Tnf-a-зв’язувальний білок
Номер патенту: 107490
Опубліковано: 12.01.2015
Автори: Бенатуіл Лоренцо, Ісаксон Пітер С., Гудро Керрі Л., Зальфелд Йохен, Гхаюр Тарік
Формула / Реферат
1. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент, який містить антигензв′язувальний домен, здатний зв′язувати фактор-альфа некрозу пухлин людини (TNF-α), причому антигензв′язувальний домен містить три області, що визначають комплементарність (CDR), важкого ланцюга і три CDR легкого ланцюга,
де вказані три CDR важкого ланцюга містять:
CDR-H1, яка містить амінокислотні залишки 31-35 SEQ ID NO:22;
CDR-H2, яка містить амінокислотні залишки 50-65 SEQ ID NO:22;
CDR-H3, яка містить амінокислотні залишки 98-106 SEQ ID NO:22;
де вказані три CDR легкого ланцюга містять:
CDR-L1, яка містить амінокислотні залишки 24-34 SEQ ID NO:23;
CDR-L2, яка містить амінокислотні залишки 50-56 SEQ ID NO:23;
CDR-L3, яка містить амінокислотні залишки 89-97 SEQ ID NO:23,
де вказані гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент містять акцепторний каркас людини; і
де вказані гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент зв′язуються з TNF-α людини з нижчою константою дисоціації (KD), ніж мишаче MAK195, як виміряно з використанням поверхневого плазмонного резонансу, і/або нейтралізують TNF-α людини з нижчою IC50, ніж мишаче MAK195, як виміряно з використанням аналізу нейтралізації TNF-α людини.
2. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, де вказаний антигензв′язувальний домен містить варіабельну область важкого ланцюга (VH).
3. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 2, де вказана область VH містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:24, 25, 28, 29, 30, 31, 32 і 33.
4. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, де вказаний антигензв′язувальний домен містить варіабельну область легкого ланцюга (VL).
5. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 4, де вказана область VL містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:26, 27, 34, 35 і 36.
6. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, де вказаний антигензв′язувальний домен містить область VH і область VL.
7. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 6, де вказана область VH містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:24, 25, 28, 29, 30, 31, 32 і 33, і вказана область VL містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, що складається з SEQ ID NO:26, 27, 34, 35 і 36.
8. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, де вказаний акцепторний каркас людини містить щонайменше одну амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:6-21.
9. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 8, де вказаний акцепторний каркас людини містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:9, 10, 11, 12, 15, 16, 17 або 21.
10. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 8 або 9, де вказаний акцепторний каркас людини містить щонайменше одну заміну амінокислоти.
11. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 10, де вказану заміну амінокислоти здійснюють в ключовому залишку, вибраному з групи, яка складається з: залишку, суміжного з CDR; залишку сайта глікозилування; залишку, здатного взаємодіяти з TNF-α людини; залишку, здатного взаємодіяти з CDR; залишку контакту між варіабельною областю важкого ланцюга і варіабельною областю легкого ланцюга; залишку у межах зони Vernier і залишку в області, що перекривається між визначуваною за Чотія CDR1 варіабельного важкого ланцюга і визначуваним за Кебатом першим каркасом важкого ланцюга.
12. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 11, де вказаний ключовий залишок вибраний з групи, яка складається з H1, H12, H24, H27, H29, H37, H48, H49, H67, H71, H73, H76, H78, L13, L43, L58, L70 і L80.
13. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 12, де заміна амінокислоти VH вибрана з групи, яка складається з Q1E, I12V, A24V, G27F, I29L, V29F, F29L, I37V, I48L, V48L, S49G, V67L, F67L, V71K, R71K, T73N, N76S, L78I або F78I.
14. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 12, де заміна амінокислоти VL вибрана з групи, яка складається з V13L, A43S, I58V, E70D і S80P.
15. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, де вказаний зв′язувальний білок містить два варіабельні домени, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO:24 і SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:24 і SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:25 і SEQ ID NO:26; або SEQ ID NO:25 і SEQ ID NO:27.
16. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, де вказані зв′язувальний білок або його антигензв’язувальний фрагмент модулюють біологічну функцію TNF-α.
17. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, де вказані зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент нейтралізують TNF-α.
18. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, де вказані зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент зменшують здатність TNF-α зв′язуватися з його рецептором.
19. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 18, де вказані зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент зменшують здатність про-TNF-α людини, зрілого TNF-α людини або укороченого TNF-α людини зв′язуватися з їх рецептором.
20. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, де вказані зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент зменшують продукування одного або більше TNF-залежних цитокінів; знищення TNF-залежних клітин; TNF-залежне запалення; TNF-залежну ерозію кісток і TNF-залежне ушкодження хряща.
21. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, де вказані зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент мають константу швидкості асоціації (Kon) щонайменше приблизно 106 М-1с-1, як виміряно з використанням поверхневого плазмонного резонансу.
22. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, де вказані зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент мають константу швидкості дисоціації (Koff) якнайбільше приблизно 10-3 с-1, як виміряно з використанням поверхневого плазмонного резонансу.
23. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, де вказаний зв′язувальний білок має константу асоціації (KD) якнайбільше 10-9 М, як виміряно з використанням поверхневого плазмонного резонансу.
24. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, де вказані зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент містять константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну: константний домен IgМ людини, константний домен IgG1 людини, константний домен IgG2 людини, константний домен IgG3 людини, константний домен IgG4 людини, константний домен IgG5 людини або константний домен IgЕ людини.
25. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 24, де вказаний константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну являє собою константний домен IgG1 людини.
26. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1 або 24, де вказані зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент додатково містять константний домен легкого ланцюга імуноглобуліну, який містить константний домен Ig-каппа людини або константний домен Ig-лямбда людини.
27. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 25, де вказаний константний домен IgG1 людини містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:3.
28. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 26, де вказаний константний домен Ig-каппа людини містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4, або вказаний константний домен Ig-лямбда людини містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:5.
29. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, які додатково містять:
константну важку область імуноглобуліну (Ig), що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:3;
константну легку область Ig, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4 або SEQ ID NO:5;
варіабельну важку область Ig, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:24, 25, 28, 29, 30, 31, 32 і 33; і
варіабельну легку область Ig, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:26, 27, 34, 35 і 36.
30. Гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, де вказані зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент вибрані з групи, яка складається з: молекули імуноглобуліну, Fv, зв′язаного дисульфідом Fv, моноклонального антитіла, scFv, химерного антитіла, антитіла, що містить єдиний домен, CDR-трансплантованого антитіла, діатіла, гуманізованого антитіла, мультиспецифічного антитіла, Fab, подвійного специфічного антитіла, Fab′-фрагмента, біспецифічного антитіла, F(ab′)2-фрагмента, DVD-Ig™, бівалентного фрагмента, що містить два Fab-фрагменти, зв′язані дисульфідним містком у шарнірній області; Fd-фрагмента, що складається з доменів VH і CH1; Fv-фрагмента, що складається з доменів VL і VH єдиного плеча антитіла, dAb-фрагмента і одноланцюжкового антитіла.
31. Кристалізований зв′язувальний білок, який містить зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1, де вказані зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент знаходяться у формі кристала.
32. Кристалізований зв′язувальний білок за п. 31, де кристал є вільним від носія фармацевтичним кристалом регульованого вивільнення.
33. Кристалізований зв′язувальний білок за п. 31, де вказані зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент мають більший час напівжиття in vivo, ніж розчинна копія вказаних зв′язувального білка або його антигензв′язувального фрагмента.
34. Композиція для вивільнення TNF-α-зв′язувального білка, яка містить: (a) препарат, де вказаний препарат містить зв’язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1 або 31 і один інгредієнт; і (b) щонайменше один полімерний носій.
35. Композиція за п. 34, де вказаний інгредієнт вибраний із групи, що складається з: альбуміну, сахарози, трегалози, лактиту, желатину, гідроксипропіл-β-циклодекстрину, метоксиполіетиленгліколю і поліетиленгліколю.
36. Композиція за п. 34, де вказаний полімерний носій являє собою полімер, вибраний з групи, що складається з: поліакрилової кислоти, поліціаноакрилату, поліамінокислоти, поліангідриду, полідепсипептиду, простого поліефіру, полімолочної кислоти, співполімерів молочної і гліколевої кислоти, полі-β-гідроксибутирату, полікапролактону, полідіоксанону; поліетиленгліколю, полігідроксипропілметакриламіду, поліорганофосфазену, поліортоефірів, полівінілового спирту, полівінілпіролідону, співполімерів малеїнового ангідриду-алкілвінілового ефіру, поліолів плюроніку, альбуміну, альгінату, целюлози і похідних целюлози, колагену, фібрину, желатину, гіалуронової кислоти, олігосахаридів, глікаміногліканів, сульфатованих полісахаридів і їх сумішей і співполімерів.
37. Конструкт TNF-α-зв′язувального білка, який містить гуманізований зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1 і лінкер або константний домен імуноглобуліну.
38. Конструкт TNF-α-зв′язувального білка за п. 37, де вказані зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент є глікозильованими.
39. Конструкт зв′язувального білка за п. 37, де вказаний конструкт зв′язувального білка являє собою конструкт кристалізованого TNF-α-зв′язувального білка.
40. Конструкт TNF-α-зв′язувального білка за п. 39, де вказаний конструкт кристалізованого TNF-α-зв′язувального білка являє собою фармацевтичний конструкт, що не має носія, кристалізованого TNF-α-зв′язувального білка з регульованим вивільненням.
41. Конструкт TNF-α-зв′язувального білка за п. 37, де вказаний конструкт зв′язувального білка має більший час напівжиття in vivo, ніж розчинна копія вказаного конструкта зв′язувального білка.
42. Кон′югат TNF-α-зв′язувального білка, який містить конструкт TNF-α-зв′язувального білка за п. 37 і молекулу імуноадгезії, візуалізуючий агент, терапевтичний агент і цитотоксичний агент.
43. Кон′югат TNF-a-зв′язувального білка за п. 42, де вказаний візуалізуючий агент являє собою радіомітку, фермент, флуоресцентну мітку, люмінесцентну мітку, біолюмінесцентну мітку, магнітну мітку або біотин.
44. Кон′югат TNF-a-зв′язувального білка за п. 43, де вказана радіомітка вибрана з групи, яка складається з 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho і 153Sm.
45. Кон′югат TNF-α-зв′язувального білка за п. 42, де вказаний терапевтичний агент або цитотоксичний агент являють собою антиметаболіт, алкілувальний агент, антибіотик, фактор росту, цитокін, антиангіогенний агент, антимітотичний агент, антрациклін, токсин або апоптотичний агент.
46. Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує зв′язувальний білок, що містить амінокислотну послідовність за п. 1.
47. Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує конструкт TNF-α-зв′язувального білка, що містить амінокислотну послідовність за п. 37.
48. Вектор, який містить виділену нуклеїнову кислоту за п. 46 або 47.
49. Вектор за п. 48, де вказаний вектор вибраний із групи, що складається з pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV і pBJ.
50. Клітина-хазяїн, яка містить вектор за п. 48.
51. Клітина-хазяїн за п. 50, де вказана клітина-хазяїн являє собою прокаріотичну клітину.
52. Клітина-хазяїн за п. 50, де вказана клітина-хазяїн являє собою еукаріотичну клітину.
53. Клітина-хазяїн за п. 52, де вказана еукаріотична клітина вибрана з групи, яка складається з: клітини одноклітинного організму, клітини тварини, клітини рослини, клітини гриба або клітини дріжджів, клітини ссавця, клітини птаха і клітини комахи.
54. Клітина-хазяїн за п. 52, де вказана еукаріотична клітина вибрана з групи, яка складається з: клітини СНО, клітини COS і клітини Saccharomyces cerevisiae.
55. Спосіб одержання білка, який зв′язує TNF-α, причому вказаний спосіб включає стадії культивування клітини-хазяїна за п. 50 у культуральному середовищі в умовах, достатніх для продукування зв′язувального білка, який зв′язує TNF-α.
56. TNF-α-зв′язувальний білок, одержаний способом за п. 55.
57. Фармацевтична композиція, яка містить зв′язувальний білок або його антигензв′язувальний фрагмент за п. 1 і фармацевтично прийнятний носій.
58. Фармацевтична композиція за п. 57, де вказаний фармацевтично прийнятний носій діє як ад′ювант.
59. Фармацевтична композиція за п. 58, де вказаний ад′ювант являє собою гіалуронідазу.
60. Фармацевтична композиція за п. 57, яка додатково містить щонайменше один додатковий терапевтичний агент, для лікування порушення, при якому активність TNF-α є шкідливою.
61. Фармацевтична композиція за п. 60, де вказаний додатковий агент являє собою терапевтичний агент, візуалізуючий агент, цитотоксичний агент, інгібітор ангіогенезу, інгібітор кінази, інгібітор молекул костимуляції, інгібітор молекул адгезії, анти-цитокін-антитіло або його функціональний фрагмент, метотрексат, циклоспорин, рапаміцин, FK506, детектовану мітку, детектований репортер, антагоніст TNF-α, антиревматичний агент; міорелаксант, наркотичний засіб, нестероїдний протизапальний лікарський засіб (NSAID), аналгетик, анестетик, седативний засіб, локальний анестетик, нейром′язовий блокатор, антимікробний агент, антипсоріатичний засіб, кортикостероїд, анаболічний стероїд, еритропоетин, імунізуючу речовину, імуноглобулін, імуносупресивний агент, гормон росту, лікарський засіб, що замінює гормон, радіофармацевтичний засіб, антидепресант, антипсихотичний засіб, стимулятор, засіб для лікування астми, бета-агоніст, інгальовний стероїд, пероральний стероїд, епінефрин або його аналог, цитокін і антагоніст цитокіну.
62. Спосіб лікування ссавця, який включає стадію введення зазначеному ссавцю ефективної кількості фармацевтичної композиції за п. 57.
63. Спосіб зменшення активності TNF-α людини, який включає стадію приведення TNF-α людини в контакт із зв′язувальним білком за п. 1 таким чином, що активність TNF-α людини зменшується.
64. Спосіб зменшення активності TNF-α людини у суб′єкта-людини, що страждає на порушення, при якому активність TNF-α є шкідливою, причому спосіб включає стадію введення зазначеному суб′єкту-людині зв′язувального білка за п. 1 таким чином, що активність TNF-α людини у суб′єкта-людини зменшується і/або досягається лікування.
65. Спосіб лікування пацієнта, що страждає на порушення, при якому активність TNF-α є шкідливою, який включає стадію введення зв′язувального білка за п. 1 до, одночасно або після введення другого агента, де другий агент являє собою антитіло або його фрагмент, здатний зв′язувати IL-12 людини; PGE2; LPA; NGF; CGRP; SubP; RAGE; гістамін; інгібітор рецептора гістаміну; брадикінін; IL-1-альфа; IL-1-бета; VEGF; PLGF; метотрексат; кортикостероїд, модулятор рецептора глюкокортикоїду; циклоспорин, рапаміцин, FK506 або нестероїдний протизапальний агент.
66. Спосіб за п. 65, де вказаним порушенням є респіраторне порушення; астма; алергічна і неалергічна астма; астма, що виникає внаслідок інфікування; астма внаслідок інфікування респіраторно-синцитіальним вірусом (RSV); хронічне обструктивне захворювання легень (COPD); стан, що включає запалення дихальних шляхів; еозинофілія; фіброз і надлишкове продукування слизу; муковісцидоз; фіброз легень; атопічне порушення; атопічний дерматит; кропивниця; екзема; алергічний риніт; алергічний ентерогастрит; запальний і/або аутоімунний стан шкіри; запальний і/або аутоімунний стан шлунково-кишкових органів; запальні захворювання травного тракту (IBD); виразковий коліт; хвороба Крона; запальний і/або аутоімунний стан печінки; цироз печінки; фіброз печінки; фіброз печінки, що викликається вірусом гепатиту В і/або С; склеродермія; пухлини або види раку; гепатоцелюлярна карцинома; гліобластома; лімфома; лімфома Ходжкіна; вірусна інфекція; бактеріальна інфекція; паразитарна інфекція; HTLV-1-інфекція; супресія прояву протективних імунних реакцій типу 1 і супресія прояву протективної реакції типу 1 під час вакцинації.
