEQ ID NO:1), пептиду D (SEQ ID NO:30, що відповідає амінокислотам 58-82 послідовності SEQ ID NO:1) або пептиду G (SEQ ID NO:40). Пептид G (SEQ ID NO:40) заснований на амінокислотах у межах спіралі B EPO, що направлені в зовнішній бік від глобулярного центра молекули EPO у гідрофобне середовище, тобто знаходяться на поверхні поліпептиду. Крім того, як негативний контроль включали 20-мер, сконструйований з ділянки фактора, отриманого з пігментного епітелію, який, як відомо, є тканинозахисним, діючи за допомогою іншого рецептора. Відновлення після ушкодження протягом наступних 4 діб показує, що пептид G, SEQ ID NO:40, і пептид D, SEQ ID NO:30, чинять тканинозахисну дію в зазначеному аналізі на моделі in vivo, що еквівалентно або краще, ніж дія карбамілованого EPO (CEPO). На фіг.3 зображена еритропоетична дія пептиду D, SEQ ID NO:30, і CEPO, у якого, як відомо відсутня еритропоетична активність, яку тестували в UT-7-аналізі еритропоетичної активності. Результати вказаного аналізу in vitro показують, що ні пептид D, SEQ ID NO:30, ні CEPO не мають еритропоетичну активність в дозах до 10000 пМ. На фіг.4 зображені результати аналізу in vivo для визначення того, чи є пептид F (SEQ ID NO:33, що відповідає амінокислотам 14-29 SEQ ID NO:1) і пептид G (SEQ ID NO:40) еритропоетичними і або не викликають нейтралізацію антитіл проти EPO. Результати показують, що жоден з білків не підвищує рівні гемоглобіну в щурів при введенні в дозі 0,8 мкг/кг 3 дні/тиждень підшкірно (п/ш) протягом курсу тривалістю 130 днів. Крім того, жоден з пептидів не викликав гуморальної відповіді, на відміну від введення EPO. На фіг.5 зображені результати досліджень in vitro, що показують, що пептид D, SEQ ID NO:30, захищає мотонейрони від індукованої каїнатом загибелі. На фіг.6 показано, що пептид D, SEQ ID NO:30, у дозах 0,1 нг/мл і 1 нг/мл захищає клітини P19 від апоптозу, пов'язаного з позбавленням клітин сироватки. На фіг.7A-B зображені результати аналізу оклюзії середньої мозкової артерії у щурів. На фіг.7A зображений графік, який показує, що пептид D (SEQ ID NO:30, що відповідає амінокислотам 58-82 послідовності SEQ ID NO:1) в однократній дозі 4,4 мкг/кг здатний зменшувати обсяг інфаркту головного мозку так само ефективно, як чотири дози 4,4 мкг/кг, що вводяться з 2-годинними інтервалами. На фіг.7B зображені результати аналізу «промахів» стопи, щоб визначити розлад поведінки, викликаний оклюзією середньою мозковою артерією. На фіг.7B показано, що щури демонстрували покращення поведінки при введенні пептиду D, 9 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO:30, як при схемі з використанням одноразової дози (14,4 мкг/кг), так і схемі з багаторазовими дозами (44,4 мкг/кг). На фіг.8A-B зображені результати аналізу in vivo діабетичної невропатії. Діабет індукують у щурів, використовуючи стрептозотоцин. Після підтвердження індукованого діабету, щурів лікували пептидом D, SEQ ID NO:30, або PBS п'ять разів на тиждень у дозі 4 мкг/кг маси тіла в/ч протягом двох тижнів. Реєстрували швидкість провідності нерва і затримку між стимулом і реакцією на гарячу пластинку у щурів. На фіг.8 показано, що у щурів, оброблених пептидом D, SEQ ID NO:30, спостерігаються підвищені швидкості провідності в порівнянні з неопрацьованими щурами. На фіг.8B показано, що затримка між стимулом і реакцією на гарячу пластинку в оброблених щурів була зменшена в порівнянні з неопрацьованими щурами, що додатково свідчить про підвищення швидкості провідності. На фіг.9A-B зображені результати лікування індукованої цисплатином невропатії химерою спіралі B EPO. На фіг.9A показано, що у тварин, оброблених пептидом G (SEQ ID NO:40, химера спіралі B) спостерігаються поліпшені результати при тестуванні в аналізі затримки між сигналом і реакцією на гарячу пластинку. На фіг.9B показано, що сечовиділення, яке є мірою ниркової функції, зберігалося на рівні норми у тварин, оброблених пептидом G (SEQ ID NO:40). На фіг.10 зображений вплив пептиду D (SEQ ID NO:30) на «просочування» у сітківці, пов'язане з діабетичною ретинопатією. На фігурі показано, що пептид D (SEQ ID NO:30) здатний значно знижувати просочування в сітківці у оброблених тварин. На фіг.11 зображені результати, отримані при використанні пептиду F (SEQ ID NO:33) або пептиду G (SEQ ID NO:40) у моделі ішемії-реперфузії нирок. На фігурі показано, що обидва пептиди зменшували оцінку в балах ушкодження, що виникає в результаті 60-хвилинної ішеміїреперфузійного ушкодження, що визначається через 72 години. На фіг.12 показано, що введення пептиду F (SEQ ID NO:33) захищає мишей від експериментальної церебральної малярії. Фіг.13. Клінічний показник у мишачій моделі EAE після обробки пептидом E, SEQ ID NO:31. На фіг.13 зображене клінічне протікання неврологічної функції у мишей з експериментальним автоімунним енцефаломієлітом. 4,4 мкг/кг пептиду E вводили в/ч щодня. Введення пептиду E значущо поліпшувало неврологічну функцію у порівнянні з контролем. Клінічні стадії; 1 – пониклий хвіст; 2 - атаксія і/або параліч задніх кінцівок або повільний рефлекс випрямлення; 3 – параліч задніх кінцівок і/або параліч передніх кінцівок; 4 – парез передніх кінцівок; 5 –агонія або загибель. 5. Докладний опис винаходу 5.1 Тканинозахисні пептиди Еритропоетична активність еритропоетину («EPO») добре охарактеризована в даній ділянці (див., наприклад, Cheetham et al., 1998, Nat. Struct. Biol. 5: 861-866, публікація включена у вигляді посилання в повному обсязі). EPO ініціює еритропоез за допомогою зв'язування з позаклітинною частиною попередньо утвореного гомодимеру рецептора еритропоетину (EPOR) (тобто, (EPOR)2) таким чином, що він утворює місток між специфічними положеннями на окремих субодиницях EPOR. Коли EPO зв'язується з (EPOR) 2, великі частини глобулярного ліганду віддаляються від ділянок зв'язування і повертаються назовні, в бік від комплексу EPO і (EPOR)2 у водне середовище. Автори винаходу визначили, що захист тканини, на відміну від еритропоезу, опосередкований іншим рецептором, який відрізняється від (EPOR)2, що складається з мономера EPOR, зв'язаного з іншим рецептором, CD131 (також відомим як загальна β-субодиниця рецепторів (βc)). EPOR і βc взаємодіють з утворенням рецепторного гетеродимеру, EPOR-βc. В даний час не відомо, чи задіяні інші білки в вказану взаємодію. Даний винахід стосується тканинозахисних пептидів, отриманих із тривимірної структури EPO, і, зокрема, з частин EPO, напрямлених в бік від ділянок зв'язування EPOR, тобто таких, що не взаємодіють із класичним еритропоетичним гомодимером EPOR (EPOR)2. Не маючи наміру бути зв'язаними з будь-якою конкретною теорією, автори винаходу вважають, що вказана частина молекули EPO взаємодіє з тканинозахисних рецептором і, тим самим, опосередковує захист тканини. Загальноприйнята тривимірна структура EPO, що описана в Cheetham et al., 1998, Nat. Struct. Biol. 5: 861-866, включеній в даної описі у вигляді посилання в повному обсязі, і вказана у вигляді послідовності SEQ ID NO:1 (також доступна у вигляді даних, депонованих у банку даних про білки National Center for Biotechnology Information, доступ «IBUY»). Частини молекули EPO, що направлені в бік від проксимальної відносно мембрани частини гомодимеру EPOR при зв'язуванні з вказаним рецептором (тобто в бік від клітинної мембрани, коли гомодимер (EPOR)2 експресований на поверхні клітини) складаються з наступних вторинних структур: петля AB (що відповідає амінокислотам 29-55 послідовності SEQ ID NO:1), спіраль B (що відповідає 10 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотам 56-82 послідовності SEQ ID NO:1), петля BC (що відповідає амінокислотам 83-92 послідовності SEQ ID NO:1) і петля CD (що відповідає амінокислотам 112-138 послідовності SEQ ID NO:1). В одному варіанті здійснення винаходу тканинозахисні пептиди складаються з амінокислотних послідовностей, що відповідають послідовностям різних структур молекули EPO. Не маючи наміру бути зв'язаними з будь-якою теорією, автори винаходу вважають, що тканинозахисний рецептор утворюється заздалегідь, тобто, що білкові субодиниці EPOR і β c функціонально зв'язуються до їхньої взаємодії з EPO. EPO є членом надсімейства цитокінів типу I. Члени галузі надсімейства цитокінів типу 1 характеризуються наявністю чотирьох спіралей, що гідрофобно взаємодіють, утворюючи глобулярний білок, зовнішня поверхня якого взаємодіє з водним середовищем, і її називають «напрямленою назовні». Неочікувано автори винаходу виявили, що не один, а декілька пептидів, отриманих зі напрямленої назовні частини молекули EPO, є тканинозахисними. Наступне несподіване відкриття полягає в тому, що пептиди, отримані з частин молекули EPO, які занурені в комплекс EPO:(EPOR) 2, і пептиди, що також можуть містити частини ділянок 1 або 2 зв'язування при ериптропоезі, також є високоефективними в захисті тканини. Щоб пояснити вказані відкриття автори винаходу припустили, що успішна активація тканинозахисного рецептора обумовлена придатною просторово компактною конфігурацією зарядів у пептидному ліганді. Крім того, така компактна конфігурація зарядів формується двома різними структурними мотивами: (1) двома негативно зарядженими амінокислотами, розташованими поруч одна з одною і фланкованими гідрофобними амінокислотами; або (2) позитивно і негативно зарядженими (тобто, основний і кислотний) амінокислотами, розташованими безпосередньо поруч одна з одною і фланкованими одним гідрофобним або полярним амінокислотними залишками. Близькість таких зарядів може виникати завдяки лінійній структурі, обумовленій утворенням пептидних зв'язків, тобто структура може бути утворена амінокислотами, що йдуть одна за одному, в поліпептидному ланцюзі, або альтернативно близькість також може виникати в результаті просторового взаємозв'язку між різними частинами молекули EPO (або інших молекул, споріднених цитокіну типу 1), обумовленої третинною структурою білка, тобто, тривимірною структурою. Не маючи наміру бути пов'язаними з будь-якою конкретною теорією, автори винаходу вважають, що, загалом, така вимога припускає, що тканинозахисний пептид буде мати визначену третинну структуру (наприклад, спіралі або складчасті шари), що забезпечує необхідну просторову локалізацію пари заряджених амінокислот (тобто двох негативно заряджених амінокислот і/або позитивно і негативно заряджених амінокислот). Простим виключенням є лінійний пептид, в якому амінокислоти в парі розташовані безпосередньо поруч одна з одною, яка має необхідну твердість, що надається пептидним кістяком. Відповідно, структурний мотив (1) підпадає під лінійну послідовність амінокислотних залишків, наприклад, H1-N1-N1-H2 (SEQ ID NO:6), або лінійну послідовність амінокислотних залишків, в якій N 1 і N2 розділені 1, 2, 3, 4, 5, 