67. Спосіб за п. 65, де вказане порушення вибране з групи, що складається з: ревматоїдного артриту, остеоартриту, ювенільного хронічного артриту, септичного артриту, артриту Лайма, псоріатичного артриту, реактивного артриту, спондилоартропатії, системного червоного вовчака, хвороби Крона, виразкового коліту, запального захворювання травного тракту, інсулінозалежного цукрового діабету, тиреоїдиту, астми, алергічних захворювань, псоріазу, дерматичної склеродермії, захворювання трансплантат проти хазяїна, відторгнення трансплантата, гострого або хронічного імунного захворювання, асоційованого з трансплантацією органів, саркоїдозу, атеросклерозу, дисемінованого внутрішньосудинного згортання, хвороби Кавасакі, хвороби Грейвса, нефротичного синдрому, синдрому хронічної утоми, гранулематозу Вегенера, хвороби (пурпури) Шенлейна-Геноха, мікроскопічного васкуліту нирок, хронічного активного гепатиту, увеїту, септичного шоку, синдрому токсичного шоку, синдрому сепсису, кахексії, інфекційних захворювань, паразитарних захворювань, синдрому набутого імунодефіциту, гострого поперечного мієліту, хореї Гентінгтона, хвороби Паркінсона, хвороби Альцгеймера, інсульту, первинного біліарного цирозу, гемолітичної анемії, злоякісностей, серцевої недостатності, інфаркту міокарда, Аддісонової хвороби, спорадичної, плюригландулярної недостатності типу I і плюригландулярної недостатності типу II, синдрому Шмідта, (гострого) респіраторного дистрес-синдрому дорослих, алопеції, гніздової (осередкової) алопеції, серонегативної артропатії, артропатії, синдрому Рейтера, псоріатичної артропатії, пов′язаної з виразковим колітом артропатії, ентеропатичного синовіту, асоційованої з Chlamydia, Yersinia і Salmonella артропатії, спондилоартропатії, атероматозного захворювання/артеріосклерозу, атопічної алергії, аутоімунного полікістозного захворювання, звичайної пухирчатки, листоподібної пухирчатки, пемфігоїду, лінійного ІgА-захворювання, аутоімунної гемолітичної анемії, анемії з позитивною реакцією Кумбса, набутої перніціозної злоякісної анемії (хвороби Аддісона-Бірмера), ювенільної перніціозної анемії, міалгічного енцефаліту/британського міалгічного енцефаломієліту, хронічного кандидозу шкіри і слизових оболонок, гігантоклітинного артеріїту, первинного склерозуючого гепатиту, криптогенного аутоімунного гепатиту, синдрому набутого імунодефіциту, хвороб, споріднених з набутим імунодефіцитом, гепатиту В, гепатиту С, загального варіабельного імунодефіциту (загальної варіабельної гіпогаммаглобулінемії), дилатаційної кардіоміопатії, жіночої безплідності, недостатності яєчників, передчасної декомпенсації яєчників, фіброзного захворювання легень, криптогенного фіброзуючого альвеоліту, післязапального інтерстиціального захворювання легень, інтерстиціальної пневмонії, асоційованого з запаленням сполучної тканини інтерстиціального захворювання легень, змішаного асоційованого з захворюванням сполучної тканини захворювання легень, асоційованого із системним склерозом інтерстиціального захворювання легень, асоційованого з ревматоїдним артритом інтерстиціального захворювання легень, асоційованого із системним червоним вовчаком захворювання легень, асоційованого з дерматоміозитом/поліміозитом захворювання легень, асоційованого з хворобою Шегрена захворювання легень, асоційованого з анкілозуючим спондилітом захворювання легень, васкулітного дифузійного захворювання легень, асоційованого з гемосидерозом захворювання легень, індукованого лікарським засобом інтерстиціального захворювання легень, фіброзу, променевого фіброзу, констриктивного (облітеруючого) бронхіоліту, хронічної еозинофільної пневмонії, лімфоцитарного інфільтраційного захворювання легень, постінфекційного інтерстиціального захворювання легень, подагричного артриту, аутоімунного гепатиту, аутоімунного гепатиту типу 1 (класичного аутоімунного або вовчакового гепатиту), аутоімунного гепатиту типу 2 (гепатиту з анти-LKM-антитілом), аутоімунно-опосередкованої гіпоглікемії, інсулінорезистентності типу В з чорним акантозом, гіпопаратиреозу, гострого імунного захворювання, асоційованого з трансплантацією органів, хронічного імунного захворювання, асоційованого з трансплантацією органів, остеоартрозу, первинного склерозуючого холангіту, псоріазу типу 1, псоріазу типу 2, ідіопатичної лейкопенії, аутоімунної нейтропенії, захворювання нирок NOS (без уточнення діагнозу), гломерулонефриту, мікроскопічного васкуліту нирок, хвороби Лайма, дискоїдного червоного вовчака, чоловічої безплідності, ідіопатичної або NOS (без уточнення діагнозу), аутоімунності сперми, розсіяного склерозу (усіх підтипів), симпатичної офтальмії, легеневої гіпертензії, вторинної відносно захворювання сполучної тканини, синдрому Гудпасчера, легеневого прояву вузликового поліартеріїту, ревматичної атаки, ревматоїдного спондиліту, хвороби Стілла, системного склерозу, синдрому Шегрена, хвороби Такаясу (хвороби відсутності пульсу)/артеріїту, аутоімунної тромбоцитопенії, ідіопатичної тромбоцитопенії, аутоімунного захворювання щитовидної залози, гіпертиреозу, хронічного аутоімунного гіпотиреозу (хвороби Хашимото), атрофічного аутоімунного гіпотиреозу, первинної мікседеми, факогенного увеїту, первинного васкуліту, вітиліго, гострого захворювання печінки, хронічних захворювань печінки, алкогольного цирозу, індукованого алкоголем ушкодження печінки, холеостазу, ідіосинкратичного захворювання печінки, індукованого лікарським засобом гепатиту, неалкогольного стеатогепатиту, алергії й астми, стрептококової інфекції групи В (GBS), психічних порушень (наприклад, депресії і шизофренії), Th2-типу і Th1-типу опосередкованих захворювань, гострого і хронічного болю (різних форм болю) і таких типів раку, як рак легені, молочної залози, шлунка, сечового міхура, ободової кишки, підшлункової залози, яєчника, передміхурової залози і ректального раку і гемопоетичних злоякісностей (лейкозу і лімфоми), абеталіпопротеїнемії, акроціанозу, гострих і хронічних паразитарних або інфекційних процесів, гострого лейкозу, гострого лімфобластного лейкозу (ALL), гострого мієлоїдного лейкозу (AML), гострої або хронічної бактеріальної інфекції, гострого панкреатиту, гострої ниркової недостатності, аденокарцином, передсердної екстрасистолії, комплексу СНІД-деменція, індукованого алкоголем гепатиту, алергічного кон’юнктивіту, алергічного контактного дерматиту, алергічного риніту, відторгнення трансплантата, альфа-1-антитрипсин-1-індукованої недостатності, аміотрофічного латерального склерозу, анемії, стенокардії, дегенерації клітин переднього рога, анти-CD3-терапії, антифосфоліпідного синдрому, алергічних антирецепторних реакцій, аневризми аорти і периферичних судин, вирізання ділянки аорти, артеріальної гіпертензії, артеріосклерозу, артеріовенозної фістули, атаксії, фібриляції передсердь (безупинної або пароксизмальної), тріпотіння передсердь, атріовентрикулярної блокади, B-клітинної лімфоми, відторгнення кісткових трансплантатів, відторгнення трансплантатів кісткового мозку (BMT), блокади ніжок пучків Гіса, лімфоми Беркітта, опіків, серцевих аритмій, синдрому оглушеного гострою ішемією міокарда, серцевих пухлин, кардіоміопатії, запальної реакції екстракорпорального кровообігу, відторгнення трансплантата хряща, мозочково-кортикальних дегенерацій, мозочкових порушень, хаотичної або політопної передсердної тахікардії, асоційованих з хіміотерапією порушень, хронічного мієлоцитарного лейкозу (CML), хронічного алкоголізму, хронічних запальних патологій, хронічного лімфоцитарного лейкозу (CLL), хронічного обструктивного легеневого захворювання (COPD), хронічної інтоксикації саліцилатом, колоректальної карциноми, застійної серцевої недостатності, кон′юнктивітів, контактних дерматитів, легеневого серця (cor pulmonale), хвороби коронарної артерії, хвороби Крейтцфельдта-Якоба, культуронегативного сепсису, муковісцидозу, асоційованих з терапією цитокінами порушень, деменції боксерів, демієлінізуючих захворювань, геморагічної пропасниці денге, дерматиту, дерматологічних станів, діабету, цукрового діабету, діабетичного артеріосклеротичного захворювання, хвороб поширених (дифузійних) тілець Леві, застійної (дилатаційної) кардіоміопатії, порушень базальних ядер (головного мозку), синдрому Дауна в середньому віці, індукованих лікарським засобом порушень руху, індукованих лікарськими засобами, що блокують рецептори допаміну ЦНС, чутливості до лікарських засобів, екземи, енцефаломієліту, ендокардиту, ендокринопатії, епіглотиту, інфекції вірусу Епштейна-Барра, еритромелалгії, екстрапірамідальних і мозочкових порушень, спадкового гемофагоцитарного лімфогістіоцитозу, відторгнення імплантата фетального тимуса, спадкової атаксії Фридрейха, функціональних порушень периферичних артерій, грибкового сепсису, газової гангрени, виразки шлунка, гломерулярного нефриту, відторгнення трансплантата будь-яких органів або тканини, грамнегативного сепсису, грампозитивного сепсису, гранульом внаслідок внутрішньоклітинних організмів, злоякісного (гістіоцитарного) ретикулоендотеліозу, хвороби Галлервордена-Шпатца, тиреоїдиту Хашимото, сінної пропасниці, відторгнення серцевого трансплантата, гемохроматозу, гемодіалізу, гемолітичного уремічного синдрому/тромболітичної тромбоцитопенічної пурпури, кровотечі, гепатиту (А), аритмій пучків Гіса, ВІЛ-інфекції/ВІЛ-нейропатії, хвороби Ходжкіна, гіперкінетичних порушень руху, алергічних реакцій, алергічного пневмоніту, гіпертензії, гіпокінетичних порушень руху, діагностики системи гіпоталамуса-гіпофіза-надниркової залози, ідіопатичної хвороби Аддісона, ідіопатичного пневмофіброзу, антитіло-опосередковуваної цитотоксичності, астенії, дитячої спінально-м′язової атрофії, запалення аорти, грипу А, впливу іонізуючої радіації, іридоциститу/увеїту/ретробульбарного невриту, ішемії-реперфузійного ушкодження, ішемічного інсульту, ювенільного ревматоїдного артриту (JRA), ювенільної спінально-м′язової атрофії, саркоми Капоші, відторгнення трансплантата нирки, Legionella, лейшманіозу, прокази, ушкоджень кортико-спинномозкової системи, жирового набряку, відторгнення трансплантата печінки, лімфедеми, малярії, злоякісної лімфоми, злоякісного гістіоцитозу, злоякісної меланоми, менінгіту, менінгококемії, метаболічної/ідіопатичної мігрені (головного болю), мітохондріального мультисистемного порушення, комплексного захворювання сполучної тканини, моноклональної гаммапатії, множинної мієломи, дегенерацій множинних систем (Menzel, Dejerine-Thomas, Shy-Drager і Machado-Joseph), важкої псевдопаралітичної міастенії, Mycobacterium avium intracellulare, Мусоbасtеrіum tuberculosis, синдрому мієлодисплазії, інфаркту міокарда, ішемічних порушень міокарда, носоглоткової карциноми, неонатального хронічного захворювання легень, нефриту, піонефрозу, нейродегенеративних захворювань, нейрогенних м′язових атрофій І, нейтропенічної пропасниці, неходжкінської лімфоми, оклюзії черевної аорти і її гілок, оклюзійних артеріальних порушень, OKT3®-терапії, орхіту/епідидиміту, оборотних процедур орхіту/вазектомії, збільшення органа, остеопорозу, відторгнення трансплантата підшлункової залози, панкреатичної карциноми, злоякісності паранеопластичного синдрому/гіперкальціємії, відторгнення трансплантата паращитовидної залози, запального захворювання порожнини таза, хронічного алергічного риніту, перикардіального захворювання, периферичного атеросклеротичного захворювання, периферичних васкулярних порушень, перитоніту, перніціозної анемії, пневмонії Pneumocystis carinii, пневмонії, синдрому POEMS (синдрому поліневропатії, збільшення органів, ендокринопатії, моноклональної гаммапатії і синдрому шкірних змін), постперфузійного синдрому, постгемодіалізного синдрому, синдрому пост-МІ-кардіотомії, прееклампсії, прогресуючого супрануклеарного паралічу, первинної легеневої гіпертензії, променевої терапії, синдрому і захворювання Рейно, хвороби Рейно, хвороби Рефсума, регулярної вузької QRS-тахікардії, реноваскулярної гіпертензії, реперфузійного ушкодження, рестриктивної кардіоміопатії, сарком, склеродермії, старечої хореї, сенільної деменції типу тілець Леві, серонегативних артропатій, шоку, анемії із серпоподібними еритроцитами, відторгнення трансплантата шкіри, синдрому змін шкіри, відторгнення трансплантата тонкої кишки, солідних пухлин, специфічних аритмій, спинномозкової атаксії, спинномозочкових дегенерацій, стрептококового міозиту, структурних ушкоджень мозочка, підгострого склерозуючого паненцефаліту, синкопі (непритомності), сифілісу серцево-судинної системи, системної анафілаксії, системного синдрому запальної реакції, системного виникнення ювенільного ревматоїдного артриту, T-клітинних або FAB ALL, телеангіектазії, облітеруючого тромбоангіїту, тромбоцитопенії, токсичності, трансплантатів, травми/кровотечі, алергічних реакцій типу III, алергії типу IV, нестабільної стенокардії, уремії, уросепсису, кропивниці, пороків клапана серця, варикозних вен, васкуліту, венозних захворювань, венозного тромбозу, фібриляції шлуночків, вірусних і грибкових інфекцій, вірусного енцефаліту/асептичного менінгіту, вірусно-асоційованого гемофагоцитарного синдрому, синдрому Верніке-Корсакофф, захворювання Уїлсона, відторгнення ксенотрансплантата будь-яких органів або тканини, гострих коронарних синдромів, гострого ідіопатичного поліневриту, гострої запальної демієлінізуючої полірадикулоневропатії, гострої ішемії, захворювання Стілла дорослих, кругової алопеції, анафілаксії, синдрому антифосфоліпідних антитіл, апластичної анемії, артеріосклерозу, алокальної екземи, алокального дерматиту, аутоімунного дерматиту, аутоімунного порушення, асоційованого зі стрептококовою інфекцією, аутоімунної ентеропатії, аутоімунної втрати слуху, аутоімунного лімфопроліферативного синдрому (ALPS), аутоімунного міокардиту, аутоімунної передчасної недостатності яєчників, блефариту, бронхоектазу, бульозного пемфігоїду, серцево-судинного захворювання, катастрофічного антифосфоліпідного синдрому, глютенової хвороби, цервікального спондильозу, хронічної ішемії, рубцевого пемфігоїду, клінічно виділеного синдрому (CIS) з ризиком розсіяного склерозу, кон′юнктивіту, виникнення дитячого психіатричного порушення, хронічного обструктивного захворювання легень (COPD), дакріоциститу, дерматоміозиту, діабетичної ретинопатії, цукрового діабету, грижі міжхребцевого диска, пролапсу міжхребцевого диска, індукованої лікарським засобом гемолітичної анемії, ендокардиту, ендометріозу, ендофтальміту, епісклериту, поліморфної еритеми, великої поліформної еритеми, гестаційного пемфігоїду, синдрому Гійєна-Барре (GBS), полінозу (сінної пропасниці), синдрому Хугеса, ідіопатичної хвороби Паркінсона, ідіопатичної інтерстиціальної пневмонії, IgE-опосередкованої алергії, імунної гемолітичної анемії, міозиту тілець включення, інфекційного очного запального захворювання, запального демієлінізуючого захворювання, запальної хвороби серця, запальної хвороби нирок, IPF/UIP, іриту, кератиту, сухого кератокон′юнктивіту, хвороби Кусмауля-Мейєра, паралічу Ландрі, гістіоцитозу клітин Лангерганса, сітчастого ліведо, дегенерації жовтої плями, мікроскопічної поліангіопатії, хвороби Бехтерєва, порушень моторних нейронів, пемфігоїду слизових оболонок, недостатності множинних органів, важкої псевдопаралітичної міастенії, синдрому мієлоплазії, міокардиту, порушень нервових корінців, невропатії, не-А, не-В гепатиту, ретробульбарного невриту, остеолізу, раку яєчника, ювенільного ревматоїдного артриту (JRA) нечисленних суглобів, оклюзивного захворювання периферичних артерій (PAOD), захворювання периферичних артерій (PVD), хвороби периферичних артерій (PAD), флебіту, вузликового поліартеріїту (або вузликового періартеріїту), поліхондриту, ревматичної поліміалгії, передчасного посивіння, полісуглобового JRA, синдрому поліендокринної недостатності, поліміозиту, ревматичної поліміалгії (PMR), постгемодіалізного синдрому, первинного паркінсонізму, раку передміхурової залози і ректального раку і гематопоетичних злоякісностей (лейкозу і лімфоми), простатиту, істинної еритроцитарної аплазії, первинної недостатності надниркових залоз, рецидивуючого нейромієліту зорового нерва, рестенозу, ревматичного захворювання серця, SAPHO (синовіту, акне, пустульозного висипання, гіперостозу й остеїту), склеродермії, вторинного амілоїдозу, синдрому шокової легені, склериту, ішіалгії, вторинної недостатності надниркових залоз, асоційованого з кремнієм захворювання сполучної тканини, дерматозу Снеддона-Уїлкінсона, анкілозуючого спондиліту, синдрому Стівенса-Джонсона (SJS), синдрому системної запальної реакції, артеріїту скроневих артерій, токсоплазмозного (хоріо) ретиніту, токсичного епідермального некролізу, поперечного мієліту, TRAPS (періодичного синдрому, асоційованого з рецептором фактора некрозу пухлин), алергічної реакції типу 1, діабету типу II, кропивниці, звичайної інтерстиціальної пневмонії (UIP), васкуліту, весняного кон′юнктивіту, вірусного ретиніту, синдрому Фогта-Коянагі-Харада (VKH-синдрому), вологої дегенерації жовтої плями, загоєння ран, асоційованої з Yersinia і Salmonella артропатії.
68. Спосіб лікування пацієнта, що страждає на порушення, при якому TNF-α є шкідливим, який включає стадію введення зв′язувального білка за п. 1 до, одночасно або після введення другого агента, де другий агент вибраний із групи, що складається з інгальовного стероїду; бета-агоніста; бета-агоніста короткої або тривалої дії; антагоніста лейкотриєнів і рецепторів лейкотриєнів; ADVAIR; інгібітора IgE; анти-IgE-антитіл; XOLAIR; інгібітора фосфодіестерази; інгібітора PDE4; ксантину; антихолінергічного лікарського засобу; стабілізуючого мастоцити агента, кромоліну; інгібітора IL-4; інгібітора IL-5; інгібіторів еотаксину/CCR3; антагоністів гістаміну або його рецепторів, що включають H1, H2, H3 і H4; антагоністів простагландину D або його рецепторів DPI і CRTH2; антагоністів TNF; розчинного фрагмента рецептора TNF; ENBREL; ферментного антагоніста TNF; інгібітора TNF-перетворювального ферменту (TACE); мускаринового антагоніста рецептора; антагоніста TGF-бета; інтерферону гамма; перфенідону; хіміотерапевтичного агента, метотрексату; лефлуноміду; сиролімусу (рапаміцину) або його аналога, інгібітора CCI-779; COX2 або cPLA2; NSAID; імуномодулятора; інгібітора p38; інгібітора TPL-2, MK-2 і NFkB; буденосиду; епідермального фактора росту; кортикостероїду; циклоспорину; сульфасалазину; аміносаліцилатів; 6-меркаптопурину; азатіоприну; метронідазолу; інгібітора ліпоксигенази; месаламіну; олсалазину; балсалазину; антиоксиданту; інгібітора тромбоксану; антагоніста рецептора IL-1; анти-IL-1β-антитіла; анти-IL-6-антитіла; фактора росту; інгібітора еластази; піридинілімідазольної сполуки; антитіла або агоніста LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, EMAP-II, GM-CSF, FGF або PDGF; антитіла CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 або їх ліганду; FK506; рапаміцину; мікофеноляту мофетилу; ібупрофену; преднізолону; інгібітора фосфодіестерази; агоніста аденозину; антитромботичного агента; інгібітора комплементу; адренергічного агента; інгібітора IRAK, NIK, IKK, p38 або MAP кінази; інгібітора IL-1β-перетворювального ферменту; інгібітора TNF-α-перетворювального ферменту; інгібітора передачі сигналу T-клітин; інгібітора металопротеїнази; 6-меркаптопурину; інгібітора ангіотензинперетворювального ферменту; розчинного рецептора цитокіну; розчинного TNF-рецептора р55; розчинного TNF-рецептора р75; sIL-1RII; sIL-1RII; sIL-6R; протизапального цитокіну; IL-4; IL-10; IL-11 або TGF-β.
69. Спосіб за будь-яким з пп. 64-68, де введення суб′єкту виконують щонайменше одним зі способів, вибраних із групи, що складається з парентерального, підшкірного, внутрішньом′язового, внутрішньовенного, внутрішньосуглобового, внутрішньобронхіального, внутрішньочеревного, внутрішньокапсульного (інтракапсулярного), внутрішньохрящового, внутрішньопорожнинного інтрацеліального, внутрішньомозочкового, інтрацеребровентрикулярного, усередину прямої кишки, інтрацервікального, внутрішньошлункового, внутрішньопечінкового, внутрішньоміокардіального, інтраостеального, внутрішньотазового, інтраперикардіального, інтраперитонеального, інтраплеврального, інтрапростатичного, внутрішньолегеневого, інтраректального, інтраренального, інтраретинального, інтраспінального, інтраторакального, внутрішньоматкового, внутрішньопузирного, болюсного, вагінального, ректального, букального, сублінгвального, інтраназального і трансдермального введення.