6 або більше проміжними залишками, наприклад, H 1-N1-X-X-X-X-X-N1-H2 (SEQ ID NO:11). Для захисту тканини пари заряджених амінокислот повинна бути просторово орієнтована так, щоб карбонільні атоми вуглецю знаходилися на відстані одна від одної приблизно від 3 ангстрем (Ǻ) до 5 Ǻ, переважно приблизно від 4 Ǻ до 5 Ǻ одна від одної і більш переважно приблизно від 4,4 Ǻ до 4,8 Ǻ одна від одної. Це може бути досягнуто декількома шляхами, наприклад, за рахунок сусідніх заряджених амінокислот у простому лінійному пептиді (див., наприклад, приклад 2 і пептид G, SEQ ID NO:40, у таблиці 1) або у випадку пептидів, що можуть утворювати альфа-спіраль, за рахунок заряджених амінокислот, розділених проміжним амінокислотним залишком (див., наприклад, приклад 2 і пептид F, SEQ ID NO:33, у таблиці 1). Необхідно відзначити, що третинна структура (наприклад, альфа-спіраль в амфіпатичних пептидах) також може бути утворена в тому випадку, коли пептид знаходиться в специфічному мікрооточенні, такому як на межі розподілу позаклітинного простору і мембрани клітинної поверхні (див., Segrest, 1990, Proteins 8:103-117, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Крім того, захисна відносно тканини активність прогнозується для пептидів, що містять пари заряджених амінокислот, так, що заряджені бічні ланцюги (або позитивно і негативно заряджені, або дві негативно заряджені) знаходяться в просторі в обмежених межах приблизно від 6,5 Ǻ до 9 Ǻ один від одного. Це може бути в умовах альфа-спіралі завдяки тому, що заряджені члени пари розділені однією або двома амінокислотами, що забезпечить перебування зарядів більшменш на одній і тій же стороні спіралі на необхідній відстані, що розділяє їх, приблизно від 6,5 Ǻ до 9 Ǻ. Не обмежуючим прикладом такого пептиду є пептид F (див. приклад 2, SEQ ID NO:33 у таблиці 1). Фахівець у даній галузі може визначити третинну структуру пептиду, що, загалом, 11 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 потрібно для одержання придатного тривимірного положення заряджених амінокислот, а також конструкцію невеликих молекул для імітації поділу зарядів у пептиді. Відстані в просторі між карбонільними атомами вуглецю будь-яких двох амінокислот або між бічними ланцюгами будь-яких двох амінокислот можна розрахувати будь-яким способом, відомим у даній галузі або описаним у даній публікації. Наприклад, коли відома тривимірна структура білка, поділ зарядів двох бічних ланцюгів або відстань у просторі між двома карбонільними атомами вуглецю в частині вказаного білка, що представляє інтерес, можуть бути розраховані на підставі опублікованих або інакше прийнятих у даній галузі тривимірних координат амінокислотних залишків у вказаній частині, що представляє інтерес. У тому випадку, коли тривимірна структура білка, і тому частини, що представляє інтерес, невідома, або коли конструюють цілком синтетичний пептид на основі наведеного в даному описі керівництва, тривимірна структура якого невідома, поділ зарядів двох бічних ланцюгів або відстань у просторі між двома карбонільними атомам вуглецю в зазначеному пептиді можна оцінити з використанням тривимірної структури, розрахованої за допомогою комп'ютерної програми моделювання білків, що відома в даній галузі. Не обмежуючими прикладами такої комп'ютерної TM програми є MOE , Chemical Computing Group (Quebec, Canada) і Modeler by Accelrys (San Diego, California). Подібним чином у даній галузі також відома комп'ютерна програма для прогнозування, також доступна від вказаних вище компаній, для конструювання малих молекул, і відповідно фахівець у даній галузі на підставі наведених у даному описі інструкцій міг би одержати невеликі молекули, що імітують описані структурні мотиви. Можуть бути сконструйовані такі, що зустрічаються у природі, або химерні пептиди, які імітують необхідну просторову близькість, описану вище, за допомогою лінійної послідовності амінокислот. Тому даний винахід стосується нових тканинозахисних пептидів, включаючи пептиди, що мають вказані структурні мотиви, які приводять у дію захист тканини. Даний винахід також стосується застосування тканинозахисних фрагментів інших цитокінів типу 1, включаючи без обмеження, колонієстимулюючий фактор гранулоцитів і макрофагів (GMCSF), інтерлейкін-3 (IL-3), тромбопоетин (TPO), циліарний нейротрофічний фактор (CNTF) і інгібувальний лейкоз фактор (LIF), що структурно гомологічні вказаним вище напрямленим назовні амінокислотним послідовностям EPO і/або містять описані вище структурні мотиви. Крім того, тканинозахисні пептиди можуть являти собою химерні сполуки, засновані на структурних мотивах, описаних вище, що поєднують структурні елементи, які не є сусідніми, і тільки амінокислоти, представлені на поверхні. Зокрема, автори винаходу визначили, що додавання амфіпатичної пептидної спіралі до вказаних вище послідовностей збільшує ефективність пептиду. Крім того, тканинозахисні пептиди згідно із даним винаходом включають злиті пептиди, утворені в результаті об'єднання двох або більше вказаних вище пептидів, або об'єднання зі спорідненою або неспорідненою макромолекулою для специфічного транспорту, такий як нативний EPO, або інсулін лептин. 5.1.1 Фрагменти A. Отримані з EPO пептидні фрагменти Даний винахід стосується нових тканинозахисних пептидів, які в одному варіанті складаються з фрагментів амінокислотних послідовностей EPO, отриманих на підставі тривимірної структури білка EPO, і зокрема, отримані з таких ділянок EPO, які направлені в бік від ділянок зв'язування ліганду і/або внутрішньої частини гомодимеру EPOR. Вказані фрагменти одержують з наступних структур EPO: (1) петля AB і N-кінцева частина спіралі B (NITVPDTKVNFYAWKRMEVG, SEQ ID NO:29, що відповідає амінокислотам 38-57 послідовності SEQ ID NO:1); (2) C-кінцева частина спіралі B (QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV, SEQ ID NO:30, що відповідає амінокислотам 58-82 послідовності SEQ ID NO:1), і (3) частина петлі A-B, що складається з невеликої цистеїнової петлі і β-складчастого шару (GCAEHCSLNENITVPDTKVN, SEQ ID NO:31, що відповідає амінокислотам 28-47 послідовності SEQ ID NO:1). Усі вказані пептидні фрагменти, як описано в прикладі 2 (див. фіг.1 і таблицю 1), мають тканинозахисні властивості. Несподівано деякі пептиди, отримані з інших ділянок молекули EPO, які сховані, і інші пептиди, що містять частини ділянок зв'язування з (EPOR) 2, також є тканинозахисними. Наприклад, пептид, що складається з N-кінцевої частини спіралі A (APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE, SEQ ID NO:32, що відповідає амінокислотам 1-23 послідовності SEQ ID NO:1), яка містить частину ділянки 2 зв'язуванні EPOR (підкреслена), є тканинозахисним (див. приклад 2 і таблицю 1). Однак присутність амінокислот ділянки 2 не пояснює захисної відносно тканини активності, тому що пептид, який складається з амінокислот 14-19 послідовності SEQ ID NO:1 (RYLLEAKEAENITTGC, SEQ ID NO:33) і послідовності SEQ ID 12 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NO:1, що не містить амінокислот 11-13 послідовності (тобто, VLE; амінокислоти ділянки 2, які необхідні для зв'язування EPO з димером EPOR, (EPOR)2), також є тканинозахисним (див. приклад 2 і таблицю 1, також Elliott et al., 1997, Blood 89: 493, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Автори винаходу раніше показали, що мутації в ділянках зв'язування при еритропоезі, що анулюють еритропоез, не модифікують тканинозахисні властивості EPO (Leist et al. Science (2004) 305: 239, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що тканинозахисний пептид можуть утворювати фрагменти різної довжини, хоча переважно фрагмент має довжину менше 30 амінокислот. Крім того, ретельний відбір інших молекул для включення, наприклад, або D-амінокислот поліетиленгліколю, також дозволить одержати тканинозахисні пептиди, але зі збільшеним біологічним часом напівжиття. A. Структурні мотиви Зокрема були ідентифіковані наступні структурні мотиви, що пускають у хід тканинозахисний рецепторний комплекс: (a) Конфігурація негативних зарядів («структурний мотив A») У даному структурному мотиві пептид має дві негативно заряджені амінокислоти, що можуть бути розділені 5 амінокислотами, фланковані гідрофобними амінокислотами. Структурно мотив можна представити у вигляді: (a1) HNNH; (a2) HNXNH; (a3) HNXXNH; (a4) HNXXXNH; (a5) HNXXXXNH; або (a6) HNXXXXXNH, де H означає гідрофобні амінокислоти (наприклад, помірковано гідрофобні амінокислоти: гліцин, пролін, цистеїн, тирозин і триптофан, і переважно високо гідрофобні амінокислоти: аланін, валін, ізолейцин, метіонін, лейцин, фенілаланін), N означає негативно заряджені амінокислоти, такі як глутамат або аспартат, і X означає будь-яку амінокислоту, хоча переважно гідрофільну амінокислоту. У деяких варіантах фланкуючі гідрофобні амінокислоти є однаковими. В інших варіантах фланкуючі амінокислоти є різними. Варіант вказаного структурного мотиву включає пептид, в якому одна з фланкуючих гідрофобних амінокислот була замінена полярною амінокислотою, такою як серин, треонін, аспарагін або глутамін. Як альтернатива пептидним зв'язкам, що створюють взаємну близькість двох негативних зарядів у лінійній послідовності, необхідна близькість зарядів також може бути створена завдяки тривимірній структурі, що обговорюється вище (розділ 5.1). Наприклад, негативно заряджені амінокислоти можуть безпосередньо сусідніми в просторі на зовнішній поверхні спіралі, але будуть розділені додатковими амінокислотами в лінійній послідовності пептиду. Наприклад, у спіралі A EPO (що відповідає амінокислотам 10-28 у послідовності SEQ ID NO:1), E18 і E21 знаходяться поруч у тривимірній структурі, але між ними є дві проміжні амінокислоти в лінійній пептидній послідовності. Як додатковий приклад у спіралі B (пептид D, SEQ ID NO:30; що відповідає амінокислотам 58-82 послідовності SEQ ID NO:1) E62 і E72 розділені двома амінокислотами (Q65 і L69) на поверхні спіралі, але між ними є 9 амінокислот у лінійному пептиді. Пептиди, сконструйовані зі спіралі A або спіралі B, є тканинозахисними (див. приклад 2 і таблицю 1 нижче). На відміну від цього, пептид B (NITTGCAEHCSLNE, SEQ ID NO:34), пептид зі здвоєними негативними зарядами (підкреслені) на відповідній відстані, але такий, що не має фланкуючих гідрофобних амінокислот, не є тканинозахисним (див. приклад 2 і таблицю 1 нижче). (b) Конфігурація негативної/позитивної амінокислот («структурний мотив B») У даному структурному мотиві пептид має позитивно заряджену амінокислоту поблизу негативно зарядженої амінокислоти, і обидві заряджені амінокислоти фланковані однією і тією ж гідрофобною амінокислотою. Структурно мотив можна представити у вигляді: (b1) HNPH; або (b2) HPNH, де P означає позитивно заряджену амінокислоту, таку як аргінін, лізин або гістидин, і N означає негативно заряджену амінокислоту - глутамат або аспартат. Як і в першому мотиві, взаємна близькість двох протилежних зарядів може бути утворена завдяки тривимірній структурі. Наприклад, позитивно і негативно заряджені амінокислоти можуть бути просторово близькі на поверхні спіралі, але будуть розділені однією або декількома амінокислотами в 13 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лінійній пептидній послідовності. Наприклад, у спіралі B (що відповідає амінокислотам 58-82 у послідовності SEQ ID NO:1) E72 і R76 безпосередньо сусідні одна з одною на зовнішній поверхні спіралі, і пептид, сконструйований з такої спіралі, є тканинозахисним (див. приклад 2 і таблицю 1). У варіанті такого конкретного мотиву негативно і позитивно заряджені амінокислоти можуть бути розділені полярною амінокислотою, наприклад, (b3) HNLPH; (b4) HPLNH, де L означає полярну амінокислоту, таку як серин, треонін, аспарагін або глутамін. Прикладом такого мотиву є пептид E (GCAEHCSLNENITVPDTKVN, SEQ ID NO:34), що є тканинозахисним (див. приклад 2 і таблицю 1). З огляду на те, що ядро вказаного вище структурного мотиву має довжину, яка дорівнює чотирьом амінокислотам, пептид з ядром у вигляді такого структурного мотиву може пускати в хід тканинозахисний рецептор. У деяких варіантах поліпептиди відповідно до винаходу містять 1 структурний мотив. В альтернативних варіантах поліпептиди відповідно до винаходу містять більше 1, більше 2, більше 3 або більше 4 структурних мотивів. У деяких варіантах, в яких поліпептид містить щонайменше два структурних мотиви, мотиви є однаковими. В альтернативних варіантах, в яких поліпептид містить щонайменше два структурних мотиви, мотиви є різними. Переважно множина пептидів згідно із даним винаходом, які фахівець у даній галузі може створити, має довжину менше 30 амінокислот. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що вказані вище структурні мотиви, на противагу реальній амінокислотній послідовності EPO, є важливими для даного винаходу. Таким чином, фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що ізольований пептид може мати менше ніж 90%, менше ніж 85%, менше ніж 80%, менше ніж 75%, менше ніж 70%, менше ніж 65%, менше ніж 60%, менше ніж 55%, менше ніж 50%, менше ніж 45%, менше ніж 40%, менше ніж 35%, менше ніж 30% або менше ніж 20-процентну ідентичність послідовності з будь-якою частиною амінокислотної послідовності зрілого еритропоетину («EPO») людини, вказаної в SEQ ID NO:1, при цьому вказана частина EPO містить таку ж кількість амінокислотних залишків, що і вказаний пептид. Крім того, у патенті США No. 5700909, O'Brien et al. (який включений у даний опис у вигляді посилання в повному обсязі) описана 17-амінокислотна пептидна послідовність EPO (SEQ ID NO:11, O'Brien), що індукує біологічну активність у клітинах NS20Y, SK-N-MC і PC12, включаючи проростання, диференціювання, нейрозахист і запобігання загибелі нейронів. Послідовність SEQ ID NO:11 згідно з O'Brien (названа епопептидом AB), хоча і заявлена як послідовність, що приблизно має еритропоетичну активність, у дійсності не має таку еритропоетичну активність, і, як було виявлено пізніше, не має активність in vivo. Коли епопептид AB ін’єктували в м'яз мишей, частота проростання кінцевої пластинки рухового нерва в розташовані поруч м'язи зростала подібно до того, як це відбувається при індукції циліарним нейротрофічним фактором. Отримані дані з'ясовні в межах уявлення про те, що нейронні (але не гематологічні) клітини відповідають на пептидну послідовність у межах EPO, і що EPO може мати окремі домени для нейротрофічної і гематотрофічної активності (Campana et al., Int. J. Mol. Med. (1998) 1(1): 235241; J. S. О’Вrіеn у патенті США No. 5700909, виданому 23 грудня 1997; J. S. О’Вrіеn у патенті США No. 5571787, виданому 5 листопада 1996; J. S. О’Вrіеn у патенті США No. 5714459, виданому 3 лютого 1998; і J. S. О’Вrіеn and Y. Kashimoto у патенті США No. 5696080, виданому 9 грудня 1997). Однак O'Brien не розглядав структурні мотиви, пропоновані в даному винаході, засновані на близькості заряджених амінокислот у третинній структурі пептиду. C. Фрагменти цитокіну типу 1 З огляду на просторово компактну конфігурацію зарядів, здатну активувати тканинозахисний рецептор, автори винаходу знайшли, що деякі фрагменти цитокінів типу 1 приблизно перехресно взаємодіють із тканинозахисним рецептором. Таке сімейство цитокінів включає без обмеження інтерлейкін (IL)-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, колонієстимулюючий фактор гранулоцитів і макрофагів (GM-CSF), лептин, колонієстимулюючий фактор гранулоцитів (G-CSF), інгібуючий лейкоз фактор (LIF), циліарний нейротрофічний фактор (CNTF), тромбопоетин (TPO), гормон росту, колонієстимулюючий фактор макрофагів (M-CSF), еритропоетин (EPO) і пролактин. Розгляд вторинної структури EPO є керівництвом для одержання кандидата тканинозахисних пептидів за допомогою просторового розташування амінокислот, отриманих на основі гомологічних амінокислот, локалізованих у гомологічних вторинних структурах в інших лігандах рецепторів цитокінів типу 1: наприклад, було показано, що серед інших GM-CSF і IL-3 (Kannan, 2000, Neuroimmunomod. 8: 132-141, публікація включена в даний опис у вигляді 14 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 посилання в повному обсязі) мають високі нейротрофічні і нейрозахисні активності, в основному, як вважають автори винаходу, внаслідок стимуляції тканинозахисного рецептора. Наприклад, при розгляді спіралі B цитокінів типу I видно: гомологічні амінокислоти в тромбопоетині (TPO; Protein Data Bank (PDB), доступ 1V7M) включають D62, G65, T68, L69, E72, A76 і Q80, при цьому вказані амінокислоти знаходяться в просторі поруч одна з одною у лінійному розташуванні; гомологічні амінокислоти в інгібуючому лейкоз факторі (LIF; PDB, доступ 1EMR) включають E61, R64, Y68, S72, N75 і D79; гомологічні амінокислоти в циліарному нейротрофічному факторі (CNTF; PDB, доступ 1CNT) включають E71, E75. Усі приклади є прикладами мотиву A, описаного вище (розділ 5.1.1), де підкреслені амінокислоти є негативно зарядженими. Приклади пептидів, отриманих з цитокінів типу 1, що являють приклад структурного мотиву B, охарактеризованого в даному описі вище (роздягнув 5.1.1), включають без обмеження фрагмент A-спіралі GM-CSF, WEHVNAIQEARRLL (SEQ ID NO:35); фрагмент A-спіралі TPO, LSKLLRDSHVLH (SEQ ID NO:36); фрагмент B-спіралі TPO: E56, K59; фрагмент A-спіралі CNTF, KIRSDLTALTESYVKH (SEQ ID NO:37); фрагмент B-спіралі CNTF: R89, E92, фрагмент B-спіралі LIF, GTEKAKLVELYRIVVYL (SEQ ID NO:38); і фрагмент A-спіралі інтерлейкіну 3 (IL-3) SIMIDEIIHHLKRPPNPL (SEQ ID NO:39). Вказані вище амінокислоти є тілько прикладами з декількох членів надсімейства цитокінів, що передають сигнал через рецептори цитокінів типу 1, і фахівець у даній галузі легко зможе ідентифікувати гомологічні ділянки в інших членах надсімейства цитокінів. 5.1.2 Химери «Химерні» тканинозахисні пептиди - лінійні амінокислотні послідовності, що містять нелінійні структурні елементи напрямлених назовні амінокислот молекули EPO і мають вказані вище структурні мотиви, - також входять в обсяг даного винаходу. Химерні тканинозахисні пептиди згідно із даним винаходом можуть складатися з об'єднаних в одному пептиді структурних елементів окремих амінокислотних послідовностей. Іншими словами химерний тканинозахисний пептид може складатися з амінокислотних послідовностей, отриманих з нелінійних, але розташованих поруч структурних елементів, таких як фрагмент, отриманий з амінокислотних послідовностей 110-115, 133-136 і 160-165 послідовності SEQ ID NO:1, що може забезпечити можливість контактування структурних елементів C-кінцевої частини спіралі C і N-кінцевої частини петлі C-D, β-складчастого шару в петлі C-D і C-кінцевої частини EPO в одному пептиді. Крім того, химерні тканинозахисні пептиди можуть бути використані для добору важливих характерних ознак конкретної структури, наприклад, напрямлених назовні амінокислот конкретної третинної структури. Таким чином, химерний тканинозахисний пептид може складатися з фрагмента, що складається з амінокислот спіралі B 58, 62, 65, 69, 72, 76, 79, 80, 83, 84 і 85 (наприклад, пептид G, QEQLERALNSS, SEQ ID NO:40) або, іншими словами, із усіх представлених із зовнішньої сторони амінокислот спіралі B EPO. Даний пептид є тканинозахисним, як показано в прикладі 2 нижче (див. таблицю 1). Крім того, ефективність тканинозахисних пептидів відповідно до винаходу може бути збільшена за допомогою зв'язування амфіпатичної пептидної спіралі. Амфіпатичні пептидні спіралі добре відомі в даній галузі, наприклад спіралі з пептидів, що передають сигнал через спряжені з G-білком рецептори класу B (наприклад, Segrest et al., 1990, Proteins 8: 103, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі), які служать для локалізації пептидного ліганду на клітинній мембрані. Приклади таких спіралей включають без обмеження високо гідрофобні ділянки з: кальцитоніну(ALSILVLLQAGS, SEQ ID NO:48); кортиколіберину (VALLPCPPCRA, SEQ ID NO:49); бета-ендорфіну (NAIIKNAYKKG, SEQ ID NO:50); глюкагону (GSWQRSLQDTE, SEQ ID NO:51); секретину (GGSAARPAPP, SEQ ID NO:52); вазоінтестинального поліпептиду (NALAENDTPYY, SEQ ID NO:53); нейропептиду Y (GALAEAYPSKP, SEQ ID NO:54); гонадоліберину (GCSSQHWSYGL, SEQ ID NO:55); паратиреоїдного гормону (VMIVMLAICFL, SEQ ID NO:56); панкреатичного поліпептиду (LRRYINMLTRP, SEQ ID NO:28); і пептиду, асоційованого з геном кальцитоніну (LALSILVLYQA, SEQ ID NO:57) (описаного в Grace et al., 2004, PNAS 101: 12836, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Наприклад, химерний пептид, отриманий з пептиду з поверхневим мотивом зарядів спіралі B EPO (QEQLERALNSS, SEQ ID NO:40), зв'язаним на карбоксильному кінці з амфіпатичною спіраллю панкреатичного поліпептиду (LRRYINMLTRP, SEQ ID NO:28) для одержання химерного пептиду. Можуть бути здійснені додаткові модифікації на карбоксильному кінці амфіпатичної спіралі, що не впливають на тканинозахисні властивості. Таким чином, у наступному прикладі заміна кінцевого проліну вказаного вище химерного пептиду послідовністю TR (QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR, SEQ ID NO:41) створює молекулу, що має високу тканинозахисну активність, що показана в аналізі сідничного нерва (див. фіг.1). 