70. Спосіб визначення присутності TNF-α або його фрагмента в тестовому зразку імуноаналізом, де імуноаналіз включає приведення тестового зразка в контакт щонайменше з одним зв’язувальним білком або його фрагментом за п. 1 і щонайменше однією детектованою міткою.
71. Спосіб за п. 70, який додатково включає стадії:
(і) приведення тестового зразка в контакт щонайменше з одним зв′язувальним білком або його фрагментом, де зв′язувальний білок зв′язується з епітопом на TNF-α або його фрагменті, з утворенням, таким чином, першого комплексу;
(ii) приведення комплексу в контакт щонайменше з однією детектованою міткою, де детектована мітка зв′язується з епітопом на першому комплексі або на TNF-α або його фрагменті, що не зв′язаний зв′язувальним білком або його фрагментом, з утворенням другого комплексу; і
(iii) детектування присутності TNF-α або його фрагмента в тестовому зразку на основі сигналу, генерованого детектованою міткою в другому комплексі, де присутність TNF-α або його фрагмента безпосередньо корелює із сигналом, генерованим детектованою міткою.
72. Спосіб за п. 70, який додатково включає стадії:
(і) приведення тестового зразка в контакт щонайменше з одним зв′язувальним білком або його фрагментом, де зв′язувальний білок зв′язується з епітопом на TNF-α або його фрагменті, з утворенням, таким чином, першого комплексу;
(ii) приведення комплексу в контакт щонайменше з однією детектованою міткою, де детектована мітка конкурує з TNF-α або його фрагментом за зв′язування зі зв′язувальним білком або його фрагментом, з утворенням, таким чином, другого комплексу; і
(iii) детектування присутності TNF-α або його фрагмента в тестовому зразку на основі сигналу, генерованого детектованою міткою в другому комплексі, де присутність TNF-α або його фрагмента опосередковано корелює з сигналом, генерованим детектованою міткою.
73. Спосіб за п. 70, який необов′язково додатково включає діагностування, прогнозування або оцінювання ефективності терапевтичного/профілактичного лікування пацієнта.
Текст
Реферат: Винахід належить до виділеного зв'язувального білка, зокрема антитіла і його антигензв'язувальної частини, що зв'язується з фактором-альфа некрозу пухлин (TNF-α), зокрема TNF-α людини, відповідної композиції і молекули на основі антитіла, фармацевтичної композиції, що містить вказане антитіло, а також до терапевтичних і діагностичних способів застосування цього антитіла. UA 107490 C2 (12) UA 107490 C2 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресне посилання на споріднену заявку За даною заявкою вимагається пріоритет згідно із заявкою на патент США 61/321633, поданою 7 квітня 2010 року, яка, тим самим, спеціально включена в даний опис за допомогою посилання у всій її повноті для будь-якої мети. Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується TNF-α-зв'язувальних білків і їх застосування в попередженні і/або лікуванні гострих і хронічних імунологічний захворювань, таких як ревматоїдний артрит, остеоартрит, псоріаз, розсіяний склероз і інші аутоімунні захворювання. Рівень техніки У даній галузі існує потреба в поліпшених антитілах, здатних зв'язувати TNF-α (також званий фактором некрозу пухлин, фактором-альфа некрозу пухлин, фактором-α некрозу пухлин, TNF і кахектином). У одному варіанті здійснення антитіла здатні нейтралізувати TNF-α. Даний винахід надає нове сімейство зв'язувальних білків, CDR-трансплантованих антитіл, гуманізованих антитіл і їх фрагментів, здатних до зв'язування TNF-α, зв'язування TNF-α з високою афінністю і зв'язування і нейтралізації TNF-α. Суть винаходу Даний винахід стосується TNF-α-зв'язувальних білків, зокрема анти-TNF-α-антитіл або їх антигензв'язувальних частин, які зв'язують TNF-α. У одному варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язувальна частина, здатні зв'язувати TNF-α, містять амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO:22-36. У одному аспекті даний винахід надає гуманізований зв'язувальний білок, який містить антигензв'язувальний домен, здатний зв'язувати TNF-α людини, причому антигензв'язувальний домен містить щонайменше одну CDR, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: залишків 31-35 SEQ ID NO:22; залишків 50-65 SEQ ID NO:22; залишків 98-106 SEQ ID NO:22; залишків 24-34 SEQ ID NO:23; залишків 50-56 SEQ ID NO:23 і залишків 89-97 SEQ ID NO:23, де зв'язувальний білок містить акцепторний каркас людини. У одному варіанті здійснення зв'язувальний білок містить щонайменше 3 CDR, наприклад містить набір CDR варіабельного домену, вибраний з групи, що складається з: (a) залишків 31-35 SEQ ID NO:22, залишків 50-65 SEQ ID NO:22 і залишків 98-106 SEQ ID NO:22, і (b) залишків 24-34 SEQ ID NO:23, залишків 50-56 SEQ ID NO:23 і залишків 89-97 SEQ ID NO:23. У конкретних варіантах здійснення антигензв'язувальний домен містить амінокислотну послідовність, що містить залишки 31-35 SEQ ID NO:22; залишки 50-65 SEQ ID NO:22; залишки 98-106 SEQ ID NO:22; залишки 24-34 SEQ ID NO:23; залишки 50-56 SEQ ID NO:23 і залишки 89-97 SEQ ID NO:23. У одному варіанті здійснення антигензв'язувальний домен містить область VH, наприклад, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: SEQ ID NO:24, 25, 28, 29, 30, 31, 32 і 33. У іншому варіанті здійснення антигензв'язувальний домен містить область VL, наприклад, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: SEQ ID NO:26, 27, 34, 35 і 36. У одному конкретному варіанті здійснення антигензв'язувальний домен містить область VH і область VL, де, наприклад, область VH містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: SEQ ID NO:24, 25, 28, 29, 30, 31, 32 і 33, і область VL містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: SEQ ID NO:26, 27, 34, 35 і 36. У одному варіанті здійснення акцепторний каркас людини містить щонайменше одну амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: SEQ ID NO:6-21. В одному конкретному варіанті здійснення акцепторний каркас людини містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: SEQ IN NO:9, 10, 11, 12, 15, 16, 17 і 21. У іншому варіанті здійснення акцепторний каркас людини містить щонайменше одну амінокислотну заміну каркасної області, де амінокислотна послідовність каркаса щонайменше на 65 % ідентична послідовності акцепторного каркаса людини і містить щонайменше 70 амінокислотних залишків, ідентичних акцепторному каркасу людини. У іншому варіанті здійснення акцепторний каркас людини містить щонайменше одну амінокислотну заміну каркасної області в ключовому залишку, причому ключовий залишок вибраний з групи, що складається з: залишку, суміжного з CDR; залишку сайта глікозилування; рідкого залишку; залишку, здатного взаємодіяти з TNF-α людини; залишку, здатного взаємодіяти зCDR; канонічного залишку; контактного залишку між варіабельною областю важкого ланцюга і варіабельною областю легкого ланцюга; залишку в зоні Vernier і залишку в області, яка перекривається між визначуваною за Чотія CDR1 варіабельного важкого ланцюга і визначуваним за Кебатом першим каркасом важкого ланцюга. У одному варіанті здійснення ключовий залишок вибраний з групи, що складається з: H1, H12, H24, H27, H29, H37, H48, H49, H67, H71, H73, H76, H78, L13, L43, L58, L70 і L80. У одному варіанті здійснення мутація VH 1 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вибрана з групи, що складається з: Q1E, I12V, A24V, G27F, I29L, V29F, F29L, 137V, I48L, V48L, S49G, V67L, F67L, V71K, R71K, T73N, N76S, L78I і F78I. У іншому варіанті здійснення мутація VL вибрана з групи, що складається з: V13L, A43S, I58V, E70D і S80P. У одному варіанті здійснення зв'язувальний білок містить два варіабельних домени, де два варіабельних домени мають амінокислотні послідовності, вибрані з групи, що складається з: SEQ ID NO:24 і SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:24 і SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:25 і SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:25 і SEQ ID NO:27. У одному варіанті здійснення зв'язувальний білок зв'язує TNF-α. У іншому варіанті здійснення зв'язувальний білок модулює біологічну функцію TNF-α. У іншому варіанті здійснення зв'язувальний білок нейтралізує TNF-α. Ще в одному варіанті здійснення зв'язувальний білок зменшує здатність TNF-α зв'язуватися з його рецептором, наприклад зв'язувальний білок зменшує здатність про-TNF-α людини, зрілого TNF-α людини або укороченого TNF-α людини зв'язуватися з його рецептором. Ще в одному іншому варіанті здійснення зв'язувальний білок зменшує одну або більше біологічних активностей TNF-α, вибраних з: TNF-залежного продукування цитокінів; TNF-залежного знищення цитокінів; TNFзалежного запалення; TNF-залежної ерозії кісток і TNF-залежного пошкодження хряща. У одному варіанті здійснення зв'язувальний білок має константу швидкості асоціації (K on), 2 -1 -1 вибрану з групи, що складається з: щонайменше приблизно 10 M с ; щонайменше приблизно 3 -1 -1 4 -1 -1 5 -1 -1 10 M с ; щонайменше приблизно 10 M с ; щонайменше приблизно 10 M с і щонайменше 6 -1 -1 приблизно 10 M с , як виміряно з використанням поверхневого плазмонного резонансу. У іншому варіанті здійснення зв'язувальний білок має константу швидкості дисоціації (K off), -3 -1 -4 вибрану з групи, що складається з: якнайбільше приблизно 10 с , якнайбільше приблизно 10 -1 -5 -1 -6 -1 с , якнайбільше приблизно 10 с і якнайбільше приблизно 10 с , як виміряно з використанням поверхневого плазмонного резонансу. Ще в одному іншому варіанті здійснення зв'язувальний білок має константу дисоціації (KD), вибрану з групи, що складається з: якнайбільше приблизно -7 -8 -9 10 M; якнайбільше приблизно 10 M; якнайбільше приблизно 10 M; якнайбільше приблизно -10 -11 -12 -13 10 M; якнайбільше приблизно 10 M; якнайбільше приблизно 10 M і якнайбільше 10 M. У одному варіанті здійснення зв'язувальний білок містить константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну, вибраний з групи, що складається з: константного домену IgМ людини, константного домену IgG1 людини, константного домену IgG2 людини, константного домену IgG3 людини, константного домену IgG4 людини, константного домену IgA людини і константного домену IgЕ людини. У одному конкретному варіанті здійснення домен константної області важкого ланцюга імуноглобуліну являє собою константний домен IgG1 людини. У іншому варіанті здійснення зв'язувальний білок додатково містить константний домен легкого ланцюга імуноглобуліну, вибраний з групи, що складається з: константного домену Ig-каппа людини і константного домену Ig-лямбда людини. Наприклад, в одному варіанті здійснення зв'язувальний білок містить константний домен імуноглобуліну, який має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 і SEQ ID NO:5. У одному конкретному варіанті здійснення константний домен IgG1 містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:3. У іншому варіанті здійснення домен константної області легкого ланцюга імуноглобуліну являє собою константний домен Ig-каппа людини, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4. Ще в одному варіанті здійснення домен константної області легкого ланцюга імуноглобуліну являє собою константний домен Ig-лямбда людини, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:5. У одному конкретному варіанті здійснення винахід надає зв'язувальний білок, здатний зв'язувати TNF-α людини, причому зв'язувальний білок містить константну важку область Ig, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:3; константну легку область Ig, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO:4 і SEQ ID NO:5; варіабельну важку область Ig, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: SEQ ID NO:24, 25, 28, 29, 30, 31, 32 і 33; і варіабельну легку область Ig, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: SEQ ID NO:26, 27, 34, 35 і 36. У одному конкретному варіанті здійснення зв'язувальний білок вибраний з групи, що складається з: молекули імуноглобуліну, Fv, зв'язаного дисульфідом Fv, моноклонального антитіла, scFv, химерного антитіла, що містить єдиний домен антитіла, CDR-трансплантованого антитіла, діатіла, гуманізованого антитіла, мультиспецифічного антитіла, Fab, подвійного специфічного антитіла, Fab'-фрагмента, біспецифічного антитіла, F(ab')2-фрагмента, DVD-Ig™, бівалентного фрагмента, що містить два Fab-фрагменти, зв'язаних дисульфідним містком в шарнірній області; Fd-фрагмента, що складається з доменів VH і CH1; Fv-фрагмента, що складається з доменів VL і VH єдиного плеча антитіла, dAb-фрагмента, виділеної області, що визначає комплементарність (CDR), і 2 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одноланцюжкового антитіла. У іншому аспекті даний винахід надає кристалізований зв'язувальний білок, який містить зв'язувальний білок даного винаходу, де зв'язувальний білок знаходиться у формі кристала. У одному варіанті здійснення кристал являє собою вільний від носія фармацевтичний кристал регульованого вивільнення. У іншому варіанті здійснення зв'язувальний білок має більший час напівжиття in vivo, ніж розчинна копія зв'язувального білка. У іншому варіанті здійснення зв'язувальний білок зберігає біологічну активність. У іншому аспекті даний винахід надає композицію для вивільнення TNF-α-зв'язувального білка, причому композиція містить: (a) препарат, де препарат містить кристалізований зв'язувальний білок даного винаходу і один інгредієнт; і (b) щонайменше один полімерний носій. У одному варіанті здійснення полімерний носій являє собою полімер, вибраний з однієї або більше груп, що складаються з: поліакрилової кислоти, поліціаноакрилату, поліамінокислоти, поліангідриду, полідепсипептиду, поліефіру, полімолочної кислоти, співполімерів молочної і гліколевої кислоти, полі-β-гідроксибутирату, полікапролактону, полідіоксанону; поліетиленгліколю, полігідроксипропілметакриламіду, поліорганофосфазену, поліортоефірів, полівінілового спирту, полівінілпіролідону, співполімерів малеїнового ангідриду-алкілвінілового ефіру, плюронікових поліолів, альбуміну, альгінату, целюлози і похідних целюлози, колагену, фібрину, желатину, гіалуронової кислоти, олігосахаридів, глікаміногліканів, сульфатованих полісахаридів і їх сумішей і співполімерів. У іншому варіанті здійснення інгредієнт вибраний з групи, що складається з альбуміну, сахарози, трегалози, лактиту, желатину, гідроксипропіл-βциклодекстрину, метоксиполіетиленгліколю і поліетиленгліколю. У іншому аспекті даний винахід надає конструкт TNF-α-зв'язувального білка, який містить TNF-α-зв'язувальний білок даного винаходу і поліпептид, вибраний з групи, що складається з лінкера і константного домену імуноглобуліну. У одному варіанті здійснення зв'язувальний білок має патерн глікозилування людини. У іншому варіанті здійснення конструкт зв'язувального білка являє собою кристалізований конструкт TNF-α-зв'язувального білка. Ще в одному варіанті здійснення кристалізований конструкт TNF-α-зв'язувального білка являє собою фармацевтичний кристалізований конструкт TNF-α-зв'язувального білка, що не має носія, з регульованим вивільненням. У одному конкретному варіанті здійснення конструкт TNF-αзв'язувального білка має більший період напівжиття in vivo, ніж розчинна копія конструкта зв'язувального білка. У іншому варіанті здійснення конструкт TNF-α-зв'язувального білка зберігає біологічну активність. У іншому аспекті даний винахід надає кон'югат TNF-α-зв'язувального білка, що містить конструкт TNF-α-зв'язувального білка даного винаходу і додатково містить агент, вибраний з групи, що складається з: молекули імуноадгезії, візуалізуючого агента, терапевтичного агента і цитотоксичного агента. У одному варіанті здійснення агент являє собою візуалізуючий агент, вибраний з групи, що складається з радіомітки, ферменту, флуоресцентної мітки, люмінесцентної мітки, біолюмінесцентної мітки, магнітної мітки і біотину. У одному варіанті 3 здійснення візуалізуючий агент являє собою радіомітку, вибрану з групи, що складається з: H, 14 35 90 99 111 125 131 177 166 153 C, S, Y, Tc, In, I, I, Lu, Ho і Sm. У іншому варіанті здійснення агент являє собою терапевтичний або цитотоксичний агент, вибраний з групи, що складається з: антиметаболіту, алкілувального агента, антибіотика, фактора росту, цитокіну, антиангіогенного агента, антимітотичного агента, антрацикліну, токсину і апоптотичного агента. У іншому аспекті даний винахід надає виділену нуклеїнову кислоту, яка кодує зв'язувальний білок даного винаходу. У іншому аспекті даний винахід надає вектор, який містить виділену нуклеїнову кислоту даного винаходу. У одному варіанті здійснення вектор вибраний з групи, що складається з pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV і pBJ. У одному варіанті здійснення винахід надає клітину-хазяїна, яка містить вектор даного винаходу. У іншому варіанті здійснення клітина-хазяїн являє собою прокаріотичну клітину, наприклад Е. coli. У іншому варіанті здійснення клітина-хазяїн являє собою еукаріотичну клітину, наприклад клітину одноклітинного організму (протиста), клітину тварини, клітину рослини або клітину гриба. У іншому варіанті здійснення еукаріотичною клітиною є клітина тварини, вибрана з групи, що складається з клітини ссавця, клітини птаха і клітини комахи. Наприклад, клітина-хазяїн являє собою клітину СНО, клітину COS, дріжджову клітину, наприклад Saccharomyces cerevisiae, або клітину Sf9 комахи. У іншому аспекті даний винахід надає спосіб одержання білка, який зв'язує TNF-α, який включає стадії культивування клітини-хазяїна даного винаходу в культуральному середовищі в умовах, достатніх для продукування зв'язувального білка, який зв'язує TNF-α, а також TNF-αзв'язувальний білок, продукований даним способом. У іншому аспекті даний винахід надає фармацевтичну композицію, яка містить 3 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язувальний білок даного винаходу і фармацевтично прийнятний носій. У одному варіанті здійснення фармацевтично прийнятний носій функціонує як ад'ювант, використовуваний для збільшення абсорбції або дисперсії зв'язувального білка. У іншому варіанті здійснення ад'ювантом є гіалуронідаза. У іншому варіанті здійснення фармацевтична композиція додатково містить щонайменше один додатковий терапевтичний агент для лікування порушення, при якому активність TNF-α є шкідливою, наприклад терапевтичний агент, візуалізуючий агент, цитотоксичний агент, інгібітор ангіогенезу, інгібітор кінази, інгібітор молекул костимуляції, інгібітор молекул адгезії, анти-цитокін-антитіло або його функціональний фрагмент, метотрексат, циклоспорин, рапаміцин, FK506, детектовану мітку, детектований репортер, антагоніст TNF-α, антиревматичний агент; міорелаксант, наркотичний засіб, нестероїдний протизапальний лікарський засіб (NSAID), аналгетик, анестетик, седативний засіб, локальний анестетик, нейром'язовий блокатор, антимікробний агент, антипсоріатичний засіб, кортикостероїд, анаболічний стероїд, еритропоетин, імунізуючу речовину, імуноглобулін, імуносупресивний агент, гормон росту, лікарський засіб, що замінює гормон, радіофармацевтичний засіб, антидепресант, антипсихотичний засіб, стимулятор, засіб для лікування астми, бета-агоніст, інгальовний стероїд, пероральний стероїд, епінефрин або його аналог, цитокін і антагоніст цитокіну. У іншому аспекті даний винахід надає спосіб лікування ссавця, який включає стадію