15 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, замість вказаних вище спіралей із тканинозахисними пептидами можуть бути зв'язані інші третинні структури. Наприклад, представлені з зовнішньої сторони амінокислоти спіралі B можуть бути зв'язані з бета-складчастим шаром (CSLNENI, SEQ ID NO:42), виявленим у AB-петлі EPO, з утворенням химерного пептиду, який має послідовність CSLNENIQEQLERALNSS (SEQ ID NO:43), що є тканинозахисним (див. приклад 2 і таблицю 1). Крім того, зовнішні амінокислоти кінцевої частини спіралі C (ALGKA, SEQ ID NO:44, що відповідають амінокислотам 111, 112, 113, 116 і 118 послідовності SEQ ID NO:1) можуть бути об'єднані у всій або з частиною неповної петлі CD (LGAQKEAISPPDAASAAPLRTI, SEQ ID NO:45, що відповідає амінокислотам 112-133 послідовності SEQ ID NO:1). Переважно між злитими пептидами буде присутнє зв’язувальне плече, щоб забезпечити гнучкість, так щоб зв'язані пептиди могли прийняти належну структурну орієнтацію, щоб зв'язатися з тканинозахисним рецепторним комплексом. Такі злиті пептиди можуть мати синергетичну дію, спільно надаючи більший тканинозахисний ефект, ніж при їх дії по окремості, ймовірно завдяки посиленому зв'язуванню з тканинозахисним рецепторним або комплексом збільшеним біологічним часом напівжиття. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміла користь об'єднання різних необхідних структурних елементів в одному пептиді для максимізації тканинозахисних ефектів таких сполук. Такі химери можуть містити пептиди, які складаються з амінокислот, і неамінокислотні елементи, такі як лінкери або атоми чи залишки, що утворюють місточки. 5.1.3 Злиті пептиди Даний винахід додатково припускає, що два або більше із вказаних вище тканинозахисних пептидів, отриманих фрагментів або химер, можуть бути зв'язані зі спорідненим або неспорідненим білком, таким як еритропоетин, альбумін і т.д. 5.1.4 Виробництво тканинозахисних пептидів Тканинозахисні пептиди згідно із даним винаходом можуть бути отримані з використанням способів або рекомбінації синтезу, добре відомих у даній галузі. Зокрема, твердофазний синтез білків добре підходить для відносно коротких тканинозахисних пептидів і може давати більш високі виходи з більш постійними результатами. Крім того, твердофазний синтез білків може забезпечувати додаткову гнучкість виробництва тканинозахисних пептидів. Наприклад, необхідні хімічні модифікації можуть бути введені в тканинозахисний пептид на стадії синтезу: у синтезі можна використовувати гомоцитрулін замість лізину, тим самим усуваючи необхідність карбамілувати пептид після синтезу. Синтез При твердофазному синтезі пептиду амінокислоти з захистом α-аміногрупи і захистом бічного ланцюга імобілізують на смолі. Див., наприклад, Nilsson, B., Soellner, M., and Raines, R. Chemical Synthesis of Proteins, Annu. Rev. Biomol Struct. 2005. 34: 91-118; Meldal M. 1997. Properties of solid supports. Methods Enzymol. 289: 83-104 і Songster MF, Barany G. 1997. Handles for solid-phase synthesis. Methods Enzymol. 289: 126-74. Зазвичай використовують два типи захисних груп α-аміногрупи: чутливу до кислот трет-бутоксикарбонільну (Boc) або групу чутливу до основ 9-флуоренілметилоксикарбонільну (Fmoc) групу. Wellings DA, Atherton E. 1997. Standard Fmoc protocols. Methods Enzymol. 289: 44-67. Після швидкого і повного видалення вказаних захисних груп α-аміногрупи інші захищені амінокислоти з активованою карбоксильною групою можуть бути зв'язані з незахищеним зв'язаним зі смолою аміном. Використання надлишку активованих розчинних амінокислот призводить до повного завершення реакцій зв'язування. Цикл видалення захисту і зв'язування повторюють до одержання повної послідовності. Після видалення захисту бічних ланцюгів і відщеплення від смоли одержують необхідний пептид. Guy CA, Fields GB. 1997. Trifluoroacetic acid cleavage and deprotection of resin-bound peptides following synthesis by Fmoc chemistry. Methods Enzymol. 289: 67-83, і Stewart JM. 1997. Cleavage methods following Boc-based solid-phase synthesis. Methods Enzymol. 289: 2944. Додаткові способи здійснення твердофазного синтезу білка описані в Bang, D. and Kent, S. 2004. A One-Pot Total Synthesis of Crambin. Angew. Chem. Int. Ed. 43: 2534-2538; Bang, D., Chopra, N., and Kent, S. 2004. Total Chemical Synthesis of Crambin. J. Am. Chem. Soc. 126: 13771383; Dawson, P. et al. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science. 266: 776779; Kochendoerfer et al. 2003. Design and Chemical Synthesis of a Homogenous Polymer- Modified Erythropoiesis Protein. Science. 299: 884-887. (Кожна цитована в даному абзаці публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). При необхідності менші за розміром пептиди, отримані в результаті твердофазного синтезу пептидів, можуть бути об'єднані за допомогою зв'язування пептидів, наприклад, за допомогою природних хімічних зв'язків. У даному способі тіолат N-кінцевого залишку цистеїну одного пептиду впливає на C-кінцевий тіоефір другого пептиду, призводячи до транстіоетерификації. 16 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Амідний зв'язок утворюється після швидкого ацильного переносу S→N. Див. Dawson, P. et al. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science. 266: 776-779, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі. Крім того, фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що тканинозахисні пептиди згідно із даним винаходом можуть включати пептидоміметики, пептиди, які містять як такі, що зустрічаються в природі, так і такі, що не зустрічаються в природі амінокислоти, такі як пептоїди. Пептоїди є олігомерами N-заміщених гліцинів, глікохолевої кислоти, тіопроніну, саркозину і тіорфану. Вказані структури мають тенденцію до утворення загальної структури (-(C=O)-CH2-NR-)n, при цьому R-група діє як бічний ланцюг. Такі пептоїди можуть бути синтезовані з використанням твердофазного синтезу відповідно до протоколів Simon et al., Peptoids: A molecular approach to drug discovery, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 9367-9371 (1992) і Li et al., Photolithographic Synthesis of Peptoids, J. AM. CHEM. SOC. 2004, 126, 4088-4089, кожна публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі. Крім того, даний винахід стосується застосування пептидоміметиків або міметиків пептидів, непептидних лікарських засобів, що мають властивості, аналогічні властивостям матричних пептидів (Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Friedinger (1985) TINS p. 32; і Evans et al. (1987) J. Med. Chem 30: 1229, публікації включені у вигляді посилання). Огляд синтезу різних типів пептидоміметиків можна знайти наприклад у: Methods of Organic Chemistry (HoubenWeyl), Sythesis of Peptides and Peptidomimetics - Workbench Edition Volume E22c (Editor-in-Chief Goodman M.) 2004 (George Thieme Verlag Stuttgart, New York, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Способи рекомбінації Можна використовувати різні системи хазяїн-експресуючий вектор, щоб одержати тканинозахисні пептиди відповідно до винаходу. Такі системи експресії в хазяїні являють собою вектори, за допомогою яких тканинозахисний пептид, який представляє інтерес, може бути отриманий і потім очищений, але також являють собою клітини, в яких при трансформації або трансфекції придатними кодуючими нуклеотидними послідовностями можна виявити модифікований продукт гена еритропоетину in situ. Такі системи включають без обмеження системи хазяїнів: бактерії, комахи, рослини, ссавці, включаючи людину, такі як, без обмеження, система клітин комах, інфікованих рекомбінантними вірусними експресуючими векторами (наприклад, бакуловірусами), що містять послідовності, які кодують тканинозахисний пептид; системи клітин рослин, інфікованих рекомбінантними вірусними експресуючими векторами (наприклад, вірусом мозаїки кольорової капусти, CaMV; вірусом тютюнової мозаїки, TMV) або трансформованих рекомбінантними плазмідними експресуючими векторами (наприклад, Tiплазмідою), що містять послідовності, які кодують споріднені еритропоетину молекули; або системи клітин ссавців, включаючи системи клітин людини, наприклад, HT1080, COS, CHO, BHK, 293, 3T3, які несуть рекомбінантні експресуючі конструкції, що містять промотори, отримані з генома клітин ссавців, наприклад, промотор металотіонеїну, або з вірусів ссавців, наприклад, пізній промотор аденовірусу; промотор 7.5K вірусу вакцини. Крім того, може бути вибраний штам клітини-хазяїна, що модулює експресію вбудованих або послідовностей модифікує і процесує генний продукт специфічним необхідними чином. Такі модифікації і процесінг білкових продуктів може бути важливим для функціонування білка. Як відомо фахівцям у даній галузі, різні клітини-хазяїни мають специфічні механізми посттрансляційного процесінгу і модифікації білків і генних продуктів. Можуть бути вибрані придатні лінії клітин або системи хазяїнів, щоб забезпечити правильну модифікацію і процесінг чужорідного експресуючого білка. З цією метою можна використовувати еукаріотичні клітинихазяїни, що мають клітинний апарат для правильного процесінгу первинного транскрипту, глікозилювання і фосфорилування генного продукту. Такими клітинами-хазяїнами ссавців, включаючи клітини-хазяїни людини, є без обмеження HT1080, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 і WI38. Для довгострокової, високопродуктивної продукції рекомбінантних пептидів переважна стабільна експресія. Наприклад, можуть бути сконструйовані лінії клітин, що стабільно експресують продукт рекомбінантного гена тканинозахисною спорідненої цитокіну молекули. Замість використання експресуючих векторів, що містять вірусні початки реплікації, клітинихазяїни можуть бути трансформовані ДНК під контролем придатних елементів регуляції експресії, наприклад, промотору, енхансера, послідовностями термінації транскрипції, сайтами поліаденілування і тому подібних, і селектованим маркером. Після введення чужорідної ДНК сконструйованим клітинам дають можливість рости протягом 1-2 днів у збагачених середовищах і потім переводять на селективні середовища. Селектований маркер у рекомбінантній плазміді додає резистентність до селекції і дозволяє клітинам стабільно 17 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 інтегрувати плазміду в їхні хромосоми і рости з утворенням вогнищ, які, у свою чергу, можна клонувати і розмножити до одержання ліній клітин. Такий спосіб переважно можна використовувати, щоб сконструювати лінії клітин, які експресують тканинозахисний продукт. Такі сконструйовані лінії клітин можуть бути особливо застосовні для скринінгу та оцінки сполук, що впливають на ендогенну активність продукту гена спорідненої EPO молекули. Додаткові модифікації Можуть бути здійснені додаткові модифікації тканинозахисних пептидів. Наприклад, пептид може бути синтезований з однією або декількома (D)-амінокислотами. Вибір включення (L)- або (D)-амінокислоти в пептид згідно із даним винаходом частково залежить від необхідних характеристик пептиду. Наприклад, включення однієї або декількох (D)-амінокислот може забезпечити підвищену стабільність пептиду in vitro або in vivo. Включення однієї або декількох (D)-амінокислот також може збільшувати або зменшувати активність зв'язування пептиду, що визначають, наприклад, використовуючи біологічні аналізи, описані в даній публікації, або інші способи, добре відомі в даній галузі. Заміна всієї або частини послідовності (L)-амінокислот відповідною послідовністю енантіомерних (D)-амінокислот створює оптично ізомерну структуру у відповідній частині поліпептидного ланцюга. Інверсія послідовності всієї або частини послідовності (L)-амінокислот створює зворотний аналог пептиду. Комбінація заміни енантіомерів (L на D або D на L) і інверсії послідовності створює зворотний інверсний аналог пептиду. Фахівцям у даній галузі відомо, що енантіомерні пептиди, їх зворотні аналоги і їх зворотні інверсні аналоги зберігають значний топологічний взаємозв'язок з вихідним пептидом і часто одержують особливо високий ступінь подібності вихідного пептиду і його зворотного інверсного аналога. Вказаний взаємозв'язок і подібність можуть відбиватися в біохімічних властивостях пептидів, зокрема високого ступеня зв'язування відповідних пептидів і аналогом з білком-рецептором. Синтез зворотних інверсних аналогів з визначеними властивостями обговорюється, наприклад, у Methods of Organic Chemistry (Houben-Weyl), Synthesis of Peptides and Peptidomimetics - Workbench Edition Volume E22c (Editor-in-chief Goodman M.) 2004 (George Thieme Verlag Stuttgart, New York), і цитованих у вказаних публікаціях посиланнях, які всі включені в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі. «Модифікація» амінокислоти стосується зміни амінокислоти, що зустрічається в природі, з одержанням амінокислоти, яка не зустрічається в природі. Похідні пептидів згідно із даним винаходом з амінокислотами, які не зустрічаються в природі, можуть бути створені при хімічному синтезі або за допомогою сайт-специфічного включення неприродних амінокислот у поліпептиди під час біосинтезу, як описано в Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, 1989 Science, 244: 182-188, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі. Міметики пептидів, які подібні за структурою з терапевтично застосовними пептидами, можна використовувати для одержання еквівалентної терапевтичної або профілактичної дії. Загалом, пептидоміметики структурно подібні з еталонним поліпептидом (тобто, поліпептидом, який має біохімічну властивість або фармакологічну активність), але в них один або декілька пептидних зв'язків необов'язково замінені зв'язком, вибраним з групи, яка складається з: --CH2NH--, --CH2S--, --CH2-CH2--, --CH=CH-- (цис- і транс-), --COCH2--, --CH(OH)CH2-- і --CH2SO--, способами, відомими в даній галузі і додатково описаними в наступних публікаціях: Spatola, A.F. у «Chemistry і Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins», B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p 267 (1983); Spatola, A.F., Vega Data (March 1983), Vol. 1. Issue 3, «Peptide Backbone Modifications» (загальний огляд); Morely, J.S., Trends Pharma Sci. (1980) pp. 463-468 (загальний огляд); Hudson, D. et al., (1979) Int. J. Pept. Prot. Re. 14: 177-185 (--CH2-NH--, --CH2CH2--); Spatola, A.F. et al., (1986) Life Sci. 38: 1243-1249 (--CH2-S); Harm, M. M., (1982) J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 307-314 (--CH=CH--, цис- і транс-); Almquist, R. G. et al., (1980) J. Med. Chem. 23: 1392 (--COCH2--); Jennings-White, C et al., (1982) Tetrahedron Lett. 23: 2533 (--COCH2--); Szelke, M et al., European Appln. EP 45665 (1982) CA: 97: 39405 (1982) (--CH(OH)CH2--); Holladay, M. W. et al., (1983) Tetrahedron Lett 24: 4401-4404 (--C(OH)CH2--); і Hruby, V.J., (1982) Life Sci 31: 189-199 (--CH2-S--); кожна з яких включена в даний опис у вигляді посилання. В іншому варіанті особливо переважним непептидним зв'язком є --CH2NH--. Такі міметики пептидів можуть мати істотні переваги в порівнянні з поліпептидними варіантами, включаючи, наприклад: більш економічне одержання, більш високу хімічну стабільність, поліпшені фармакологічні властивості (час напівжиття, всмоктування, активність, ефективність і т.д.), змінену специфічність (наприклад, біологічні активності широкого спектра дії), знижену антигенність і інші. 18 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Можливі різні конструкції міметиків пептидів. Наприклад, циклічні пептиди, в яких необхідна конформація стабілізована непептидними компонентами, спеціально розглянуті в патенті США No. 5192746, Lobl, et al., патенті США No. 5576423, Aversa, et al., патенті США No. 5051448, Shashoua, і патенті США No. 5559103, Gaeta, et al., що включені в даний опис у вигляді посилання, в яких описано кілька способів створення таких сполук. Синтез непептидних сполук, що імітують пептидні послідовності, також відомий у даній галузі. У публікації Eldred et al., J. Med. Chem. 37: 3882 (1994) (включеній в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі) описані непептидні антагоністи, що імітують пептидну послідовність. У публікації Likewise, Ku et al., J. Med. Chem 38:9 (1995) (включеній в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі) додатково описаний синтез серії таких сполук. Після синтезу можуть бути здійснені додаткові модифікації. Наприклад, тканинозахисні пептиди можуть бути додатково хімічно модифіковані, тобто карбаміловані, ацетильовані, сукцинільовані і т.д., відповідно до заявки на видачу патенту США No. 10/188905, яка опублікована як 20030072737-A1 17 квітня 2003 і описує хімічно модифікований EPO, і відповідно до заявки на видачу патенту США No.10/612665, поданої 1 липня 2003, і заявки на видачу патенту США No. 09/753132, поданої 29 грудня 2000, що включені в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі. Крім того, тканинозахисні пептиди можуть складатися з рекомбінантних тканинозахисних пептидів - мутеїнів. Виявлені мутації можуть включати заміни, делеції, включаючи внутрішні делеції, приєднання, включаючи приєднання, які дають злиті білки, або консервативні заміни амінокислотних залишків у межах і/або поруч з амінокислотною послідовністю, що призводять до «мовчазної» зміни, і неконсервативні амінокислотні заміни і більш великі інсерції і делеції, що описані раніше в PCT/US03/20964, під заголовком «Recombinant Tissue Protective Cytokines and Encoding Nucleic Acids Thereof for Protection, Restoration, and Enhancement of Responsive Cells, Tissues, and Organs (яка включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Можуть бути здійснені або консервативні, або неконсервативні заміни в одному або декількох амінокислотних залишках. Можуть бути здійснені як консервативні, так і неконсервативні заміни. Консервативними замінами є заміни, що мають місце в межах сімейства амінокислот, які є спорідненими за своїми бічними ланцюгами. Генетично кодовані амінокислоти можуть бути розділені на чотири сімейства: (1) кислі = аспартат, глутамат; (2) основні = лізин, аргінін, гістидин; (3) неполярні (гідрофобні) = цистеїн, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан, гліцин, тирозин; і (4) незаряджені полярні = аспарагін, глутамін, серин, треонін. Неполярні можуть бути додатково розділені на: сильно гідрофобні = аланін, валін, лейцин, ізолейцин, метіонін, фенілаланін і в міру гідрофобні = гліцин, пролін, цистеїн, тирозин, триптофан. Альтернативним чином набір амінокислот можна згрупувати в наступному вигляді: (1) кислі = аспартат, глутамат; (2) основні = лізин, аргінін, гістидин, (3) аліфатичні = гліцин, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, серин, треонін, при цьому серин і треонін необов'язково утворюють окрему групу аліфатичних амінокислот, що містять гідроксил; (4) ароматичні = фенілаланін, тирозин, триптофан; (5) амідні = аспарагін, глутамін; і th (6) сірковмісні = цистеїн і метіонін. (Див., наприклад, Biochemistry, 4 ed., Ed. by L. Stryer, WH Freeman and Co., 1995, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Альтернативно мутації можуть бути введені випадковим чином протягом усієї або частини кодуючої послідовності тканинозахисного пептиду, наприклад, за допомогою насичувального мутагенезу і може бути проведений скринінг отриманих у результаті мутантів відносно біологічної активності, щоб ідентифікувати мутанти, які зберігають активність. Після мутагенезу кодований пептид може бути рекомбінантно експресований, і може бути визначена активність рекомбінантного тканинозахисного пептиду. В іншому варіанті тканинозахисний пептид може бути додатково модифікований за допомогою приєднання полімерів (таких як поліетиленгліколь), цукру або додаткових білків (наприклад, у злитій конструкції), щоб спробувати продовжити час напівжиття тканинозахисного пептиду і підсилити тканинозахисну дію пептиду. Приклади таких модифікацій описані в WO/04022577 A3 і WO/05025606 A1, що включені в даний опис у вигляді посилання. 5.2 Аналізи для тестування тканинозахисних пептидів 5.2.1 Біологічні скринінги або аналізи Тканинозахисні пептиди згідно із даним винаходом можна тестувати відносно тканинозахисної активності, наприклад, відносно захисту клітин, тканин або органів. Крім того, захисні активності можуть бути тестовані з використанням аналізів in vitro і in vivo. Тести in vitro, що є показником тканинозахисної активності, включають, наприклад, аналізи проліферації клітин, аналізи диференціювання клітин або виявлення присутності білків або нуклеїнових 19 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кислот, активність яких піддається підвищувальній регуляції тканинозахисним рецепторним комплексом, наприклад, тканинозахисним рецепторним комплексом цитокінів, наприклад, нуклеолін, нейроглобін, цитоглобін або фратаксин. Нейроглобін, наприклад, може бути задіяний у здійснення транспорту або короткочасного збереження кисню. Тому аналізи транспорту або збереження кисню можна використовувати як аналіз для ідентифікації або скринінгу сполук, що модулюють тканинозахисну активність. Нейроглобін експресується в клітинах і тканинах центральної нервової системи у відповідь на гіпоксію або ішемію і може забезпечувати захист від ушкодження (Sun et al. 2001, PNAS 98: 15306-15311; Schmid et al., 2003, J. Biol. Chem. 276: 1932-1935, кожна публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Цитоглобін може відігравати подібну роль у захисті, але експресується в різних тканинах на різних рівнях (Pesce et al., 2002, EMBO 3: 11461151, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). В одному варіанті здійснення винаходу рівні білка, що піддається підвищувальній регуляції, у клітині можуть бути виміряні до і після контактування тканинозахисного пептиду з клітиною. У деяких варіантах присутність білка, що піддається підвищувальній регуляції, зв'язаного з тканинозахисною активністю в клітині, можна використовувати для підтвердження тканинозахисної активності пептиду. Нуклеолін може захищати клітини від ушкодження. Він грає численні ролі в клітинах, включаючи модулювання процесів транскрипції, специфічного для послідовності РНК зв'язування білка, цитокінезу, нуклеогенезу, сигнальної трансдукції, апоптозу, індукованого Tклітинами, ремоделювання або хроматину реплікації. Він також може функціонувати як ДНК/РНК-гелікази рецептора клітинної поверхні, ДНК-залежної АТФази, човникового білка, компонента фактора або транскрипції репресора транскрипції (Srivastava and Pollard, 1999, FASEB J., 13: 1911-1922; і Ginisty et al., 1999, J. Cell Sci., 112: 761-772, кожна публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Фратаксин являє собою білок, який задіяний у мітохондріальний метаболізм заліза і який, як було показано раніше, у значній мірі піддається підвищувальній регуляції при дії EPO як in vivo, так і in vitro (Sturm et al. (2005) Eur. J. Clin. Invest. 