введення вказаному ссавцю ефективної кількості фармацевтичної композиції даного винаходу. У іншому варіанті здійснення винахід забезпечує спосіб зменшення активності TNF-α людини, який включає стадію: приведення TNF-α людини в контакт зі зв'язувальним білком даного винаходу таким чином, що активність TNF-α людини зменшується. У іншому варіанті здійснення винахід забезпечує спосіб зменшення активності TNF-α людини у суб'єкта-людини, що страждає порушенням, при якому активність TNF-α є шкідливою, причому спосіб включає стадію введення суб'єкту-людині зв'язувального білка даного винаходу таким чином, що активність TNF-α людини у суб'єкта-людини зменшується. У іншому варіанті здійснення винахід забезпечує спосіб лікування суб'єкта, що страждає захворюванням або порушенням, при якому активність TNF-α є шкідливою, причому спосіб включає стадію введення вказаному суб'єкту зв'язувального білка даного винаходу таким чином, що досягається лікування. У іншому варіанті здійснення винахід надає спосіб лікування пацієнта, що страждає порушенням, при якому TNF-α є шкідливим, який включає стадію введення зв'язувального білка даного винаходу до, одночасно або після введення другого агента, де другий агент вибраний з групи, що складається з антитіла або його фрагмента, здатного зв'язувати IL-12 людини; PGE2; LPA; NGF; CGRP; SubP; RAGE; гістаміну; інгібітору рецептора гістаміну; брадикініну; IL-1-альфа; IL-1-бета; VEGF; PLGF; метотрексату; кортикостероїду, модулятора рецептора глюкокортикоїду; циклоспорину, рапаміцину, FK506, нестероїдного протизапального агента і склеростину. У одному варіанті здійснення порушення вибране з групи, що складається з респіраторного порушення; астми; алергічної і неалергічної астми; астми, що виникає внаслідок інфікування; астми внаслідок інфікування респіраторно-синцитіальним вірусом (RSV); хронічного обструктивного захворювання легень (COPD); стану, що включає запалення дихальних шляхів; еозинофілії; фіброзу і надмірного продукування слизу; муковісцидозу; фіброзу легень; атипового порушення; атопічного дерматиту; кропивниці; екземи; алергічного риніту; алергічного ентерогастриту; запального і/або аутоімунного стану шкіри; запального і/або аутоімунного стану шлунково-кишкових органів; запальних захворювань травного тракту (IBD); виразкового коліту; хвороби Крона; запального і/або аутоімунного стану печінки; цирозу печінки; фіброзу печінки; фіброзу печінки, що викликається вірусом гепатиту В і/або С; склеродермії; пухлин або типів раку; гепатоцелюлярної карциноми; гліобластоми; лімфоми; лімфоми Ходжкіна; вірусної інфекції; бактеріальної інфекції; паразитарної інфекції; HTLV-1-інфекції; супресії вияву протективних імунних реакцій типу 1 і супресії вияву протективної реакції типу 1 під час вакцинації. У одному варіанті здійснення порушення вибране з групи, що складається з: ревматоїдного артриту, остеоартриту, ювенільного хронічного артриту, септичного артриту, артриту Лайма, псоріатичного артриту, реактивного артриту, спондилоартропатії, системного червоного вовчака, хвороби Крона, виразкового коліту, запального захворювання травного тракту, інсулінозалежного цукрового діабету, тиреоїдиту, астми, алергічних захворювань, псоріазу, дерматичної склеродермії, захворювання трансплантат проти хазяїна, відторгнення трансплантата, гострого або хронічного імунного захворювання, асоційованого з трансплантацією органів, саркоїдозу, атеросклерозу, дисемінованого внутрішньосудинного згортання, хвороби Кавасакі, хвороби Грейвса, нефротичного синдрому, синдрому хронічної втоми, гранулематозу Вегенера, хвороби (пурпури) Шенлейна-Геноха, мікроскопічного васкуліту нирок, хронічного активного гепатиту, увеїту, септичного шоку, синдрому набутого 4 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імунодефіциту, гострого поперечного мієліту, хореї Гентінгтона, хвороби Паркінсона, хвороби Альцгеймера, інсульту, первинного біліарного цирозу, гемолітичної анемії, злоякісності, серцевої недостатності, інфаркту міокарда, Аддісонової хвороби, спорадичної плюригландулярної недостатності типу I і плюригландулярної недостатності типу II, синдрому Шмідта, респіраторного дистрес-синдрому дорослих, алопеції, гніздової (осередкової) алопеції, серонегативної артропатії, артропатії, синдрому Рейтера, псоріатичної артропатії, пов'язаної з виразковим колітом артропатії, ентеропатичного синовіту, асоційованої з Chlamydia, Yersinia і Salmonella артропатії, спондилоартропатії, атероматозного захворювання/артеріосклерозу, алокальної алергії, аутоімунного полікістозного захворювання, звичайної пухирчатки, листоподібної пухирчатки, пемфігоїду, лінійного IgА-захворювання, аутоімунної гемолітичної анемії, анемії з позитивною реакцією Кумбса, набутої перніціозної злоякісної анемії (хвороби Аддісона-Бірмера), ювенільної перніціозної анемії, міалгічного енцефаліту/британського міалгічного енцефаломієліту, хронічного кандидозу шкіри і слизових оболонок, гігантоклітинного артеріїту, первинного склерозуючого гепатиту, криптогенного аутоімунного гепатиту, синдрому набутого імунодефіциту, хвороб, споріднених з набутим імунодефіцитом, гепатиту В, гепатиту С, загального варіабельного імунодефіциту (загальної варіабельної гіпогаммаглобулінемії), дилатаційної кардіоміопатії, жіночої безплідності, недостатності яєчників, передчасної декомпенсації яєчників, фіброзного захворювання легень, криптогенного фіброзуючого альвеоліту, післязапального інтерстиціального захворювання легень, інтерстиціальної пневмонії, асоційованого із запаленням сполучної тканини інтерстиціального захворювання легень, змішаного асоційованого із захворюванням сполучної тканини захворювання легень, асоційованого з системним склерозом інтерстиціального захворювання легень, асоційованого з ревматоїдним артритом інтерстиціального захворювання легень, асоційованого з системним червоним вовчаком захворювання легень, асоційованого з дерматоміозитом/поліміозитом захворювання легень, асоційованого з хворобою Шегрена захворювання легень, асоційованого з анкілозуючим спондилітом захворювання легень, васкулітного дифузного захворювання легень, асоційованого з гемосидерозом захворювання легень, індукованого лікарським засобом інтерстиціального захворювання легень, фіброзу, променевого фіброзу, констриктивного (облітеруючого) бронхіоліту, хронічної еозинофільної пневмонії, лімфоцитарного інфільтраційного захворювання легень, постінфекційного інтерстиціального захворювання легень, подагричного артриту, аутоімунного гепатиту, аутоімунного гепатиту типу 1 (класичного аутоімунного або вовчакового гепатиту), аутоімунного гепатиту типу 2 (гепатиту з анти-LKMантитілом), аутоімунно-опосередкованої гіпоглікемії, інсулінорезистентності типу В з чорним акантозом, гіпопаратиреозу, гострого імунного захворювання, асоційованого з трансплантацією органів, хронічного імунного захворювання, асоційованого з трансплантацією органів, остеоартрозу, первинного склерозуючого холангіту, псоріазу типу 1, псоріазу типу 2, ідіопатичної лейкопенії, аутоімунної нейтропенії, захворювання нирок NOS (без уточнення діагнозу), гломерулонефриту, мікроскопічного васкуліту нирок, хвороби Лайма, дискоїдного червоного вовчака, чоловічої безплідності, ідіопатичної або NOS (без уточнення діагнозу), аутоімунності сперми, розсіяного склерозу (всіх підтипів), симпатичної офтальмії, легеневої гіпертензії, вторинної відносно захворювання сполучної тканини, синдрому Гудпасчера, легеневого вияву вузликового поліартеріїту, ревматичної атаки, ревматоїдного спондиліту, хвороби Стілла, системного склерозу, синдрому Шегрена, хвороби Такаясу (хвороби відсутності пульсу)/артеріїту, аутоімунної тромбоцитопенії, ідіопатичної тромбоцитопенії, аутоімунного захворювання щитовидної залози, атрофічного аутоімунного гіпотиреозу, первинної мікседеми, факогенного увеїту, первинного васкуліту, вітиліго, гострого захворювання печінки, хронічних захворювань печінки, алкогольного цирозу, індукованого алкоголем пошкодження печінки, холеостазу, ідіосинкратичного захворювання печінки, індукованого лікарським засобом гепатиту, неалкогольного стеатогепатиту, алергії і астми, стрептококової інфекції групи В (GBS), психічних порушень (наприклад, депресії і шизофренії), Th2-типу і Th1-типу опосередкованих захворювань, гострого і хронічного болю (різних форм болю) і таких типів раку, як рак легені, молочної залози, шлунка, сечового міхура, ободової кишки, підшлункової залози, яєчника, передміхурової залози і ректального раку і гемопоетичних злоякісностей (лейкозу і лімфоми), абеталіпопротеїнемії, акроціанозу, гострих і хронічних паразитарних або інфекційних процесів, гострого лейкозу, гострого лімфобластного лейкозу (ALL), гострого мієлоїдного лейкозу (AML), гострої або хронічної бактеріальної інфекції, гострого панкреатиту, гострої ниркової недостатності, аденокарцином, передсердної екстрасистолії, комплексу СНІД-деменція, індукованого алкоголем гепатиту, алергічного кон'юнктивіту, алергічного контактного дерматиту, алергічного риніту, відторгнення трансплантата, альфа-1-антитрипсин-1-індукованої недостатності, аміотрофічного латерального склерозу, анемії, стенокардії, дегенерації клітин 5 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переднього рога, анти-CD3-терапії, антифосфоліпідного синдрому, алергічних антирецепторних реакцій, аневризми аорти і периферичних судин, вирізання ділянки аорти, артеріальної гіпертензії, артеріосклерозу, артеріовенозної фістули, атаксії, фібриляції передсердь (безперервної або пароксизмальної), тріпотіння передсердь, атріовентрикулярної блокади, Вклітинної лімфоми, відторгнення кісткових трансплантатів, відторгнення трансплантатів кісткового мозку (BMT), блокади ніжок пучків Гіса, лімфоми Беркітта, опіків, серцевих аритмій, синдрому оглушеного гострою ішемією міокарда, серцевих пухлин, кардіоміопатії, запальної реакції екстракорпорального кровообігу, відторгнення трансплантата хряща, мозочковокортикальних дегенерацій, мозочкових порушень, хаотичної або політопної передсердної тахікардії, асоційованих з хіміотерапією порушень, хронічного мієлоцитарного лейкозу (CML), хронічного алкоголізму, хронічних запальних патологій, хронічного лімфоцитарного лейкозу (CLL), хронічного обструктивного легеневого захворювання (COPD), хронічної інтоксикації саліцилатом, колоректальної карциноми, застійної серцевої недостатності, кон'юнктивітів, контактних дерматитів, легеневого серця (cor pulmonale), хвороби коронарної артерії, хвороби Крейтцфельдта-Якоба, культуронегативного сепсису, муковісцидозу, асоційованих з терапією цитокінами порушень, деменції боксерів, демієлінізуючих захворювань, геморагічної пропасниці денге, дерматиту, дерматологічних станів, діабету, цукрового діабету, діабетичного артеріосклеротичного захворювання, хвороб поширених (дифузних) тілець Леві, застійної (дилатаційної) кардіоміопатії, порушень базальних ядер (головного мозку), синдрому Дауна в середньому віці, індукованих лікарським засобом порушень руху, індукованих лікарськими засобами, які блокують рецептори допаміну ЦНС, чутливості до лікарських засобів, екземи, енцефаломієліту, ендокардиту, ендокринопатії, епіглотиту, інфекції вірусу Епштейна-Барра, еритромелалгії, екстрапірамідальних і мозочкових порушень, спадкового гемофагоцитарного лімфогістіоцитозу, відторгнення імплантата фетального тимуса, спадкової атаксії Фридрейха, функціональних порушень периферичних артерій, грибкового сепсису, газової гангрени, виразки шлунка, гломерулярного нефриту, відторгнення трансплантата будь-якого органа або тканини, грамнегативного сепсису, грампозитивного сепсису, гранульом внаслідок внутрішньоклітинних організмів, злоякісного (гістіоцитарного) ретикулоендотеліозу, хвороби Галлервордена-Шпатца, тиреоїдиту Хашимото, сінної пропасниці, відторгнення серцевого трансплантата, гемохроматозу, гемодіалізу, гемолітичного уремічного синдрому/тромболітичної тромбоцитопенічної пурпури, кровотечі, гепатиту (А), аритмій пучків Гіса, ВІЛ-інфекції/ВІЛнейропатії, хвороби Ходжкіна, гіперкінетичних порушень руху, алергічних реакцій, алергічного пневмоніту, гіпертензії, гіпокінетичних порушень руху, діагностики системи гіпоталамусагіпофіза-надниркової залози, ідіопатичної хвороби Аддісона, ідіопатичного пневмофіброзу, антитіло-опосередковуваної цитотоксичності, астенії, дитячої спінально-м'язової атрофії, запалення аорти, грипу А, впливу іонізуючої радіації, іридоциститу/увеїту/ретробульбарного невриту, ішемії-реперфузійного пошкодження, ішемічного інсульту, ювенільного ревматоїдного артриту, ювенільної спінально-м'язової атрофії, саркоми Капоші, відторгнення трансплантата нирки, Legionella, лейшманіозу, прокази, пошкоджень кортико-спинномозкової системи, жирового набряку, відторгнення трансплантата печінки, лімфедеми, малярії, злоякісної лімфоми, злоякісного гістіоцитозу, злоякісної меланоми, менінгіту, менінгококемії, метаболічної/ідіопатичної мігрені (головного болю), мітохондріального мультисистемного порушення, комплексного захворювання сполучної тканини, моноклональної гаммапатії, множинної мієломи, дегенерацій множинних систем (Menzel, Dejerine-Thomas, Shy-Drager і Machado-Joseph), важкої псевдопаралітичної міастенії, Mycobacterium avium intracellulare, Мycobacterium tuberculosis, синдрому мієлодисплазії, інфаркту міокарда, ішемічних порушень міокарда, носоглоткової карциноми, неонатального хронічного захворювання легень, нефриту, піонефрозу, нейродегенеративних захворювань, нейрогенних м'язових атрофій І, нейтропенічної пропасниці, неходжкінської лімфоми, оклюзії черевної аорти і її гілок, оклюзійних артеріальних порушень, OKT3®-терапії, орхіту/епідидиміту, оборотних процедур орхіту/вазектомії, збільшення органа, остеопорозу, відторгнення трансплантата підшлункової залози, панкреатичної карциноми, злоякісності паранеопластичного синдрому/гіперкальціємії, відторгнення трансплантата паращитовидної залози, запального захворювання порожнини таза, хронічного алергічного риніту, перикардіального захворювання, периферичного атеросклеротичного захворювання, периферичних васкулярних порушень, перитоніту, перніціозної анемії, пневмонії Pneumocystis carinii, пневмонії, синдрому POEMS (синдрому поліневропатії, збільшення органів, ендокринопатії, моноклональної гаммапатії і синдрому шкірних змін), постперфузійного синдрому, постгемодіалізного синдрому, синдрому пост-MIкардіотомії, прееклампсії, прогресуючого супрануклеарного паралічу, первинної легеневої гіпертензії, променевої терапії, синдрому і захворювання Рейно, хвороби Рейно, хвороби 6 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рефсума, регулярної вузької QRS-тахікардії, реноваскулярної гіпертензії, реперфузійного пошкодження, рестриктивної кардіоміопатії, сарком, склеродермії, старечої хореї, сенільної деменції типу тілець Леві, серонегативних артропатій, шоку, анемії з серпоподібними еритроцитами, відторгнення трансплантата шкіри, синдрому змін шкіри, відторгнення трансплантата тонкої кишки, солідних пухлин, специфічних аритмій, спинномозкової атаксії, спиномозочкових дегенерацій, стрептококового міозиту, структурних пошкоджень мозочка, підгострого склерозуючого паненцефаліту, синкопі (непритомності), сифілісу серцево-судинної системи, системної анафілаксії, системного синдрому запальної реакції, системного виникнення ювенільного ревматоїдного артриту, Т-клітинної або FAB ALL, телеангіектазії, облітеруючого тромбоангіїту, тромбоцитопенії, токсичності, трансплантатів, травми/кровотечі, алергічних реакцій типу III, алергії типу IV, нестабільної стенокардії, уремії, уросепсису, кропивниці, пороків клапана серця, варикозних вен, васкуліту, венозних захворювань венозного тромбозу, фібриляції шлуночків, вірусних і грибкових інфекцій, вірусного енцефаліту/асептичного менінгіту, вірусно-асоційованого гемофагоцитарного синдрому, синдрому Верніке-Корсакофф, захворювання Уїлсона, відторгнення ксенотрансплантата будь-яких органів або тканини, гострих коронарних синдромів, гострого ідіопатичного поліневриту, гострої запальної демієлінізуючої полірадикулоневропатії, гострої ішемії, захворювання Стілла дорослих, кругової алопеції, анафілаксії, синдрому антифосфоліпідних антитіл, апластичної анемії, артеріосклерозу, алокальної екземи, алокального дерматиту, аутоімунного дерматиту, аутоімунного порушення, асоційованого зі стрептококовою інфекцією, аутоімунної ентеропатії, аутоімунної втрати слуху, аутоімунного лімфопроліферативного синдрому, (ALPS), аутоімунного міокардиту, аутоімунної передчасної недостатності яєчників, блефариту, бронхоектазу, бульозного пемфігоїду, серцево-судинного захворювання, катастрофічного антифосфоліпідного синдрому, глютенової хвороби, цервікального спондильозу, хронічної ішемії, рубцевого пемфігоїду, клінічно виділеного синдрому (CIS) з ризиком розсіяного склерозу, кон'юнктивіту, виникнення дитячого психіатричного порушення, хронічного обструктивного захворювання легень (COPD), дакріоциститу, дерматоміозиту, діабетичної ретинопатії, цукрового діабету, грижі міжхребцевого диска, пролапсу міжхребцевого диска, індукованої лікарським засобом гемолітичної анемії, ендокардиту, ендометріозу, ендофтальміту, епісклериту, поліморфної еритеми, великої поліформної еритеми, гестаційного пемфігоїду, синдрому Гійєна-Барре (GBS), полінозу (сінної пропасниці), синдрому Хугеса, ідіопатичної хвороби Паркінсона, ідіопатичної інтерстиціальної пневмонії, IgE-опосередкованої алергії, імунної гемолітичної анемії, міозиту тілець включення, інфекційного очного запального захворювання, запального демієлінізуючого захворювання, запальної хвороби серця, запальної хвороби нирок, IPF/UIP, іриту, кератиту, сухого кератокон'юнктивіту, хвороби Кусмауля-Мейєра, паралічу Ландрі, гістіоцитозу клітин Лангерганса, сітчастого ліведо, дегенерації жовтої плями, мікроскопічної поліангіопатії, хвороби Бехтерєва, порушень моторних нейронів, пемфігоїду слизових оболонок, недостатності множинних органів, важкої псевдопаралітичної міастенії, синдрому мієлоплазії, міокардиту, порушень нервових корінців, невропатії, не-А, не-В гепатиту, ретробульбарного невриту, остеолізу, раку яєчника, ювенільного ревматоїдного артриту (JRA) нечисленних суглобів, оклюзивного захворювання периферичних артерій (PAOD), захворювання периферичних артерій (PVD), хвороби периферичних артерій (PAD), флебіту, вузликового поліартеріїту (або вузликового періартеріїту), поліхондриту, ревматичної поліміалгії, передчасного посивіння, полісуглобового JRA, синдрому полі ендокринної недостатності, поліміозиту, ревматичної поліміалгії (PMR), постгемодіалізного синдрому, первинного паркінсонізму, раку передміхурової залози і ректального раку, і гематопоетичних злоякісностей (лейкозу і лімфоми), простатиту, істинної еритроцитарної аплазії, первинної недостатності надниркових залоз, рецидивуючого нейромієліту зорового нерва, рестенозу, ревматичного захворювання серця, SAPHO (синовіту, акне, пустульозного висипання, гіперостозу і остеїту), склеродермії, вторинного амілоїдозу, синдрому шокової легені, склериту, ішіалгії, вторинної недостатності надниркових залоз, асоційованого з кремнієм захворювання сполучної тканини, дерматозу Снеддона-Уїлкінсона, анкілозуючого спондиліту, синдрому Стівенса-Джонсона (SJS), синдрому системної запальної реакції, артеріїту скроневих