35: 711, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Експресія білка, що піддається підвищувальній регуляції, може бути виявлена за допомогою реєстрації рівнів мРНК, що відповідає білку, у клітині. мРНК можна гібридизувати із зондом, що специфічно зв'язує нуклеїнову кислоту, що кодує білок, який піддається підвищувальній регуляції. Гібридизація може являти собою, наприклад, Нозерн-блот, Саузерн-блот, гібридизацію на матрицях, афінну хроматографію або гібридизацію in situ. Тканинозахисна активність поліпептиду відповідно до винаходу також може бути виявлена з використанням аналізу нейрозахисту in vitro. Наприклад, первинні культури нейронів можуть бути отримані з гіпокампа немовлят щурів трипсинізацією, і їх можна культивувати будь-яким способом, відомим у даній галузі і/або описаним у даній публікації, наприклад у ростовому середовищі MEM-II (Invitrogen), що містить 20 мМ D-глюкози, 2 мМ L-глутаміну, 10% Nuсироватки (бичача; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), 2% домішки B27 (Invitrogen), 26,2 мМ NaHCO3, 100 од./мл пеніциліну і 1 мг/мл стрептавідину (див., наприклад, Leist et al., 2004, Science 305: 239-242, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Через день після висіву додають 1 мкМ цитозинарабінофуранозиду. Потім тринадцятиденні культури попередньо інкубують зі зростаючими дозами EPO або CEPO (3-3000 пМ) протягом 24 годин. На 14 день середовище видаляють і культури стимулюють 300 мкМ NMDA у PBS при кімнатній температурі. Через 5 хв раніше кондиційоване середовище повертають у культури, і культури повертають в інкубатор на 24 години. Клітини фіксують у параформальдегіді, фарбують Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR), і потім можна підрахувати конденсовані апоптозні ядра. Як позитивні контролі включають NGF (50 нг/мл) і MK801 (1 мкМ). Модельні системи на тварин можна використовувати для демонстрації тканинозахисної активності або сполуки для демонстрації безпеки та ефективності сполук, ідентифікованими способами скринінгу відповідно до винаходу, описаними вище. Сполуки, ідентифіковані в аналізах, потім можна тестувати відносно біологічної активності, використовуючи моделі на тваринах для типу ушкодження тканини, що представляє інтерес, захворювання, стану або синдрому. Моделі включають тварин, створених так, щоб вони містили тканинозахисний рецепторний комплекс, зв'язаний з функціональною індикаторною системою, таких як трансгенна миша. Моделі на тваринах, які можна використовувати для тестування ефективності захисної відносно клітин або тканинозахисної активності ідентифікованої сполуки, включають, наприклад, захист від появи гострого експериментального алергійного енцефаломієліту (EAE; 20 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 див. приклад 12) у щурів Lewis, відновлення або захист від зниження когнітивної функції у мишей після одержання травми головного мозку, ішемії головного мозку («інсульту»; приклад 5) або судоми, індукованої ексцитотоксинами (Brines et al., 2000, PNAS, 97: 10295-10672, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі), захист від індукованої ішемії сітківки (Rosenbaum et al., 1997, Vis. Res. 37: 3443-51 публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі), захист від ушкодження сідничного нерва (див. приклад 2) і захист від ішемічного-реперфузійного ушкодження серця (дослідження кардіоміоцитів in vitro і ішемічного-реперфузійного ушкодження in vivo, див., наприклад, Calvillo et al., 2003, PNAS 100: 4802-4806 і Fiordaliso et al., 2005, PNAS 102: 2046-2051, кожна публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Такі аналізи більш докладно описані в Grasso et al. (2004) Med. Sci. Monit. 10: BR1-3 або в публікації PCT No. WO 02/053580, кожна публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі. Описані способи in vivo направлені на введення EPO, однак було показано, що тканинозахисні білки, введені замість EPO, також виявляють подібну біологічну активність, наприклад, Leist et al. (2004) Science 305: 239-242, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі. Пептиди для тестування також можуть мати заміни. Інші аналізи для визначення тканинозахисної активності пептиду добре відомі фахівцям у даній галузі. 5.2.2 Аналізи зв'язування з клітинами Альтернативно можна використовувати аналізи зв'язування клітинами для оцінки поліпептидів відповідно до винаходу. Наприклад, що представляє інтерес тканинозахисний пептид може бути зв'язаний з біологічним маркером, таким як флуоресцентний або радіоактивний маркер, для полегшення реєстрації і потім тестований відносно зв'язування з трансфікованими клітинами Ba3, експресуючими EPOR і/або βc-рецептор. У 96-ямковий планшет висівають вісім серійних розведень 1:2 тканинозахисного пептиду, що представляє інтерес, в середовищі росту (RPMI 1640, 10% фетальна теляча сироватка, 1 мм піруват натрію, 2 мм L-глютамін), так щоб кінцевий об’єм у кожній ямці складав близько 100 мкл. Вихідну лінію Ba3 і клітини Ba3, трансфіковані EPOR і/або βc-рецептором можна три рази промити в середовищі росту (див. вище), опади ресуспендувати у середовищі росту і клітини підрахувати і розбавити в середовищі росту до концентрації 5000 клітин/100 мкл. Потім додають 100 мкл розведених клітин до кожного розведення пептиду. Потім аналізований планшет інкубують в інкубаторі при 37°C протягом трьох-чотирьох днів. Потім планшет/клітини промивають і планшет зчитують у пристрої для реєстрації флуоресценції з планшетів або іншим придатним способом, щоб визначити рівень біомаркера, пов'язаного з біологічною активністю тканинозахисного пептиду, що представляє інтерес. Подібним чином можна використовувати конкурентний аналіз для визначення того, чи є тканинозахисний пептид тканинозахисним. У конкурентному аналізі сполука, відома як тканинозахисна, включаючи без обмеження тканинозахисні цитокіни, такі як цитокіни, описані в заявках на видачу патенту США No. 10/188905 і 10/185841 (кожна з яких включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі), можуть бути зв'язані з придатним біомаркером. У 96-ямковий планшет поміщають вісім серійних розведень 1:2 відомої тканинозахсиної сполуки/біомаркера в придатному середовищі росту і таку ж серію розведень відомого тканинозахисної сполуки/біомаркера і тканинозахисного пептиду, що представляє інтерес. Кінцевий об’єм кожного розведення повинен складати близько 100 мкл. Потім клітини Ba3 висівають у планшети, як описано вище, і інкубують. Через визначений період часу клітини промивають, і планшет зчитують у пристрої для визначення флуоресценції в планшетах або будь-яким іншим придатним способом, відомим у даній галузі для реєстрації біомаркера. Якщо показання для планшетів і/або ямок, що містять відому тканинозахисну сполуку/біомаркер і тканинозахисний пептид, який представляє інтерес, менше, ніж показання для планшетів, що містять тільки відому тканинозахисну сполуку/біомаркер, то тканинозахисний пептид, який представляє інтерес, є тканинозахисним. 5.2.3 Цитокінна активність і активність у проліферації/диференціюванні клітин Багато білкових факторів, виявлених дотепер, включаючи всі відомі цитокіни, виявляли активність в одному або декількох аналізах залежної від факторів проліферації клітин, і тому такі аналізи служать для відповідного підтвердження цитокінної активності. Активність тканинозахисного пептиду може бути підтверджена кожним з ряду звичайних аналізів залежної від факторів проліферації клітин для клітинних ліній, включаючи без обмеження 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+(preB M+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e і CMK. Вказані клітини культивують у присутності або під час відсутності тканинозахисного пептиду, і проліферацію клітин реєструють, наприклад, вимірюючи включення міченого тритієм тимідину або колориметричним аналізом, заснованим на метаболічному розщепленні броміду 21 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразолію (MTT) (Mosman, 1983, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). 5.2.4 Інші аналізи Якщо тканинозахисний пептид виявляє тканинозахисну активність, то фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що може бути корисною перевірка результату з використанням одного з аналізів нейрозахисту і захисту тканини, відомих фахівцям у даній галузі, таких як, без обмеження, аналізи на клітинах P-19 і PC-12. Крім того, різні моделі in vivo, такі як моделі на тваринах, пов'язані з ушкодженням спинного мозку, ішемічним інсультом, ушкодженням периферичного нерва, серця, очей, нирок і т.д., можуть бути застосовні для додаткової характеристики тканинозахисного пептиду. Придатні аналізи in vitro і in vivo описані в заявках на видачу патентів США No. 10/188905 і 10/185841, що включені в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі. 5.3 Терапевтичне застосування Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що тканинозахисні пептиди згідно із даним винаходом застосовні як терапевтичні засоби для лікування або профілактики різних захворювань, розладів і станів. Фахівцю в даній галузі також буде зрозуміло, що такі пептиди можна використовувати для здійснення модулювання тканинозахисного рецепторного комплексу, наприклад, тканинозахисного цитокінного комплексу. Способи in vitro і in vivo, які можна використовувати для оцінки терапевтичних показів для застосування сполук, ідентифікованих у пропонованих у винаході і вказаних вище аналізах, описані в заявці PCT No. PCT/US01/49479, заявках на видачу патенту США No. 10/188905 і 10/185841, включених у даний опис у вигляді посилання. Вказані вище тканинозахисні пептиди відповідно до винаходу загалом можуть бути застосовні для профілактики, терапевтичного лікування або профілактичного лікування захворювань або розладів центральної нервової або системи периферичної нервової системи людини, при яких головним чином спостерігаються неврологічні або психіатричні симптоми, очних хвороб, серцево-судинних захворювань, серцево-легеневих захворювань, респіраторних захворювань, захворювань нирок, сечової системи і репродуктивної системи, кісткових хвороб, шкірних хвороб, захворювань сполучної тканини, шлунково-кишкових захворювань та ендокринних і метаболічних порушень. Приклади застосування включають без обмеження захист від ушкоджень і відновлення ушкоджень, що виникають у результаті травми і призводять до запалення головного мозку (ішемічний інсульт, тупа травма, субарахноїдальний крововилив), спинного мозку (ішемія, травма від удару тупим предметом), периферичних нервів (ушкодження сідничного нерва, діабетична нейропатія, синдром карпального каналу), сітківки (набряк жовтої плями, діабетична ретинопатія, глаукома) і серця (інфаркт міокарда, хронічна серцева недостатність). Зокрема, такі захворювання, розлади і стани включають стани гіпоксії, що несприятливо впливають на чутливі тканини, такі як збуджувані тканини, наприклад, тканини центральної нервової системи, тканини периферичної нервової системи або тканини серця або тканини сітківки, такі як, наприклад, тканини головного мозку, серця або сітківки/ока. Тому тканинозахисні пептиди відповідно до винаходу можуть бути використані для лікування або профілактики ушкодження чутливої тканини в результаті станів гіпоксії при різних станах і обставинах. Не обмежувальні приклади таких станів і обставин вказані в таблиці нижче. Тканинозахисні поліпептиди також складають інтерес для модулювання активності стовбурових клітин. Було встановлено, що цитокіни, які виявляють тканинозахисну активність, наприклад, EPO, здатні мобілізувати стовбурові клітини, стимулюючи міграцію в ділянці ушкодження і допомагаючи процесу відновлення, наприклад, регенерації. Наприклад, у випадку експериментального інсульту EPO опосередковує міграцію нейробластів в ділянку ішемічного ушкодження з регенерацією нейронів у ході відновлювального періоду (Tsai et al., J. Neurosci (2006) 26: 1269-74, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Як інший приклад EPO і CEPO мобілізують ендотеліальні клітини-попередники з кісткового мозку в кровообіг. Потім відбувається хоумінг вказаних клітин у віддалених ділянках, і вони беруть участь в утворені нових кровоносних судин (ефект EPO див. Bahlmann et al., 2003, Kidney Int. 64: 1648-1652, публікація включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Не маючи наміру бути зв'язаними з будь-якою конкретною теорією, автори думають, що ізольовані поліпептиди, охарактеризовані в даному описі, впливають на міграцію стовбурових клітин. У прикладі захисту від патологій нервової тканини, які можна лікувати і запобігати з використанням тканинозахисних пептидів відповідно до винаходу, такі патології включають патології, що виникають у результаті зниженої оксигенації нервових тканин. Будь-який стан, що зменшує доступність кисню в нервову тканину, що призводить до стресу, ушкодження і, нарешті, загибелі нервових клітин, можна лікувати з застосуванням тканинозахисних пептидів 22 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 згідно із даним винаходом. Загалом називані гіпоксією і/або ішемією такі стани виникають у результаті або включають без обмеження інсульт, оклюзію судин, пренатальну або постнатальну кисневу недостатність, ядуху, асфіксію, клінічну смерть, отруєння оксидом вуглецю, вдихання диму, травму, включаючи хірургічну операцію і променеву терапію, асфіксію, епілепсію, гіпоглікемію, хронічне обструктивне легеневе захворювання, емфізему, респіраторний дистрес-синдром дорослих, гіпотензивний шок, септичний шок, анафілактичний шок, інсуліновий шок, серпоподібноклітинну кризу, зупинку серця, аритмію, азотний наркоз і неврологічні розлади, викликані процедурою штучного кровообігу. В одному варіанті, наприклад, тканинозахисні пептиди згідно із даним винаходом, ідентифіковані з використанням запропонованого у винаході аналізу, можуть бути введені окремо або у вигляді частини композиції для профілактики травми або ушкодження тканини у випадку існування ризику травми або ушкодження тканини перед, під час або після хірургічної операції або медичної процедури. Наприклад, хірургічні операції можуть включати резекцію пухлини або реконструкцію при аневризмі, і медичні процедури можуть включати пологи або розродження. Інші патології, викликані або такі, що виникають в результаті гіпоглікемії, які можна лікувати з застосуванням тканинозахисних пептидів згідно із даним винаходом, включають передозування інсуліну, також називане ятрогенною гіперінсулінемією, інсуліному, недостатність гормону росту, гіпокортицизм, передозування лікарських засобів і деякі пухлини. Інші патології, що виникають у результаті ушкодження збудливої нервової тканини, включають судомні розлади, такі як епілепсія, конвульсії або хронічні судомні розлади. Інші стани і захворювання, які можна лікувати, включають без обмеження такі захворювання, як інсульт, розсіяний склероз, гіпотонію, зупинку серця, хворобу Альцгеймера, хворобу Паркінсона, церебральний параліч, травму головного або спинного мозку, пов'язану зі СНІДом деменцію, вікову втрату когнітивної функції, втрату пам'яті, бічний аміотрофічний склероз, судомні розлади, алкоголізм, ішемію сітківки, ушкодження зорового нерва в результаті глаукоми і загибель нейронів. Специфічні тканинозахисні пептиди згідно із даним винаходом можна застосовувати для лікування або профілактики запалення в результаті патологічних станів або різних травм, наприклад фізично або хімічно індукованого запалення. Також передбачається застосування тканинозахисних пептидів для лікування і профілактики запальних станів в одному або декількох органах або тканинах, включаючи без обмеження головний мозок, спинний мозок, сполучну тканину, серце, легеню, нирки і сечовивідні шляхи, підшлункову залозу, очі і простату. Не обмежувальні приклади такої травми включають тендиніт, ангіїт, хронічний бронхіт, панкреатит, остеомієліт, ревматоїдний артрит, гломерулонефрит, неврит зорового нерва, скроневий артеріїт, енцефаліт, менінгіт, поперечний мієліт, дерматоміозит, поліміозит, некротизуючий фасцит, гепатит і некротизуючий ентероколіт. Крім того, тканинозахисні цитокіни можна застосовувати для лікування або профілактики запалення, що виникає в результаті ішемічних і неішемічних станів, включаючи без обмеження алергії, ревматичні захворювання, спортивні тренування, інфекції, включаючи вірусні, грибкові і бактеріальні. Запалення може бути гострим або хронічним. Додаткові застосування в ділянці запалення вказані в заявці PCT/US2004/031789, поданої 29 вересня 2004 і опублікованої як WO 2005/032467, що включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі. Специфічні тканинозахисні пептиди згідно із даним винаходом можуть бути використані для лікування захворювань центральної нервової системи і периферичної нервової системи, що виникають у результаті демієлінізації або ушкодження мієлінової оболонки. Такі захворювання головним чином визначають як захворювання, в які задіяні запальні ушкодження мієлінової оболонки невідомого походження за винятком захворювань, пов'язаних з недостатністю мієлінізації, таких як лейкодистрофія, і захворювань внаслідок очевидних причин. Розсіяний склероз (MS) є типовим захворювання в групі демієлінізуючих захворювань і патологічно характеризується змінами, в основному, запальною демієлінізацією і гліозом. Так як його етіології невідомі, то діагноз здійснюють на основі клінічних ознак, тобто, різноманітними в просторовому і часовому відношенні ушкодженнями центральної нервової системи. Крім того, до демієлінізуючих захворювань відносяться гострий розсіяний енцефаломієліт (ADEM), запальний дифузійний склероз, гострий і підгострий некротизуючий геморагічний енцефаломієліт і поперечний мієліт. Також, збереження мієлінової оболонки периферичних нервів засновано на Шваннівських клітинах, і ушкодження таких клітин викликає периферичне демієлінізуюче захворювання. Тканинозахисні пептиди згідно із даним винаходом можна застосовувати для лікування або профілактики станів і ушкодження серця, включаючи будь-яке хронічне або гостре патологічне явище, в яке задіяне серце і/або пов'язані з ним тканини (наприклад, перикард, аорта та інші 23 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пов'язані кровоносні судини), включаючи ішемічне-реперфузійне ушкодження; застійну серцеву недостатність; зупинку серця; інфаркт міокарда; атеросклероз, порушення герметичності мітрального клапана, тріпотіння передсердь, кардіотоксичність, викликану сполуками, такими як лікарські засоби (наприклад, доксорубіцин, герцептин, тіоридазин і цизаприд); ушкодження серця внаслідок паразитарної інфекції (бактеріями, грибами, рікетсіями і вірусами, наприклад, сифіліс, хронічна інфекція Trypanosoma cruzi); блискавичний амілоїдоз серця; операцію на серці; трансплантацію серця; ангіопластику, лапароскопічну операцію, ушкодження серця в результаті травми (наприклад, проникне або тупе ушкодження серця і розрив клапанів аорти), хірургічне відновлення аневризми грудної аорти; аневризму артерії надниркових залоз; кардіогенний шок внаслідок інфаркту або міокарда серцевої недостатності; нейрогенний шок і анафілаксію. Тканинозахисні пептиди згідно із даним винаходом також можна застосовувати для лікування людей, для яких існує ризик хвороби серця, таких як серцева недостатність (тобто, коли серце не здатне перекачувати кров зі швидкістю, необхідної для метаболізуючих тканин, або коли серце може виконувати цю задачу тільки при підвищеному тиску наповнення). До таких пацієнтів групи ризику можуть відноситися пацієнти, що мають інфаркт міокарда, або для який існує ризик розвитку інфаркту міокарда, що мають хворобу коронарних артерій, міокардит, хіміотерапію, кардіоміопатію, гіпертонію, порок клапана серця (найчастіше мітральну недостатність і стеноз устя аорти) та індуковану токсинами кардіоміопатію (наприклад, етанолом, кокаїном і т.д.) і тому подібні. Тканинозахисні пептиди згідно із даним винаходом можна застосовувати для лікування або профілактики станів і ушкодження очей, наприклад, тканини сітківки. Такі розлади включають без обмеження ішемію сітківки, дегенерацію жовтої плями, відшарування сітківки, пігментну дегенерацію сітківки, артеріосклеротичну ретинопатію, гіпертензивну ретинопатію, закупорення артерії сітківки, закупорення вени сітківки, гіпотензію і діабетичну ретинопатію. В іншому варіанті тканинозахисні пептиди згідно із даним винаходом і принципи здійснення винаходу можна застосовувати для профілактики або лікування ушкодження, що виникає в результаті ушкодження чутливої тканини опроміненням. Додатковим застосуванням тканинозахисних пептидів згідно із даним винаходом є лікування отруєння, такого як отруєння нейротоксинами (наприклад, отруєння домоєвою кислотою молюсків), токсинами (етанолом, кокаїном і т.