артерій, токсоплазмозного (хоріо) ретиніту, токсичного епідермального некролізу, поперечного мієліту, TRAPS (періодичного синдрому, асоційованого з рецептором фактора некрозу пухлин), алергічної реакції типу 1, діабету типа II, кропивниці, звичайної інтерстиціальної пневмонії (UIP), васкуліту, весняного кон'юнктивіту, вірусного ретиніту, синдрому Фогта-Коянагі-Харада (VKH-синдрому), вологої дегенерації жовтої плями, загоєння ран, асоційованої з Yersinia і Salmonella артропатії. У іншому варіанті здійснення винахід надає спосіб лікування пацієнта, що страждає порушенням, при якому TNF-α є шкідливим, який включає стадію введення зв'язувального білка 7 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 даного винаходу до, одночасно або після введення другого агента, де другий агент вибраний з групи, що складається з інгальовного стероїду; бета-агоніста; бета-агоніста короткої або тривалої дії; антагоніста лейкотриєнів або рецепторів лейкотриєнів; ADVAIR; інгібітору IgE; анти-IgE-антитіл; XOLAIR; інгібітору фосфодіестерази; інгібітору PDE4; ксантину; антихолінергічного лікарського засобу; стабілізуючого мастоцити агента, кромоліну; інгібітору IL4; інгібітору IL-5; інгібіторів еотаксину/CCR3; антагоністів гістаміну або його рецепторів, що включають H1, H2, H3 і H4; антагоністів простагландину D або його рецепторів DPI і CRTH2; антагоніста TNF; розчинного фрагмента рецептора TNF; ENBREL; ферментного антагоніста TNF; інгібітору TNF-перетворювального ферменту (TACE); мускаринового антагоніста рецептора; антагоніста TGF-бета; інтерферону гамма; перфенідону; хіміотерапевтичного агента, метотрексату; лефлуноміду; сиролімусу (рапаміцину) або його аналога, інгібітору CCI779; COX2 або cPLA2; NSAID; імуномодулятора; інгібітору p38; інгібітору TPL-2, MK-2 і NFkB; буденосиду; епідермального фактора росту; кортикостероїду; циклоспорину; сульфасалазину; аміносаліцилату; 6-меркаптопурину; азатіоприну; метронідазолу; інгібітору ліпоксигенази; месалміну; олсалазину; балсалазину; антиоксиданту; інгібітору тромбоксану; антагоніста рецептора IL-1; анти-IL-1β-антитіла; анти-IL-6-антитіла; фактора росту; інгібітору еластази; піридинілімідазольної сполуки; антитіла або антагоніста LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, EMAP-II, GM-CSF, FGF або PDGF; антитіл CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 або їх ліганду; FK506; рапаміцину; мікофеноляту мофетилу; ібупрофену; преднізолону; інгібітору фосфодіестерази; агоніста аденозину; антитромботичного агента; інгібітору комплементу; адренергічного агента; інгібітору IRAK, NIK, IKK, p38 або MAP кінази; інгібітору IL-1βперетворювального ферменту; інгібітору TNF-α-перетворювального ферменту; інгібітору передачі сигналу Т-клітин; інгібітору металопротеїнази; 6-меркаптопурину; інгібітору ангіотензинперетворювального ферменту; розчинного рецептора цитокіну; розчинного TNFрецептора р55; розчинного TNF-рецептора р75; sIL-1RI; sIL-1RII; sIL-6R; протизапального цитокіну; IL-4; IL-10; IL-11 і TGF-β. У одному варіанті здійснення зв'язувальний білок даного винаходу вводять суб'єкту щонайменше одним зі способів, вибраних з групи, що складається з парентерального, підшкірного, внутрішньом'язового, внутрішньовенного, внутрішньосуглобового, внутрішньобронхіального, внутрішньочеревного, внутрішньокапсульного (інтракапсулярного), внутрішньохрящового, внутрішньопорожнинного інтрацеліального, внутрішньомозочкового, інтрацеребровентрикулярного, всередину прямої кишки, інтрацервікального, внутрішньошлункового, внутрішньопечінкового, внутрішньоміокардіального, інтраостеального, внутрішньотазового, інтраперикардіального, інтраперитонеального, інтраплеврального, інтрапростатичного, внутрішньолегеневого, інтраректального, інтраренального, інтраретинального, інтраспінального, інтраторакального, внутрішньоматкового, внутрішньопузирного, болюсного, вагінального, ректального, букального, сублінгвального, інтраназального і трансдермального введення. Докладний опис даного винаходу Даний винахід стосується TNF-α-зв'язувальних білків, зокрема анти-TNF-α-антитіл або їх антигензв'язувальних частин, які зв'язують TNF-α (тобто фактор некрозу пухлин, фактор-альфа некрозу пухлин, TNF, кахектин). Різні аспекти даного винаходу стосуються антитіл і фрагментів антитіл і їх фармацевтичних композицій, а також нуклеїнових кислот, рекомбінантних експресуючих векторів і клітин-хазяїнів для одержання таких антитіл і фрагментів. Способи застосування антитіл даного винаходу для детектування TNF-α людини, для інгібування TNF-α людини in vitro або in vivo і для регуляції експресії гена або TNF-α-споріднених функцій також включені в даний винахід. Описані також композиції, які містять антитіла даного винаходу, а також способи застосування таких антитіл. Якщо не вказане інше, наукові і технічні терміни, використовувані в зв'язку з даним винаходом, будуть мати значення, які звичайно розуміються фахівцями в даній галузі. Однак значення і обсяг термінів повинні бути ясними, у випадку будь-якої прихованої двозначності, надані в даному описі визначення повинні бути переважними відносно будь-якого словникового або стороннього визначення. Крім того, якщо контекст не вимагає іншого, терміни в однині будуть включати множину, і терміни у множині будуть включати однину. У даному описі, використання "або" означає "і/або", якщо не вказане інше. Крім того, використання терміна "який включає", а також інших форм даного терміна, таких як "включає" і "включений", є необмежувальними. Крім того, такі терміни, як "елемент" або "компонент", включають як елементи і компоненти, які містять одну одиницю, так і елементи і компоненти, які містять 8 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 більше однієї субодиниці, якщо не вказане інше. Як правило, номенклатура, використовувана в зв'язку з описом і способами культивування клітин і тканини, патологією, онкологією, молекулярною біологією, імунологія, мікробіологією, генетикою і хімією білків і нуклеїнових кислот і гібридизацією, що описані в даному документі, є номенклатурою і способами, добре відомими і звичайно використовуваними в даній галузі. Способи і технології даного винаходу звичайно здійснюють відповідно до загальноприйнятих способів, добре відомих в даній галузі, описаних в різних основних і більш конкретних посиланнях, які цитуються і обговорюються протягом даного опису, якщо не вказане інше. Ферментні реакції і способи очищення здійснюють відповідно до описів виготовлювачів, як звичайно здійснюється в даній галузі або розкрито в даному описі. Номенклатура, використовувана в зв'язку з описом і лабораторними процедурами і способами аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії і медичної і фармацевтичної хімії, представленими в даному описі, є процедурами і способами, добре відомими і звичайно використовуваними в даній галузі. Для хімічних синтезів, хімічних аналізів, одержання фармацевтичних препаратів і доставки, і лікування пацієнтів використовуються стандартні способи. Для більш легкого розуміння даного винаходу вибрані терміни визначені нижче. Термін "поліпептид" стосується будь-якого полімерного ланцюга амінокислот. Терміни "пептид" і "білок" використовуються взаємозамінно з терміном поліпептид і також стосуються полімерного ланцюга амінокислот. Термін "поліпептид" включає нативні або штучні білки, фрагменти білків і поліпептидні аналоги послідовності білка. Поліпептид може бути мономерним або полімерним. Термін "виділений білок" або "виділений поліпептид" стосується білка або поліпептиду, які внаслідок їх походження або джерела деривації не асоційовані з природно асоційованими компонентами, які супроводжують їх в їх нативному стані; є по суті вільними від інших білків з того ж самого виду; експресуються клітиною з різних видів або не зустрічаються в природі. Таким чином, поліпептид, який синтезується хімічно або синтезується в клітинній системі, відмінній від клітини, з якої він походить природно, буде "виділеним" з його природно асоційованих компонентів. Білок може бути також представлений по суті вільним від природно асоційованих компонентів виділенням, з використанням методів очищення білків, добре відомих в даній галузі. Термін "витягання" стосується способу надання хімічних частинок, таких як поліпептид, по суті вільних від природно асоційованих компонентів, виділенням, наприклад, з використанням технологій очищення білків, добре відомих в даній галузі. Термін "TNF-α людини" (скорочуваний в даному описі як hTNF-α) включає тримірний білок цитокіну. Термін включає гомотримірний білок, що містить три TNF-α-білки 17,5 кД. Гомотримірний білок називають "TNF-α-білком". Термін "TNF-α" призначений для включення рекомбінантного TNF-α людини (rhTNF-α), який може бути одержаний стандартними способами рекомбінантної експресії. Послідовність TNF-α людини показана в таблиці 1. 40 45 50 "Біологічна активність" стосується всіх при таманних цитокіну біологічних властивостей. Біологічні властивості TNF-α включають, але не обмежуються ними, зв'язування рецептора TNF. Терміни "специфічне зв'язування" або "специфічно зв'язується", при посиланні на взаємодію антитіла, білка або пептиду з другою хімічною частинкою, означають, що дана взаємодія залежить від присутності конкретної структури (наприклад, антигенної детермінанти або епітопа) на хімічній частинці; наприклад антитіло розпізнає специфічну структуру білка і зв'язується зі специфічною структурою білка, а не з білком загалом. Якщо антитіло є специфічним відносно епітопа "A", присутність молекули, що містить епітоп А (або вільний, немічений А), в реакції, що містить мічений "A" і антитіло, буде зменшувати кількість міченого А, 9 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 зв'язаного з даним антитілом. Термін "антитіло" стосується в широкому значенні молекули будь-якого імуноглобуліну (Ig) або її антигензв'язувальної частини, що складається з чотирьох поліпептидних ланцюгів, двох важких (Н) ланцюгів і двох легких (L) ланцюгів, або будь-якого функціонального фрагмента, мутанта, варіанта або похідного, які зберігають незамінні епітопзв'язувальні ознаки молекули Ig. Такі формати мутанта, варіанта або похідного антитіла відомі в даній галузі. Необмежувальні варіанти здійснення їх обговорюються нижче. У одному повнорозмірному антитілі кожний важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (що скорочується як HCVR або VH) і константної області важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга складається з трьох доменів, CH1, CH2 і CH3. Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (що скорочується в даному описі як LCVR або VL) і константної області легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга складається з одного домену, CL. Області VH і VL можуть бути додатково поділені на області гіперваріабельності, звані областями, що визначають комплементарність (CDR), розсіяні між областями, які є більш консервативними, званими каркасними областями (FR). Кожна VH і VL складається з трьох CDR і чотирьох FR, розташованих від амінокінця до карбоксикінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Молекули імуноглобуліну можуть бути молекулами будь-якого типу (наприклад, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA і IgY), класу (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2) або підкласу. Термін "антигензв'язувальна частина" або "антигензв'язувальна область" антитіла (або просто "частина антитіла") стосується одного або більше фрагментів антитіла, які зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (наприклад, hTNF-α). Антигензв'язувальна функція антитіла може виконуватися фрагментами повнорозмірного антитіла. Такі варіанти антитіл можуть також мати біспецифічний, подвійно специфічний або мультиспецифічний формати, що специфічно зв'язуються з двома або більше різними антигенами. Приклади зв'язувальних фрагментів, охоплюваних терміном "антигензв'язувальна частина" антитіла, включають (i) Fab-фрагмент, моновалентний фрагмент, що складається з доменів VL, VH, CL і CH1; (ii) F(ab')2-фрагмент, бівалентний фрагмент, що містить два Fab-фрагменти, зв'язаних дисульфідним містком в шарнірній області; (iii) Fd-фрагмент, що складається з двох доменів VH і CH1; (iv) Fv-фрагмент, що складається з доменів VL і VH єдиного плеча антитіла, (v) dAbфрагмент (Ward et al. (1989), Nature, 341:544-546, Winter et al., PCT publication WO 90/05144 A1), який містить єдиний варіабельний домен; і (vi) виділену область, що визначає комплементарність (CDR). Крім того, хоч два домени Fv-фрагмента, VL і VH, кодуються окремими генами, вони можуть бути об'єднані з використанням рекомбінантних способів, синтетичним лінкером, який дозволяє їм знаходитися у вигляді єдиного ланцюга білка, в якому області VL і VH спарюються з утворенням моновалентних молекул (відомих як одноланцюжковий Fv (scFv); див., наприклад, Bird et al. (1988), Science 242:423-426; і Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Передбачається, що такі одноланцюжкові антитіла також включені в термін "антигензв'язувальна частина" антитіла. Інші форми одноланцюжкових антитіл, такі як діатіла, також включені в даний винахід. Діатіла є бівалентними, біспецифічними антитілами, в яких домени VH і VL експресуються на єдиному поліпептидному ланцюзі, але з використанням лінкера, який є дуже коротким, щоб дозволяти спарювання між двома доменами на одному і тому ж ланцюзі, примушуючи, таким чином, два домени спарюватися з комплементарними доменами іншого ланцюга і створювати два антигензв'язувальних сайти (див., наприклад, Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994), Structure 2:1121-1123). Такі зв'язуючі антитіло частини відомі в даній галузі (Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001), Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)). Термін "конструкт антитіла" стосується поліпептиду, що містить одну або більше антигензв'язувальних частин даного винаходу, зв'язаних з лінкерним поліпептидом або константним доменом імуноглобуліну. Лінкерні поліпептиди містять два або більше амінокислотних залишків, сполучених пептидними зв'язками, і використовуються для зв'язування однієї або більше антигензв'язувальних частин. Такі лінкерні поліпептиди добре відомі в даній галузі (див., наприклад, Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:64446448; Poljak et al. (1994), Structure 2:1121-1123). Константним доменом імуноглобуліну називають константний домен важкого або легкого ланцюга. Амінокислотні послідовності константного домену важкого ланцюга і легкого ланцюгів IgG людини відомі в даній галузі і представлені в таблиці 2. 10 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 Антитіло або його антигензв'язувальна частина може бути частиною більшої імуноадгезійної молекули, що утворена ковалентною або нековалентною асоціацією антитіла або частини антитіла з одним або декількома іншими білками або пептидами. Приклади таких імуноадгезійних молекул включають використання корової області стрептавідину для одержання тетрамерної молекули scFv (Kipriyanov et al. (1995), Hum. Antibod. Hybridomas 6:93101) і використання залишку цистеїну, маркерного пептиду і С-кінцевої полігістидинової мітки для одержання бівалентних і біотинільованих молекул scFv (Kipriyanov et al. (1994), Mol. Immunol. 31:1047-1058). Частини антитіл, такі як Fab- і F(ab')2-фрагменти, можуть бути одержані з цільних антитіл з використанням загальноприйнятих способів, таких як розщеплення цільних антитіл папаїном або пепсином, відповідно. Крім того, антитіла, частини антитіл і імуноадгезійні молекули можуть бути одержані з використанням стандартних способів рекомбінантних ДНК, як розкрито в даному описі. Термін "виділене антитіло" стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, які по суті вільні від інших антитіл, що мають відмінну антигенну специфічність (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язує hTNF-α, є по суті вільним від антитіл, які специфічно зв'язують антигени, інші ніж hTNF-α). Однак виділене антитіло, яке специфічно зв'язує hTNF-α, може мати перехресну реакційну здатність з іншими антигенами, такими як молекули TNF-α з інших видів. Крім того, виділене антитіло може бути по суті вільним від іншого клітинного матеріалу і/або інших хімічних речовин. Термін "антитіло людини" включає антитіла або їх антигензв'язувальні частини, які мають варіабельні і константні області, одержані з послідовностей імуноглобуліну зародкової лінії людини. Антитіла людини даного винаходу можуть включати амінокислотні залишки, що не кодуються послідовностями імуноглобуліну зародкової лінії людини (наприклад, мутації, що вводяться випадковим чином або сайт-специфічним мутагенезом in vitro, або соматична мутація in vivo), наприклад в CDR, зокрема CDR3. Однак термін "антитіло людини" не призначений для включення антитіл, в яких CDR-послідовності, одержані із зародкової лінії іншого виду ссавця, 11 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 такого як миша, були трансплантовані на каркасні послідовності людини. Термін "рекомбінантне антитіло людини" призначений для включення всіх антитіл людини або їх антигензв'язувальних частин, які готують, експресують, створюють або виділяють рекомбінантним способом, наприклад антитіл, експресованих з використанням рекомбінантного експресуючого вектора, трансфікованих в клітину-хазяїна, наприклад антитіл, виділених з рекомбінантної, комбінованої бібліотеки антитіл людини (Hoogenboom (1997), Trends Biotechnol. 15:62-70; Azzazy and Highsmith (2002), Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo and Larrick (2000), BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom and Chames (2000), Immunol. Today 21:371-378), антитіл, виділених з тварини (наприклад, миші), яка є трансгенною відносно генів імуноглобуліну людини (див., наприклад, Taylor et al. (1992), Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann and Green (2002), Current Opin. Biotechnol. 