д.), також як у результаті впливу хіміотерапевтичних засобів і опромінення; нейролатиризму; хвороби Гуама; бічного аміотрофічного склерозу і хвороби Паркінсона. Як вказано вище, даний винахід також стосується тканинозахисних пептидів згідно із даним винаходом для застосування при посиленні функції тканини у випадку відповідаючи клітин, тканин і органів ссавця за допомогою периферичного введення тканинозахисного цитокіну, що описаний вище. Різні захворювання і стани піддаються лікуванню з застосуванням вказаного способу. Наприклад, даний спосіб застосовний для посилення функції збуджуваних тканин, що призводить до підвищення когнітивної функції навіть під час відсутності будь-якого стану або захворювання. Крім того, тканинозахисні цитокіни застосовні для поліпшення якості загоєння раней, зменшення часу, необхідного для загоєння, поліпшення якості вилікованих тканин і зменшення частоти утворення рубців у результаті поранення. Див. заявку PCT/US2004/031789, подану 29 вересня 2004 і опубліковану як WO 2005/032467, яка включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі. Вказані застосування згідно із даним винаходом більш докладно описані нижче і включають поліпшення навчання і тренування як у людини, так і у ссавців, відмінних від людини. Стани і захворювання, які можна лікувати або запобігати з використанням тканинозахисних пептидів згідно із даним винаходом, напрямлених на центральну нервову систему, включають без обмеження розлади настрою, тривожні розлади, депресію, аутизм, гіперактивний розлад з дефіцитом уваги і когнітивну дисфункцію. При вказаних станах корисне посилення функції нейронів. Інші розлади, які можна лікувати відповідно до інструкцій, пропонованих у даному винаході, включають порушення сну, наприклад, апное у сні, і розлади, пов'язані з подорожами; субарахноїдальний крововилив і крововилив при аневризмах, гіпотонічний шок, ушкодження при ударі, септичний шок, анафілактичний шок і ускладнення при різних енцефалітидах і менінгітидах, наприклад, пов'язані з захворюванням сполучної тканини церебрити, наприклад вовчак. Інші застосування включають профілактику або захист від отруєння нейротоксинами, такого як отруєння домоєвою кислотою молюсків, нейролатиризму і хвороби Гуама, бічного аміотрофічного склерозу, хвороби Паркінсона; для післяопераційного лікування емболічного або ішемічного ушкодження; опромінення всього головного мозку; серпоподібноклітинної кризи і еклампсії. Наступна група станів, які можна лікувати або запобігати з застосуванням тканинозахисних пептидів згідно із даним винаходом, включають мітохондріальну дисфункцію або спадкової 24 UA 100222 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 природи, або надбану, яка є причиною множини неврологічних хвороб, які характеризуються ушкодженням і загибеллю нейронів. Наприклад, хвороба Лейга (підгостра некротизуюча енцефалопатія) характеризується прогресуючою втратою зору і енцефалопатією внаслідок втрати нейронів і міопатії. У таких випадках порушений метаболізм у мітохондріях не може поставляти досить високо енергетичні субстрати для підживлення метаболізму збуджуваних клітин. Тканинозахисний пептид оптимізує ушкоджену функцію при різних мітохондріальних захворюваннях. Як вказано вище, стани гіпоксії несприятливо впливають на збуджувані тканини. Збуджувані тканини включають без обмеження тканину центральної нервової системи, тканину периферичної нервової системи і тканину серця. Крім описаних вище станів тканинозахисні пептиди згідно із даним винаходом застосовні для лікування інгаляційного отруєння, такого як вдихання оксиду вуглецю і диму, важкої астми, респіраторного дистрессиндрому дорослих і ядухи, і клінічної смерті. Крім станів, що створюють умови гіпоксії, або іншими шляхами індукують чутливу тканину, наприклад, збудливу тканину, ушкодження включає гіпоглікемію, що може виникати при введенні невідповідних доз або інсуліну у випадку продукуючих інсулін неоплазм (інсуліноми). Різні нейропсихологічні розлади, які, як описано, виникають у результаті ушкодження збудливої тканини, можна лікувати з застосуванням тканинозахисних пептидів згідно із даним винаходом. Хронічні розлади, в яких задіяне ушкодження нейронів, і лікування або профілактика яких пропонується в даному винаході, включають розлади, пов'язані з центральною нервовою системою і/або периферичною нервовою системою, включаючи вікову втрату когнітивної функції і старечу деменцію, хронічні судомні розлади, хворобу Альцгеймера, хворобу Паркінсона, деменцію, втрату пам'яті, бічний аміотрофічний склероз, розсіяний склероз, туберозний склероз, хворобу Вільсона, церебральний і прогресуючий супрануклеарний параліч, хворобу Гуама, деменцію з тільцями Леві, пріонні хвороби, таку як губчаста енцефалопатія, наприклад, хвороба Якоба-Крейтцфельдта, хвороба Хантінгтона, міотонічну дистрофію, атаксію Фрейдріха й інші атаксії, а також синдром Жиль де ля Туретта, судомні розлади, такі як епілепсія і хронічний судомний розлад, інсульт, травму головного мозку або спинного мозку, пов'язану зі СНІДом деменцію, алкоголізм, аутизм, ішемію сітківки, глаукому, розлади автономної функції, такі як гіпертонія і розлади сну, і нейропсихіатричні розлади, що включають без обмеження шизофренію, шизофреноподібний афективний розлад, розлад з дефіцитом уваги, дистимічний розлад, глибокий депресивний розлад, манію, обсесивнокомпульсивний розлад, розлади внаслідок застосування психоактивних речовин, тривожність, панічний розлад, а також монополярні і біполярні афективні розлади. Додаткові нейропсихіатричні і нейродегенеративні розлади включають, наприклад, розлади, перераховані в American Psychiatric Аssосіаtіоn's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM), сама остання версія якого включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі. Наступна група станів, які можна лікувати або запобігати з застосуванням тканинозахисних пептидів згідно із даним винаходом, включають захворювання нирок, такі як ниркова недостатність, гостра і хронічна. Кровопостачання нирок може бути перерване внаслідок декількох причин, включаючи шок у результаті інфекцій, що проникають у кровотік (сепсис), внутрішньої або зовнішньої кровотечі, втрати рідини організмом у результаті важкої діареї або опіків, реакції на трансфузії, зупинки серця або аритмії, хірургічної травми і трансплантації нирок. Зменшений потік крові в нирки, що виникає в результаті вказаних вище станів, може зменшувати потік крові до небезпечно низьких рівнів протягом досить великого періоду часу, щоб викликати розвиток гострої ниркової недостатності. Знижений потік крові також призведе до некрозу або загибелі тканини в нирці, ушкоджуючи ниркові тубулярні клітини. Ниркова недостатність також може виникати в результаті захворювань (інтерстиційних і діабетичних) нефротичних синдромів, інфекцій, ушкодження (CPB-індукованого), токсинів (індукована контрастними речовинами, індукована хіміотерапією, циклоспорином), аутоімунного запалення (наприклад, вовчака, еритроза і т.д.). Тканинозахисні пептиди згідно із даним винаходом сприяють відновленню або запобіганню такого ушкодження, допомагаючи зменшити гостру ниркову недостатність. У наступній таблиці перелічені додаткові ілюстративні не обмежуючі показання відносно різних станів і захворювань, що піддаються лікуванню вказаними вище тканинозахисними пептидами. 25 UA 100222 C2 Клітина, Дисфункція або тканина Стан або захворювання Тип патологія або орган Сердце Ішемія Хвороба коронарних артерій Гостре, хронічне, стабільне, нестабільне Інфаркт міокарда Синдром Дресслера Стенокардія Природжений порок сердца Вальвулярний Кардіоміопатія Стенокардія Принцметалу Розрив серця Аневризматичний Перфорація перегородки Ангіїт Аритмія Тахіаритмія, брадіаритмія, Стабільний, нестабільний суправентрикулярна, Гіпертензивний каротидний синусний вентрикулярна, порушення вузол провідності Застійна Лівий, правий, обидва Кардіоміопатії, такі як ідіопатична серцева шлуночка, систолічна, сімейна, інфекційна, метаболічна, недостатність діастолічна хвороба накопичення, недостатності, захворювання з’єднувальної тканини, інфільтрація і гранулеми, нейроваскулярна Міокардіт Аутоімунний, інфекційний, ідіопатичний Легеневе сердце Радіаційне ушкодження Тупа і проникна травма Токсини Токсичність кокаїну, адріаміцин Судини Гіпертензія Легенева, вторинна Декомпресійна хвороба Фіброзном’язова гіперплазія Аневризма Розшаровуюча, з розривом, розширювальна 26 UA 100222 C2 Легені Обструктивне Ішемічна хвороба легень Хвороби легень, обумовлені факторами середовища Ішемічна хвороба легень Інтерстиційне захворювання легень Природжене Легеневе серце Травма Пневмонія та пневмоніти Підшлункова залоза Саркоїдоз Ендокринні Екзокринні Кістки Остеопенія Астма Хронічний бронхіт, Емфізема і обструкція дихальних шляхів Легенева емболія, Легеневий тромбоз, жирова емболія Легенева емболія, Легеневий тромбоз Ідіопатичний легеневий фіброз Кістозний фіброз Інфекційні, паразитарні, токсичні, травматичні, опікові, аспіраційні Цукровий діабет типу I та Недостатність бета-клітин, II дисфункція, діабетична нейропатія Інша недостатність ендокринних клітин підшлункової залози Екзокринна недостатність Панкреатит підшлункової залози Первинна Гіпогонадизм Вторинна Імобілізація Постменопаузна Вікова Гіперпаратиреоїдизм Гіпертиреоїдизм Недостатність кальцію, магнію, фосфору і/або вітаміну D Остеомієліт Аваскулярний некроз Травма Хвороба Педжета 27 UA 100222 C2 Шкіра Алопеція Вогнищева Тотальна Первинна Вторинна Облисіння чоловічого типу Локалізоване Первинне Генералізоване Вторинне Діабетичне Пролежні, Пролежні пролежневі виразки Вітиліго Утворення виразок Хвороба периферичних судин Хірургічні рани, рвані рани Опікові ушкодження Аутоімунні Системний червоний вовчак, синдром Шегрена, захворювання ревматоїдний артрит, гломерулонефрит, ангіїт Гістіоцитоз Лангерганса Очі Неврит зорового нерву Тупі і проникні ушкодження, інфекції, саркоїд, серпоподібноклітинна хвороба, відшарування сітківки, скроневий артеріїт Ішемія сітківки, дегенерація жовтої плями, пігментна дегенерація сітківки, артеріосклеротична ретинопатія, гіпертензивна ретинопатія, закупорення артерії сітківки, закупорення вени сітківки, гіпотензія, діабетична ретинопатія, глаукома та набряк жовтої плями Ембріональні та Асфіксія фетальні Ішемія розлади 28