13:593-597; Little et al. (2000), Immunol. Today 21:364-370), або антитіл, одержаних, експресованих, створених або виділених будь-яким іншим способом, який включає сплайсинг послідовностей генів імуноглобуліну людини до інших ДНК-послідовностей. Такі рекомбінантні антитіла людини мають варіабельні і константні області, одержані з послідовності імуноглобуліну зародкової лінії людини. Однак в деяких варіантах здійснення такі рекомбінантні антитіла людини піддають мутагенезу in vitro (або, коли використовують тварину, трансгенну відносно послідовностей Ig людини, в соматичному мутагенезі in vivo), таким чином, амінокислотні послідовності областей VH і VL рекомбінантних антитіл є послідовностями, які, хоч і одержані з послідовностей VH і VL зародкової лінії людини, можуть природно не існувати в репертуарі зародкової лінії антитіла людини in vivo. Термін "химерне антитіло" стосується антитіл або їх антигензв'язувальних частин, які містять послідовності варіабельної області важкого і легкого ланцюгів з одного виду і послідовності константної області з іншого виду, такі як антитіла, що мають мишачі варіабельні області важкого і легкого ланцюгів, зв'язані з константними областями людини. Термін "CDR-трансплантоване антитіло" стосується антитіл або їх антигензв'язувальних частин, які містять послідовності варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів з одного виду, але в яких послідовності однієї або більше CDR-областей VH і/або VL замінені послідовностями CDR іншого виду, наприклад антитілами, що мають варіабельні області важкого і легкого ланцюгів, в яких одна або більше CDR людини (наприклад, CDR3) були замінені мишачими послідовностями CDR. Термін "гуманізоване антитіло" стосується антитіл або їх антигензв'язувальних частин, які містять послідовності варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів з виду нелюдини (наприклад, миші), але в яких щонайменше одна частина послідовності VH і/або VL була змінена, щоб стати більш "подібною до послідовності людини", тобто більш схожою з варіабельними послідовностями зародкової лінії людини. Одним типом гуманізованого антитіла є CDR-трансплантоване антитіло, в якому CDR-послідовності нелюдини введені в каркаси VH і VL людини. Терміни "нумерація Кебата", "визначення Кебата" і "мічення Кебата" використовуються в даному описі взаємозамінно. Терміни, які визнані в даній галузі, стосуються системи нумерації амінокислотних залишків, які є більш варіабельними (тобто гіперваріабельними), ніж інші амінокислотні залишки у варіабельних областях важкого і легкого ланцюгів антитіла або його антигензв'язувальної частині (Kabat et al. (1971), Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391; і Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication № 91-3242). Див. також Martin, "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains", In Kontermann and Diibel, eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, Berlin, 2001), Chapter 31, особливо сторінки 432-433. Для варіабельної області важкого ланцюга, гіперваріабельна область знаходиться в діапазоні положень амінокислот 3135 для CDR1, положень амінокислот 50-65 для CDR2 і положень амінокислот 95-106 для CDR3. Для варіабельної області легкого ланцюга, гіперваріабельна область знаходиться в діапазоні положень амінокислот 24-34 для CDR1, положень амінокислот 50-56 для CDR2 і положень амінокислот 89-97 для CDR3. Терміни "акцептор" і "акцепторне антитіло" стосуються антитіла або послідовності нуклеїнової кислоти, які забезпечують або кодують щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або 100 % амінокислотних послідовностей однієї або більше каркасних областей. У деяких варіантах здійснення термін "акцептор" стосується амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнової кислоти антитіла, які забезпечують або кодують константну область (константні області). Ще в одному варіанті здійснення термін "акцептор" стосується амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнової кислоти антитіла, які забезпечують або кодують одну або більше каркасних областей і константних областей. У одному конкретному варіанті здійснення термін 12 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "акцептор" стосується амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнової кислоти антитіла людини, яка забезпечує або кодує щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або 100 % амінокислотних послідовностей однієї або більше каркасних областей. Згідно з даним варіантом здійснення акцептор може містити щонайменше 1, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5 або щонайменше 10 амінокислотних залишків, які не зустрічаються в одному або більше специфічних положеннях антитіла людини. Акцепторна каркасна область і/або акцепторна константна область (константні області) можуть бути, наприклад, дериватизовані або одержані з гена антитіла зародкової лінії, гена зрілого антитіла, функціонального антитіла (наприклад, антитіла, добре відомого в даній галузі, антитіл, що розвиваються, або комерційно доступних антитіл). Термін "CDR" стосується області, що визначає комплементарність, у варіабельних послідовностях антитіла. У кожній з варіабельних областей важкого ланцюга і легкого ланцюга є три CDR, які позначаються як CDR1, CDR2 і CDR3, для кожної з варіабельних областей. Термін "набір CDR" стосується групи з трьох CDR, які зустрічаються в єдиній варіабельній області, здатній зв'язувати антиген. Точні границі CDR були визначені по-різному відповідно до різних систем. Система, описана Кебатом (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)), забезпечує не тільки недвозначну систему нумерації залишків, застосовну до будь-якої варіабельної області антитіла, але також забезпечує точні границі залишків, що визначають три CDR. CDR можуть називатися CDR Кебата. Чотіа і співробітники (Chothia and Lesk (1987), J. Mol. Biol. 196:901-917; і Chothia et al. (1989), Nature 342:877-883) виявили, що деякі підчастини в CDR Кебата мають майже ідентичні конформації пептидного каркаса, незважаючи на наявність великої різноманітності на рівні амінокислотної послідовності. Підчастини були позначені як L1, L2 і L3 або H1, H2 і H3, де "L" і "H" означають області легкого ланцюга і важкого ланцюга, відповідно. Області можуть називатися CDR Чотіа, які мають границі, що перекриваються з CDR Кебата. Інші границі, що визначають перекривання CDR Кебата, були описані Padlan (1995), FASEB J. 9:133-139; і MacCallum (1996), J. Mol. Biol. 262(5):732-745. Інші визначення границь можуть не додержуватися суворо однієї з вищеописаних систем, але будуть, проте, перекриватися з CDR Кебата, хоч вони можуть бути укороченими або подовженими в світлі прогнозу або експериментальних відкриттів, що конкретні залишки або групи залишків, або навіть повні CDR не впливають значущо на зв'язування антигену. Способи, використовувані в даному описі, можуть використовувати CDR, визначені будь-якою з систем, хоч конкретні варіанти здійснення використовують визначені Кебатом або Чотіа CDR. Термін "канонічний" залишок стосується залишку в CDR або каркасі, який визначає конкретну канонічну структуру, визначену Chothia et al. (1987), J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. (1992), J. Mol. Biol. 227:799-817. Згідно з Chothia et al., критичні частини CDR багатьох антитіл мають майже ідентичні конформації пептидного каркаса, незважаючи на різноманітність на рівні амінокислотної послідовності. Кожна канонічна структура точно визначає, передусім, набір торсійних кутів пептидного каркаса для суміжного сегмента амінокислотних залишків, що утворюють петлю. Терміни "донор" і "донорне антитіло" стосуються антитіла, що забезпечує одну або більше CDR. У одному конкретному варіанті здійснення донорне антитіло є антитілом з виду, відмінного від виду, з якого одержують або виробляють каркасні області. У контексті гуманізованого антитіла, термін "донорне антитіло" стосується антитіла нелюдини, що забезпечує одну або більше CDR. Термін "каркас" або "послідовність каркаса" стосується інших послідовностей варіабельної області мінус CDR. Оскільки точне визначення послідовності CDR може бути здійснене різними системами, значення каркасної послідовності є предметом відповідно відмінних інтерпретацій. Шість CDR (CDR-L1, -L2 і -L3 легкого ланцюга і CDR-H1, -H2 і -H3 важкого ланцюга) також розділяють каркасні області на легкому ланцюзі і важкому ланцюзі на чотири субобласті (FR1, FR2, FR3 і FR4) на кожному ланцюзі, в яких CDR1 розташована між FR1 і FR2, CDR2 між FR2 і FR3 і CDR3 між FR3 і FR4. Без точного указання конкретних субобластей у вигляді FR1, FR2, FR3 або FR4, каркасна область, описана іншими, представляє об'єднані FR у варіабельній області окремого ланцюга імуноглобуліну, що зустрічається в природі. FR представляє одну з чотирьох субобластей, і FR представляє дві або більше з чотирьох субобластей, що складають каркасну область. Акцепторні послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюгів людини відомі в даній галузі. У одному варіанті здійснення даного винаходу акцепторні послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюгів людини вибрані з послідовностей списку з V-base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) або 13 UA 107490 C2 з IMGT®, Міжнародної системи інформації (http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/LocusGenes/). У іншому варіанті здійснення даного винаходу акцепторні послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюга людини вибрані з послідовностей, описаних в таблиці 3 і таблиці 4. 5 10 15 20 25 30 35 Термін "ген антитіла зародкової лінії" або "фрагмент гена" стосується послідовності імуноглобуліну, що кодується нелімфоїдними клітинами, які не піддавалися процесу дозрівання, який приводить до генетичного реаранжування і мутації для експресії конкретного імуноглобуліну (див., наприклад, Shapiro et al. (2002), Crit. Rev. Immunol. 22(3):183-200; Marchalonis et al. (2001), Adv. Exp. Med. Biol. 484:13-30). Одна з переваг, забезпечуваних різними варіантами здійснення даного винаходу, випливає з визнання, що гени антитіл зародкової лінії мають більшу імовірність, ніж зрілі гени антитіл, збереження структур послідовності незамінних амінокислот, характерних для індивідуумів даного виду, отже, мають велику імовірність визнання як гени з чужорідного джерела при терапевтичному використанні в цьому виді. Термін "ключові" залишки стосується варіабельної області, яка має більший вплив на специфічність зв'язування і/або афінність антитіла, зокрема гуманізованого антитіла. Ключовий залишок включає, але не обмежується ними, один або більше з наступних залишків: залишок, який є сусіднім відносно CDR, потенційного сайта глікозилування (наприклад, N- або Оглікозилування), рідкий залишок, залишок, здатний взаємодіяти з антигеном, залишок, здатний взаємодіяти з CDR канонічного залишку, залишок контакту між варіабельною областю важкого ланцюга і варіабельною областю легкого ланцюга, залишок в зоні Vernier і залишок в області, яка перекривається між визначенням Чотіа CDR1 варіабельного важкого ланцюга і визначенням Кебата першого каркаса важкого ланцюга. Термін "гуманізоване антитіло" означає антитіло або його варіант, похідне, аналог або фрагмент, що імуноспецифічно зв'язується з антигеном, який представляє інтерес, і містить каркасну (FR) область, що має по суті амінокислотну послідовність антитіла людини і область, що визначає комплементарність (CDR), яка має по суті амінокислотну послідовність антитіла нелюдини. Термін "по суті" в контексті CDR стосується CDR, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 80 %, щонайменше на 85 %, щонайменше на 90 %, щонайменше на 95 %, щонайменше на 98 % або щонайменше на 99 % ідентичну амінокислотній послідовності CDR антитіла нелюдини. Гуманізоване антитіло містить по суті всі з щонайменше одного і звичайно двох варіабельних доменів (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv), в яких всі або по суті всі з CDR-областей відповідають CDR-областям імуноглобуліну нелюдини (тобто донорного 14 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіла) і всі або по суті всі каркасні області є каркасними областями консенсусної послідовності імуноглобуліну людини. У одному конкретному варіанті здійснення гуманізоване антитіло містить також щонайменше частину константної області імуноглобуліну (Fc), звичайно частину імуноглобуліну людини. У деяких варіантах здійснення гуманізоване антитіло містить легкий ланцюг, а також щонайменше варіабельний домен важкого ланцюга. Антитіло може також включати області CH1, шарнірні області, CH2, CH3 і CH4 важкого ланцюга. У деяких варіантах здійснення гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований легкий ланцюг. У деяких варіантах здійснення гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований важкий ланцюг. У деяких варіантах здійснення гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований варіабельний домен легкого ланцюга і/або гуманізований важкий ланцюг. Гуманізоване антитіло може бути вибране з будь-якого класу імуноглобулінів, включаючи, наприклад, IgM, IgG, IgD, IgA і IgE, і будь-якого ізотипу, включаючи, але без обмеження, наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4. Гуманізоване антитіло може містити послідовності з більше ніж одного класу або ізотипу, і конкретні константні домени можуть бути вибрані для оптимізації бажаних ефекторних функцій з використанням способів, добре відомих в даній галузі. Каркасні і CDR-області гуманізованого антитіла не повинні точно відповідати вихідним послідовностям, наприклад CDR або консенсусний каркас донорного антитіла можуть бути мутагенізовані заміною, інсерцією і/або делецією щонайменше одного амінокислотного залишку, так що залишок CDR або каркасний залишок в даному сайті не відповідає або донорному антитілу, або консенсусному каркасу. У одному конкретному варіанті здійснення такі мутації не є просторовими. Звичайно щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 % і щонайменше 95 % залишків гуманізованого антитіла будуть відповідати залишкам вихідних послідовностей FR і CDR. Термін "консенсусний каркас" стосується каркасної області в консенсусній послідовності імуноглобуліну. Термін "консенсусна послідовність імуноглобуліну" стосується послідовності, утвореної з амінокислот (або нуклеотидів), що найчастіше зустрічаються в сімействі споріднених послідовностей імуноглобуліну (див., наприклад, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)). В одному сімействі імуноглобулінів, кожне положення в консенсусній послідовності зайняте амінокислотою, що зустрічається найчастіше в цьому положенні в цьому сімействі. Якщо дві амінокислоти зустрічаються однаково часто, в консенсусну послідовність може бути включена будь-яка амінокислота. Термін зона "Vernier" стосується субнабору каркасних залишків, які можуть коректувати структуру CDR і тонко підганяти її до структури антигену, як описано Foote and Winter (1992), J. Mol. Biol. 224:487-499. Залишки зони Vernier утворюють шар, що підстилає CDR, і можуть впливати на структуру CDR і афінність антитіла. Термін "мультивалентний зв'язувальний білок" використовується в даному описі для позначення зв'язувального білка, що містить два або більше антигензв'язувальних сайтів. Мультивалентний зв'язувальний білок може бути сконструйований для присутності трьох або більше антигензв'язувальних сайтів і звичайно не є антитілом, що зустрічається в природі. Термін "мультиспецифічний зв'язувальний білок" стосується зв'язувального білка, здатного зв'язувати дві або більше споріднених або неспоріднених мішеней. Зв'язуючі здвоєний варіабельний домен (DVD) білки або імуноглобуліни (DVD-Ig) в даному контексті є зв'язувальними білками, які містять два або більше антигензв'язувальних сайтів і є тетравалентними або мультивалентними білками. Такі DVD-Ig можуть бути моноспецифічними, тобто здатними зв'язувати один антиген, або мультиспецифічними, тобто здатними зв'язувати два або більше антигенів. DVD-Ig зв'язувальні білки, що містять два DVD-Ig-поліпептиди важкого ланцюга і два DVD-Ig-поліпептиди легкого ланцюга, називають DVD-Ig. Кожна половина DVD-Ig містить поліпептид DVD-Ig важкого ланцюга і поліпептид DVD-Ig легкого ланцюга, і два антигензв'язувальних сайти. Кожний зв'язувальний сайт містить варіабельний домен важкого ланцюга і варіабельний домен легкого ланцюга з 6 CDR загалом, що беруть участь в зв'язуванні антигену, на один антигензв'язувальний сайт. DVD-зв'язувальні білки і способи одержання DVDзв'язувальних білків описані в патенті США № 7612181. Один аспект даного винаходу стосується DVD-зв'язувального білка, що містить зв'язувальні білки, здатні зв'язувати TNF-α. У одному конкретному варіанті здійснення DVD-зв'язувальний білок здатний зв'язувати TNF-α і другу мішень. Термін "нейтралізація" стосується нейтралізації біологічної активності цитокіну, коли зв'язувальний білок специфічно зв'язує цитокін. У одному конкретному варіанті здійснення нейтралізуючий зв'язувальний білок являє собою нейтралізуюче антитіло, зв'язування якого з hTNF-α приводить до інгібування біологічної активності hTNF-α, наприклад нейтралізуючий зв'язувальний білок зв'язує hTNF-α і зменшує біологічну активність hTNF-α щонайменше на 15 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 приблизно 20, 40, 60, 80, 85 % або більше процентів. Інгібування біологічної активності hTNF-α нейтралізуючим зв'язувальним білком може бути оцінене вимірюванням одного або більше індикаторів біологічної активності hTNF-α, добре відомих в даній галузі, наприклад нейтралізації цитотоксичності TNF-α на клітинах L929. У іншому варіанті здійснення термін "агонізація" стосується збільшення біологічної активності TNF-α, коли зв'язувальний білок специфічно зв'язує TNF-α, наприклад hTNF-α. У одному конкретному варіанті здійснення агонізуючий зв'язувальний білок являє собою агоністичне антитіло, зв'язування якого з TNF-α приводить до збільшення біологічної активності TNF-α. У одному конкретному варіанті здійснення агоністичний зв'язувальний білок зв'язує TNFα і збільшує біологічну активність TNF-α щонайменше на приблизно 20, 40, 60, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 і 100 %. Інгібування біологічної активності TNF-α агоністичним зв'язувальним білком може оцінюватися вимірюванням одного або більше індикаторів біологічної активності TNF-α, добре відомих в даній галузі. Термін "активність" включає такі активності, як специфічність/афінність зв'язування антитіла відносно антигену, наприклад анти-hTNF-α-антитіла, яке зв'язується з TNF-α-антигеном, і/або нейтралізуючу ефективність (або агонізуючу ефективність) антитіла, наприклад анти-hTNF-αантитіла, зв'язування якого з hTNF-α інгібує біологічну активність hTNF-α, наприклад нейтралізацію цитотоксичності TNF-α на клітинах L929. Терміни "епітоп" або "антигенна детермінанта" стосується сайта на антигені, з яким зв'язується імуноглобулін, наприклад антитіло, або Т-клітинний рецептор. У деяких варіантах здійснення епітопні детермінанти включають хімічно активні поверхневі групи молекул, такі як амінокислоти, бічні цукрові ланцюги, фосфорил або сульфоніл, і в деяких варіантах здійснення можуть мати специфічні тривимірні структурні характеристики і/або специфічні характеристики заряду. Епітоп є областю антигену, яка зв'язується антитілом. У деяких варіантах здійснення кажуть, що антитіло специфічно зв'язує антиген, коли воно переважно розпізнає його антигенмішень в комплексній суміші білків і/або макромолекул. Епітопи можуть бути утворені як з суміжних амінокислот, так і з несуміжних амінокислот, зіставлених третинним фолдингом білка. Епітопи, утворені з суміжних амінокислот, звичайно зберігаються при впливі денатуруючими розчинниками, тоді як епітопи, утворені третинним фолдингом, звичайно втрачаються при обробці денатуруючими розчинниками. Епітоп звичайно включає щонайменше 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 амінокислот унікальної просторової конформації. Способи визначення, чи зв'язалися епітопи конкретним антитілом (тобто картування епітопів), добре відомі в даній галузі і включають, наприклад, аналізи імуноблотингу і імунопреципітації, де пептиди, які перекриваються або суміжні, з TNF-α тестують на реактивність з конкретним анти-TNF-αантитілом. Способи визначення просторової конформації епітопів включають способи, відомі в даній галузі, і розкриті в даному описі способи, наприклад рентгенівську кристалографію і 2вимірний ядерний магнітний резонанс (див., наприклад, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)). У даний винахід включені також антитіла, які зв'язуються з епітопом на TNF-α, який містить весь епітоп або частину епітопа, розпізнаваний описаними в даному документі конкретними антитілами (наприклад, тією ж самою або перекриваючою областю або областю між ними, або областю, що простягається на цю). У даний винахід включені також антитіла, які зв'язують один і той же епітоп, і/або антитіла, які конкурують за зв'язування з TNF-α, наприклад TNF-α людини, з описаними в даному документі антитілами. Антитіла, які розпізнають один і той же епітоп або конкурують за зв'язування, можуть бути ідентифіковані з використанням рутинних способів. Такі способи включають, наприклад, імуноаналіз, який показує здатність одного антитіла блокувати зв'язування іншого антитіла з антигеном-мішенню, тобто аналіз конкурентного зв'язування. Конкурентне зв'язування визначають в аналізі, в якому тестований імуноглобулін інгібує специфічне зв'язування посилального антитіла із загальним антигеном, таким як hTNF-α. Відомі численні типи аналізів конкурентного зв'язування, наприклад: твердофазний прямий або непрямий радіоімуноаналіз (RIA), твердофазний прямий або непрямий ферментний імуноаналіз (EIA), конкурентний сендвіч-аналіз (див. Stahli et al. (1983), Methods in Enzymol. 9:242); твердофазний прямий біотин-авідин EIA (див. Kirkland et al. (1986), J. Immunol. 137:3614); твердофазний прямий аналіз з міткою, твердофазний прямий сендвіч-аналіз з міткою (див. Harlow and Lane, Antibodies: А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); 125 твердофазний прямий RIA з міткою, що використовує мітку I (див. Morel et al. (1988), Mol. Immunol. 25(1):7); твердофазний прямий біотин-авідин EIA (Cheung et al. (1990), Virol. 1 76:546); прямий RIA з міткою (Moldenhauer et al. (1990), Scand. J. Immunol. 32:77). Звичайно, такий аналіз включає використання очищеного антигену, зв'язаного з твердою поверхнею, або клітин, що 16 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 несуть будь-яку з міток, неміченого тестованого імуноглобуліну і міченого посилального імуноглобуліну. Конкурентне інгібування вимірюють визначенням кількості мітки, зв'язаної з твердою поверхнею або клітинами, в присутності тестованого імуноглобуліну. Звичайно тестований імуноглобулін присутній в надлишку. Звичайно, коли конкуруюче антитіло присутнє в надлишку, воно буде інгібувати специфічне зв'язування посилального антитіла із звичайним антигеном щонайменше на 50-55 %, 55-60 %, 60-65 %, 65-70 % 70-75 % або більше. Інші способи включають, наприклад, способи картування епітопів, такі як рентгенівські аналізи кристалів комплексів антиген:антитіло, які забезпечують атомну розрізнювальну здатність епітопа. Інші способи забезпечують моніторинг зв'язування антитіла з фрагментами антигену або мутованими варіаціями антигену, де втрата зв'язування, зумовлена модифікацією амінокислотного залишку в послідовності антигену, часто вважається указанням на компонент епітопа. Крім того, для картування епітопа можуть бути також використані обчислювальні комбінаторні способи. Способи основані на здатності антитіла, що представляє інтерес, афінно виділяти специфічні короткі пептиди з пептидних бібліотек комбінаторного фагового дисплея. Потім пептиди розглядають як показники для визначення епітопа, відповідного антитілу, використовуваному для скринінгу пептидної бібліотеки. Для картування епітопів, були розроблені також обчислювальні алгоритми, які, як було показано, картують конформаційні несуцільні епітопи. Термін "поверхневий плазмонний резонанс" стосується оптичного феномена, який дозволяє аналізувати біоспецифічні взаємодії в реальному часі шляхом детектування змін в концентраціях білка в біосенсорному матриксі, наприклад, з використанням системи BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ). Відносно додаткових описів див. Jonsson et al. (1993), Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson et al. (1991), Biotechniques 11:620-627; Johnsson, et al. (1995), J. Mol. Recognit. 8:125-131; і Johnsson et al. (1991), Anal. Biochem. 198:268-277. Термін "Kon" стосується константи швидкості асоціації зв'язувального білка (наприклад, антитіла) з антигеном для утворення, наприклад, комплексу антитіло/антиген, як відомо в даній галузі. "Kon" відома також під термінами "константа швидкості асоціації" або "K a", використовуваними взаємозамінно в даному описі. Величина, що показує швидкість зв'язування антитіла з його антигеном-мішенню, або швидкість утворення комплексу між антитілом і антигеном, показана також рівнянням нижче: Антитіло ("Ab") + Антиген ("Ag") Ab-Ag. Термін "Koff" стосується сталої для швидкості дисоціації або "константи швидкості дисоціації" зв'язувального білка (наприклад, антитіла), наприклад, з комплексу антитіло/антиген, як відомо в даній галузі. Величина показує швидкість дисоціації антитіла з його антигену-мішені або розділення комплексу Ab-Ag протягом часу до вільного антитіла і антигену, як показано рівнянням нижче: Ab+Ag Ab-Ag. Термін "KD" стосується "рівноважної константи дисоціації" і стосується величини, одержаної вимірюванням титрування при рівновазі і діленням константи швидкості дисоціації (K off) на константу швидкості асоціації (Kon). Константу швидкості асоціації, константу швидкості дисоціації і рівноважну константу дисоціації використовують для представлення афінності зв'язування антитіла з антигеном. Способи визначення констант швидкості асоціації і дисоціації добре відомі в даній галузі. Використання способів на основі флуоресценції надає високу чутливість і можливість випробування проб в фізіологічних буферах при рівновазі. Можуть бути використані інші експериментальні підходи і прилади, такі як аналіз BIAcore® (аналіз біомолекулярної взаємодії) (наприклад, прилад, доступний від BIAcore International AB, GE Healthcare company, Uppsala, Sweden). Крім того, може бути також використаний аналіз KinExA® (Kinetic Exclusion Assay), доступний з Sapidyne Instruments (Boise, Idaho). Термін "мічений зв'язувальний білок" стосується білка з включеною міткою, яка забезпечує ідентифікацію зв'язувального білка. У одному конкретному варіанті здійснення мітка являє собою детектований маркер, наприклад, включення радіоактивно міченої амінокислоти або приєднання до поліпептиду біотинільних частин молекули, які можуть бути детектовані міченим авідином (наприклад, стрептавідином, що містить флуоресцентний маркер або має ферментативну активність, які можуть бути детектовані оптичними або колориметричними способами). Приклади міток для поліпептидів включають, але не обмежуються ними, наступні: 3 14 35 90 99 111 125 131 177 56 радіоактивні ізотопи або радіонукліди (наприклад, H, C, S, Y, Tc, In, I, I, Lu, Ho 153 або Sm); флуоресцентні мітки (наприклад, FITC, родамін, лантанідні люмінофори), ферментні мітки (наприклад, пероксидазу хрону, люциферазу, лужну фосфатазу); хемілюмінесцентні маркери; біотинільні групи; попередньо визначені повні епітопи, розпізнавані вторинним 17 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 репортером (наприклад, парою послідовностей лейцинової блискавки, сайтами зв'язування для вторинних антитіл, доменами зв'язування металів, епітопними мітками); і магнітні агенти, такі як хелати гадолінію. Термін "кон'югат антитіла" стосується зв'язувального білка, такого як антитіло, хімічно зв'язаного з другою хімічною частиною молекули, такою як терапевтичний або цитотоксичний агент. Термін "агент" означає хімічну сполуку, суміш хімічних сполук, біологічну макромолекулу або екстракт, приготований з біологічних матеріалів. У одному конкретному варіанті здійснення терапевтичні або цитотоксичні агенти включають, але не обмежуються ними, коклюшний токсин, таксол, цитохалазин В, граміцидин D, етидійбромід, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксіантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин D, 1-дигідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин, і їх аналоги і гомологи. Терміни "кристал" і "кристалізований" стосуються антитіла або його антигензв'язувальної частини, що існує у формі кристала. Кристали є однією формою твердого стану речовини, яка відрізняється від таких форм, як аморфний твердий стан або рідкокристалічний стан. Кристали складаються з регулярних, повторюваних, тривимірних масивів атомів, іонів, молекул (наприклад, білків, таких як антитіла) або молекулярних ансамблів (наприклад, комплексів антиген/антитіло). Тривимірні масиви аранжовані відповідно до конкретних математичних взаємозв'язків, які добре зрозумілі в даній галузі. Фундаментальну одиницю або елементарну ланку макромолекули, яка повторюється в кристалі, називають асиметричною ланкою. Повторення асиметричної ланки в аранжуванні, яке відповідає конкретній, добре визначуваній кристалографічній симетрії, забезпечує елементарну комірку кристала. Повторення елементарної комірки кристала регулярними трансляціями у всіх трьох вимірюваннях забезпечує кристал. Див. Giege et al. Chapter 1, In Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, А Practical Approach, 2nd ed. (Ducruix and Giege, eds.) (Oxford University Press, New York, 1999), pp. 1-16. Термін "полінуклеотид" означає полімерну форму двох або більше нуклеотидів або рибонуклеотидів (РНК), або дезоксинуклеотидів (ДНК), або модифіковану форму будь-якого типу нуклеотиду. Даний термін включає одноланцюжкову і дволанцюжкову форми ДНК, але в одному конкретному варіанті здійснення означає дволанцюжкову ДНК. Термін "виділений полінуклеотид" означає полінуклеотид (наприклад, геномного походження, кДНК- або синтетичного походження або їх деяку комбінацію), який, внаслідок його походження у вигляді "виділеного полінуклеотиду", не асоційований з всім полінуклеотидом або частиною полінуклеотиду, з яким "виділений полінуклеотид" виявляється в природі; або не зустрічається в природі у вигляді частини більшої послідовності. Термін "вектор" стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою він був зв'язаний. Один тип вектора являє собою "плазміду", яка є кільцевою дволанцюжковою петлею ДНК, в яку можуть бути ліговані додаткові ДНК-сегменти. Інший тип вектора являє собою вірусний вектор, в якому додаткові ДНК-сегменти можуть бути ліговані у вірусний геном. Деякі вектори здатні до автономної реплікації в клітині-хазяїні, в яку вони введені (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальний сайт ініціації реплікації (ориджин), і епісомні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомні вектори ссавців) можуть бути інтегровані в геном клітини-хазяїна після введення в клітину-хазяїна і, таким чином, реплікуються разом з геномом хазяїна. Крім того, деякі вектори здатні керувати експресією генів, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори називаються в даному описі "рекомбінантними експресуючими векторами" (або просто "експресуючими векторами"). В основному, експресуючі вектори, використовувані в способах рекомбінантних ДНК, часто знаходяться у формі плазмід. У даному описі, "плазміда" і "вектор" можуть використовуватися взаємозамінно, оскільки плазміда є найчастіше використовуваною формою вектора. Однак даний винахід призначений для включення в нього таких інших форм експресуючих векторів, як вірусні вектори (наприклад, ретровіруси, аденовіруси і аденоасоційовані віруси з дефектною реплікацією), які виконують еквівалентні функції. Термін "функціонально зв'язані" стосується розташування рядом, при якому описані компоненти знаходяться у взаємозв'язку, що дозволяє їм функціонувати призначеним для них чином. Регуляторна послідовність, "функціонально зв'язана" з кодуючою послідовністю, лігована таким чином, що експресія кодуючої послідовності досягається при умовах, сумісних з регуляторними послідовностями. "Функціонально зв'язані" послідовності включають як регуляторні послідовності експресії, які є суміжними з геном, що представляє інтерес, так і регуляторні послідовності експресії, які діють in trans або на відстані для регуляції гена, що представляє інтерес. Термін "регуляторна послідовність експресії" стосується полінуклеотидних 18 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностей, які необхідні для виконання експресії і процесингу кодуючих послідовностей, з якими вони зв'язані. Регуляторні послідовності експресії включають придатні послідовності ініціації транскрипції, термінації, послідовності промотору і енхансера; ефективні сигнали процесингу РНК; послідовності, які посилюють ефективність трансляції (тобто консенсусну послідовність Козака); послідовності, які збільшують стабільність білка; і, якщо бажано, послідовності, які збільшують секрецію білка. Природа таких регуляторних послідовностей розрізнюється залежно від організму-хазяїна; в прокаріотах такі регуляторні послідовності звичайно включають промотор, сайт зв'язування рибосом і послідовність термінації транскрипції; в еукаріотах такі регуляторні послідовності звичайно включають промотори і послідовність термінації транскрипції. Термін "регуляторні послідовності" призначений для включення компонентів, присутність яких є суттєвою для експресії і процесингу, і можуть також включати додаткові компоненти, присутність яких є вигідною, наприклад лідерні послідовності і злиті з партнером послідовності. Термін "трансформація" стосується будь-якого процесу, за допомогою якого екзогенна ДНК входить в клітину-хазяїна. Трансформація може здійснюватися в природних або штучних умовах з використанням різних способів, добре відомих в даній галузі. Трансформація може бути основана на будь-якому відомому способі інсертування чужорідних послідовностей нуклеїнових кислот в прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїна. Спосіб вибирають на основі трансформованої клітини-хазяїна, і він може включати, але не обмежується ними, вірусну інфекцію, електропорацію, ліпофекцію і бомбардування частинками. Такі "трансформовані" клітини включають стабільно трансформовані клітини, в яких інсертована ДНК здатна до реплікації, або у вигляді плазміди, що автономно реплікується, або у вигляді частини хромосоми хазяїна. Вони також включають клітини, які транзиторно експресують інсертовані ДНК або РНК протягом обмежених періодів часу. Термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн") стосується клітини, в яку була введена екзогенна ДНК. Потрібно розуміти, що такі терміни призначені для позначення не тільки клітини, що конкретно розглядається, але і потомства такої клітини. Оскільки деякі модифікації можуть зустрічатися в подальших генераціях внаслідок або мутації, або впливу навколишнього середовища, таке потомство може фактично не бути ідентичним батьківській клітині, але все ще включається в обсяг терміна "клітина-хазяїн". У одному конкретному варіанті здійснення клітини-хазяїни включають прокаріотичні і еукаріотичні клітини, вибрані з будь-якого з Царств життя. Еукаріотичні клітини включають клітини найпростіших, грибів, рослини і тварини. У одному конкретному варіанті здійснення клітини-хазяїни включають, але не обмежуються ними, лінію прокаріотичних клітин Е. coli; лінії клітин ссавців CHO, HEK 293 і COS; лінію клітин комах Sf9 і клітину гриба Saccharomyces cerevisiae. Для рекомбінантної ДНК можуть бути використані стандартні способи, олігонуклеотидний синтез і культивування тканини і трансформація (наприклад, електропорація, ліпофекція). Ферментативні реакції і методи очищення можуть бути здійснені згідно з описами виготовлювача або як їх звичайно здійснюють в даній галузі, або як вони описані в даному документі. Попередні способи і методики звичайно можуть бути здійснені відповідно до загальних способів, які добре відомі в даній галузі і як описано в різних основних і більш конкретних посиланнях, які цитуються і обговорюються протягом даного опису. Див., наприклад, Sambrook et al. Molecular Cloning: А Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). "Трансгенним організмом" називають організм, що має клітини, які містять трансген, де трансген, введений в організм (або в предок організму), експресує поліпептид, який природно не експресується в цьому організмі. "Трансген" є ДНК-конструктом, який стабільно і функціонально інтегрувався в геном клітини, з якої розвивається трансгенний організм, керуючий експресією кодованого геном продукту в одному або більше типах клітин або тканин трансгенного організму. Терміни "регулюють" і "модулюють" використовуються взаємозамінно і стосуються зміни або модифікації активності молекули, що представляє інтерес (наприклад, біологічної активності hTNF-α). Модуляція може бути збільшенням або зменшенням величини певної активності або функції молекули, що представляє інтерес. Приклади активності і функції молекули включають, але не обмежуються ними, характеристики зв'язування, ферментативну активність, активацію клітинних рецепторів і трансдукцію сигналу. Відповідно, термін "модулятор" означає сполуку, здатну змінювати або модифікувати активність або функцію молекули, що представляє інтерес (наприклад, біологічну активність TNF-α). Наприклад, модулятор може викликати збільшення або зменшення величини певної активності або функції молекули в порівнянні з величиною активності або функції, 19 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 спостережуваною за відсутності модулятора. У деяких варіантах здійснення модулятор є інгібітором, який зменшує величину щонайменше одній активності або функції молекули. Приклади інгібіторів включають, але не обмежуються ними, білки, пептиди, антитіла, пептитіла, вуглеводи або малі органічні молекули. Пептитіла описані, наприклад, в міжнародній публікації WO 01/83525. Термін "агоніст" стосується модулятора, який при приведенні в контакт з молекулою, що представляє інтерес, викликає збільшення величини певної активності або функції молекули в порівнянні з величиною активності або функції, спостережуваною за відсутності агоніста. Конкретні агоністи, що представляють інтерес, можуть включати, але не обмежуються ними, TNF-α-поліпептиди або поліпептиди, нуклеїнові кислоти, вуглеводи або будь-які інші молекули, які зв'язуються з hTNF-α. Термін "антагоніст" або "інгібітор" стосується модулятора, який при приведенні в контакт з молекулою, що представляє інтерес, викликає зменшення величини певної активності або функції молекули в порівнянні з величиною або функцією, спостережуваною за відсутності антагоніста. Конкретні антагоністи, що представляють інтерес, включають агоністи, які блокують або модулюють біологічну або імунологічну активність TNF-α, наприклад hTNF-α. Антагоністи і інгібітори hTNF-α можуть включати, але не обмежуються ними, білки, нуклеїнові кислоти, вуглеводи або будь-які інші молекули, які зв'язуються з hTNF-α. Термін "ефективна кількість" стосується кількості терапії, яка є достатньою для зменшення або ослаблення тяжкості і/або тривалості порушення або одного або більше його симптомів, запобігання прогресуванню порушення, викликання регресу порушення, запобігання рецидиву, розвитку або прогресуванню одного або більше симптомів, асоційованих з порушенням, детектування порушення або збільшення або поліпшення профілактичного або терапевтичного ефекту(ів) іншої терапії (наприклад, профілактичного або терапевтичного агента). Термін "проба" використовується в даному описі в його найбільш широкому значенні. "Біологічна проба" включає, але не обмежується цим, будь-яку кількість речовини з живої істоти або раніше живої істоти. Такі живі істоти включають, але не обмежуються ними, людей, мишей, щурів, мавп, собак, кроликів і інших тварин. Такі речовини включають, але не обмежуються ними, кров, сироватку, сечу, синовіальну рідину, клітини, органи, тканини, кістковий мозок, лімфатичні вузли і селезінку. 1. Антитіла, які зв'язують TNF-α людини Один аспект даного винаходу надає виділені мишачі моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні частини, які зв'язуються з TNF-α з високою афінністю, повільною швидкістю дисоціації і високою нейтралізуючою здатністю. Другий аспект даного винаходу надає химерні антитіла, які зв'язують TNF-α. Третій аспект даного винаходу надає CDR-трансплантовані антитіла або їх антигензв'язувальні частини, які зв'язують TNF-α. Четвертий аспект даного винаходу надає гуманізовані антитіла або їх антигензв'язувальні частини, які зв'язують TNF-α. У одному конкретному варіанті здійснення антитіла або їх частини, являють собою виділені антитіла. У одному варіанті здійснення антитіла даного винаходу нейтралізують анти-TNF-αантитіла людини або модулюють функцію TNF-α. А. Спосіб одержання анти-TNF-α-антитіл Антитіла даного винаходу можуть бути одержані будь-яким з ряду способів, відомих в даній галузі. 1. Моноклональні анти-TNF-α-антитіла, одержані з використанням технології гібридом Моноклональні антитіла можуть бути одержані з використанням великої різноманітності способів, відомих в даній галузі, які включають використання гібридомної, рекомбінантної технологій і технології фагового дисплея або їх комбінацій. Наприклад, моноклональні антитіла можуть бути одержані з використанням гібридомних способів, включаючи способи, відомі в даній галузі і представлені, наприклад, в Harlow et al. Antibodies: А Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al. eds., "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, "In Research Monographs in Immunology, vol. 3 (J.L. Turk, General Editor) (Elsevier, New York, 1981), pp. 563-587. Термін "моноклональне антитіло" не обмежується антитілами, одержуваними за допомогою гібридомної технології. Термін "моноклональне антитіло" стосується антитіла, яке одержане з єдиного клону, що включає будь-який еукаріотичний, прокаріотичний або фаговий клон, а не способу, за допомогою якого воно одержане. Способи одержання і скринінгу специфічних антитіл з використанням гібридомної технології є рутинними і добре відомі в даній галузі. У одному варіанті здійснення даний винахід забезпечує способи генерування моноклональних антитіл, а також антитіл, одержаних за способом, який включає культивування гібридомної клітини, секретуючої антитіло даного 20 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходу, в якому гібридому генерують злиттям спленоцитів, виділених з миші, імунізованої антигеном даного винаходу, з мієломними клітинами і потім скринінгом гібридом, що одержані злиттям гібридомних клонів, які секретують антитіло, здатне зв'язувати поліпептид даного винаходу. Коротко, миші можуть бути імунізовані TNF-α-антигеном. У одному конкретному варіанті здійснення TNF-α-антиген вводять з ад'ювантом для стимуляції імунної реакції. Такі ад'юванти включають повний або неповний ад'ювант Фрейнда, RIBI (мурамілдипептиди) або ISCOM (імуностимулюючі комплекси). Такі ад'юванти можуть захищати поліпептид від швидкого диспергування секвеструванням його в локальному депозиті, або вони можуть містити речовини, які стимулюють хазяїна відносно факторів секреції, які є хемотаксичними відносно макрофагів і інших компонентів імунної системи. У одному конкретному варіанті здійснення, якщо вводиться поліпептид, схема імунізації буде включати два або більше введень поліпептиду, розподілених протягом декількох тижнів. Після імунізації тварини TNF-α-антигеном, антитіла і/або продукуючі антитіла клітини можуть бути одержані з тварини. Анти-TNF-α-антитіловмісну сироватку одержують з тварини кровопусканням або умертвінням тварини. Сироватка може бути використана в тому вигляді, в якому вона одержана з тварини, при цьому фракція імуноглобуліну може бути одержана з сироватки або анти-TNF-α-антитіла можуть бути очищені з сироватки. Сироватка або імуноглобуліни, одержані таким чином, є поліклональними, отже мають ряд гетерогенних властивостей. Як тільки детектують імунну реакцію, наприклад, антитіла, специфічні для антигену TNF-α, детектують в мишачій сироватці, збирають селезінку миші і виділяють спленоцити. Потім спленоцити зливають загальновідомими способами з будь-якими придатними мієломними клітинами, наприклад клітинами з лінії клітин SP20, доступної з ATCC. Гібридоми відбирають і клонують способом лімітуючих розведень. Потім гібридомні клони аналізують способами, відомими в даній галузі, для клітин, які секретують антитіла, здатні зв'язувати TNF-α. Асцитна рідина, яка звичайно містить високі рівні антитіл, може бути генерована імунізацією мишей позитивними гібридомними клонами. У іншому варіанті здійснення продукуючі антитіло імморталізовані гібридоми можуть бути одержані з імунізованих тварин. Після імунізації, тварину умертвляють і В-клітини селезінки зливають з імморталізованими мієломними клітинами, як добре відомо в даній галузі. Див., наприклад, Harlow and Lane, supra. У одному конкретному варіанті здійснення мієломні клітини не секретують поліпептиди імуноглобуліну (несекреторна лінія клітин). Після злиття і відбору з антибіотиком, гібридоми піддають скринінгу з використанням TNF-α або його частини, або клітини, експресуючої TNF-α або його частину, або клітини, експресуючої TNF-α. У одному конкретному варіанті здійснення початковий скринінг виконують з використанням твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) або радіоімуноаналізу (RIA) або ELISA. Один приклад скринінгу ELISA наданий в міжнародній публікації PCT WO 00/37504. Анти-TNF-α-антитілопродукуючі гібридоми відбирають, клонують і додатково піддають скринінгу на бажані характеристики, що включають сильний ріст гібридом, високе продукування антитіла і бажані характеристики антитіла, обговорювані додатково нижче. Гібридоми культивують і розмножують in vivo в сингенних тваринах, в тваринах, які не мають імунної системи, наприклад голих мишах, або в клітинній культурі in vitro. Способи відбору, клонування і розмноження добре відомі фахівцям в даній галузі. У одному конкретному варіанті здійснення гібридоми є гібридомами миші, як описано вище. У іншому конкретному варіанті здійснення гібридоми продукуються у видах нелюдини, немиші, таких як щури, вівці, свині, кози, велика рогата худоба або коні. У іншому варіанті здійснення гібридоми є гібридомами людини, в яких несекреторна мієлома людини злита з клітиною людини, експресуючою анти-TNF-α-антитіло. Фрагменти антитіл, які розпізнають специфічні епітопи, можуть бути генеровані відомими способами. Наприклад, Fab- і F(ab')2-фрагменти даного винаходу можуть бути одержані протеолітичним розщеплення молекули імуноглобуліну, з використанням ферментів, таких як папаїн (для одержання Fab-фрагментів) або пепсину (для одержання F(ab') 2-фрагментів). F(ab')2-фрагменти містять варіабельну область, константну область легкого ланцюга і СН1домен важкого ланцюга. 2. Моноклональне анти-TNF-α-антитіло, одержане з використанням SLAM У іншому аспекті даного винаходу рекомбінантні антитіла генерують з окремих, виділених лімфоцитів з використанням процедури, званої в даній галузі способом селектованих лімфоцитарних антитіл (SLAM), описаним в патенті США 5627052; PCT Публікації WO 92/02551; і Babcook, et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848. В цьому способі, окремі клітини, секретуючі антитіла, що представляють інтерес, наприклад лімфоцити, одержані з будь-якої з 21 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імунізованих тварин, описаних в Розділі 1, піддають скринінгу з використанням антигенспецифічного аналізу гемолітичних бляшок, де антиген TNF-α, субодиницю TNF-α або їх фрагмент зв'язують з еритроцитами вівці з використанням лінкера, такого як біотин, і використовують для ідентифікації окремих клітин, які секретують антитіла зі специфічністю відносно TNF-α. Після ідентифікації антитілосекретуючих клітин, що представляють інтерес, кДНК варіабельної області важкого і легкого ланцюгів звільняють від даних клітин за допомогою ПЛР із зворотною транскриптазою, і потім варіабельні області можуть бути експресовані в контексті придатних константних областей імуноглобуліну (наприклад, константних областей людини), в клітинах-хазяїнах ссавців, таких як клітини COS або СНО. Потім клітини-хазяїни, трансфіковані ампліфікованими послідовностями імуноглобуліну, одержані з відібраних in vivo лімфоцитів, можуть бути піддані додатковому аналізу і селекції (відбору) in vitro, наприклад, пенінгом трансфікованих клітин для виділення клітин, експресуючих антитіла до TNF-α. Ампліфіковані послідовності імуноглобуліну можуть бути піддані додатковому маніпулюванню in vitro, такому як способи дозрівання афінності in vitro, як описано в РСТ публікації WO 00/56772. 3. Моноклональні анти-TNF-α-антитіла, одержані з використанням трансгенних тварин У іншому варіанті здійснення даного винаходу антитіла одержують імунізацією тварининелюдини, що містить частину локусів або всі локуси імуноглобуліну людини, TNF-α-антигеном. У одному конкретному варіанті здійснення вказаною тваринною-нелюдиною є трансгенна миша XENOMOUSE, сконструйований штам миші, який містить великі фрагменти локусів імуноглобуліну людини і є недостатнім в продукуванні антитіл миші. Див., наприклад, Green et al. (1994), Nature Genet. 7:13-21; і патенти США №№ 5916771; 5939598; 5985615; 5998209; 6075181; 6091001; 6114598 і 6130364. Див. також PCT Publications WO 91/10741, опубліковану 25 липня 1991 року; WO 94/02602, опубліковану 3 лютого 1994 року; WO 96/34096 і WO 96/33735, обидві опубліковані 31 жовтня 1996 року; WO 98/16654, опубліковану 23 квітня 1998 року; WO 98/24893, опубліковану 11 червня 1998 року; WO 98/50433, опубліковану 12 листопада 1998 року; WO 99/45031, опубліковану 10 вересня 1999 року; WO 99/53049, опубліковану 21 жовтня 1999 року; WO 00/09560, опубліковану 24 лютого 2000 року, і WO 00/37504, опубліковану 29 червня 2000 року. Трансгенна миша XENOMOUSE продукує репертуар, подібний до репертуару дорослої людини, повністю людських антитіл, і генерує антигенспецифічні mAb людини. Трансгенна миша XENOMOUSE містить приблизно 80 % репертуару антитіл людини внаслідок введення маючих розмір мегабаз (мільйонів п.н.) фрагментів конфігурації YAC зародкової лінії локусів важкого ланцюга людини і х локусів легкого ланцюга. Див. Mendez et al. (1997), Nature Genet. 15:146-156; Green and Jakobovits (1998), J. Exp. Med. 188:483-495. 4. Моноклональні анти-TNF-α-антитіла, одержані з використанням бібліотек рекомбінантних антитіл In vitro способи можуть бути також використані для одержання антитіл даного винаходу, причому бібліотеку антитіл піддають скринінгу для ідентифікації антитіла, що має бажану специфічність зв'язування. Способи такого скринінгу бібліотек рекомбінантних антитіл добре відомі в даній галузі і включають, наприклад, способи, описані в патенті США № 5223409; PCT публікаціях WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690 і WO 97/29131; Fuchs et al. (1991), Bio/Technology, 9:1369-1372; Hay et al. (1992), Hum. Antibod. Hybridomas, 3:81-85; Huse et al. (1989), Science, 246:1275-1281; McCafferty et al. (1990), Nature, 348:552-554; Griffiths et al. (1993), EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992), J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al. (1991), Nature, 352:624-628; Gram et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580; Garrard et al. (1991), Bio/Technology, 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991), Nucl. Acid Res. 19:4133-4137; і Barbas et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:79787982; і в патентній публікації США 2003.0186374. Бібліотека рекомбінантних антитіл може бути бібліотекою з суб'єкта, імунізованого TNF-α або частиною TNF-α. Альтернативно, бібліотека рекомбінантних антитіл може являти собою бібліотеку з "ненавченого" суб'єкта, тобто суб'єкта, який не був імунізований TNF-α, наприклад бібліотекою антитіл людини від суб'єкта-людини, який не був імунізований TNF-α людини. Антитіла даного винаходу відбирають скринінгом бібліотеки рекомбінантних антитіл пептидом, що містить TNF-α людини, для відбору, таким чином, антитіл, які розпізнають TNF-α. Способи проведення такого скринінгу і селекції (відбору) добре відомі в даній галузі, такі, як описано в посиланнях в попередньому абзаці. Для селекції антитіл даного винаходу, що мають конкретну афінність зв'язування відносно hTNF-α, таких як антитіла, які дисоціюються з TNF-α людини з конкретною константою швидкості дисоціації Koff, може бути використаний відомий в даній галузі спосіб поверхневого плазмонного резонансу для селекції антитіл, що мають бажану константу швидкості Koff. Для селекції антитіл даного винаходу, що мають конкретну нейтралізуючу активність відносно hTNF-α, таких як антитіла з конкретною IC50, можуть бути використані 22 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стандартні способи, відомі в даній галузі, для оцінювання інгібування активності hTNF-α. У одному аспекті даний винахід стосується виділеного антитіла або його антигензв'язувальної частини, що зв'язує TNF-α, наприклад human TNF-α. У одному конкретному варіанті здійснення антитіло являє собою нейтралізуюче антитіло. У різних варіантах здійснення антитіло є рекомбінантним антитілом або моноклональним антитілом. Наприклад, антитіла даного винаходу можуть бути також генеровані з використанням різних способів фагового дисплея, відомих в даній галузі. У способах фагового дисплея, функціональні домени антитіла знаходяться на поверхні фагових частинок, які несуть полінуклеотидні послідовності, що кодують їх. Зокрема, такий фаг може бути використаний для відтворення антигензв'язувальних доменів, експресованих з репертуару або комбінаторної бібліотеки антитіл (наприклад, людини або миші). Фаг, експресуючий антигензв'язувальний домен, який зв'язує антиген, що представляє інтерес, може бути відібраний або ідентифікований антигеном, наприклад, з використанням міченого антигену або антигену, зв'язаного або захопленого на твердій поверхні або гранулі. Фаг, використовуваний в даних способах, є звичайно нитчастим фагом, що включає fd- і M13-зв'язувальні домени, експресовані з фага, з доменами антитіла Fab, Fv або стабілізованого дисульфідом Fv, рекомбінантно злитими з геном III фага або білком гена VIII. Приклади способів фагового дисплея, які можуть бути використані для одержання антитіл даного винаходу, включають способи, описані в Brinkmann et al. (1995), J. Immunol. Methods, 182:41-50; Ames et al. (1995), J. Immunol. Methods, 184:177-186; Kettleborough et al. (1994), Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al. (1997), Gene, 187 9-18; Burton et al. (1994), Adv. Immunol. 57:191-280; PCT публікаціях WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047 (PCT заявка № PCT/GB91/01134); WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982 і WO 95/20401; і патентах США №№ 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5821047; 5571698; 5427908; 5,516,637; 5780225; 5658727; 5733743 і 5969108. Як описано в наведених вище посиланнях, після селекції фага, області, що кодують антитіло, з фага можуть бути виділені і використані для генерування повних антитіл, що включають антитіла людини або будь-який інший бажаний антигензв'язувальний фрагмент, і експресовані в будь-якому бажаному хазяїні, включаючи клітини ссавців, клітини комах, клітини рослини, дріжджі і бактерії, наприклад, як детально описано нижче. Наприклад, способи рекомбінантного одержання фрагментів Fab, Fab' і F(ab')2 можуть бути також використані із застосуванням способів, відомих в даній галузі, таких, як описано в PCT публікації WO 92/22324; Mullinax et al. (1992), BioTechniques, 12(6):864-869; і Sawai et al. (1995), Am. J. Reprod. Immunol. 34:26-34; і Better et al. (1998), Science, 240:1041-1043. Приклади способів, які можуть бути використані для одержання одноланцюжкових Fv і антитіл, включають способи, що описані в патентах США №№ 4946778 і 5258498; Huston et al. (1991), Methods Enzymol. 203:46-88; Shu et al. (1993), Proc. Natl. Acad Sci. USA, 90:7995-7999; і Skerra et al. (1998), Science, 240:1038-1041. Альтернативно скринінгу бібліотек рекомбінантних антитіл з використанням фагового дисплея, інші методології, відомі в даній галузі для скринінгу комбінаторних бібліотек, можуть бути використані для ідентифікації антитіл подвійної специфічності даного винаходу. Одним типом альтернативної системи експресії є система, в якій бібліотека рекомбінантних антитіл експресується у вигляді злиття РНК-білок, як описано в PCT публікації WO 98/31700 і в Roberts and Szostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:12297-12302. В даній системі створюється ковалентне злиття між мРНК і пептидом або білком, який кодує in vitro трансляцію синтетичної мРНК, яка несе пуроміцин, пептидилакцепторний антибіотик, на її 3-кінці. Таким чином, специфічна мРНК може бути збагачена з комплексної суміші мРНК (наприклад, комбінаторної бібліотеки) на основі властивостей кодованого пептиду або білка, наприклад антитіла або його частини, наприклад, шляхом зв'язування антитіла або його частини з антигеном з подвійною специфічністю. Послідовності нуклеїнових кислот, що кодують антитіла або їх частини, одержані скринінгом таких бібліотек, можуть бути експресовані рекомбінантними способами, як описано вище (наприклад, в клітинах-хазяїнах ссавців), і, крім того, можуть бути піддані додатковому дозріванню афінності або за допомогою додаткових раундів скринінгу злиття мРНК-пептид, в яких були введені мутації в початково відібраній послідовності(ях), або іншими способами для дозрівання афінності in vitro рекомбінантних антитіл, як описано вище. У іншому аспекті антитіла даного винаходу можуть бути також генеровані з використанням способів дріжджового дисплея, відомих в даній галузі. У способах дріжджового дисплея використовують генетичні способи прикріплення доменів антитіл до клітинної стінки дріжджів і представлення їх на поверхні дріжджів. Зокрема, такі дріжджі можуть бути використані для представлення антигензв'язувальних доменів, експресованих з репертуару або комбінаторної бібліотеки антитіл (наприклад, людини або миші). Приклади способів дріжджового дисплея, які можуть бути використані для одержання антитіл даного винаходу, включають способи, описані 23 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Wittrup et al. в патенті США № 6699658, і Frenken et al., в патенті США № 6114147. В. Одержання рекомбінантних TNF-α-антитіл Антитіла даного винаходу можуть бути одержані будь-яким зі способів, відомих в даній галузі, наприклад, експресією з клітин-хазяїнів, де експресуючий вектор (експресуючі вектори), що кодує важкий і легкий ланцюги, трансфікують в клітину-хазяїна стандартними способами. Різні форми терміна "трансфекція" призначені для включення в них великої різноманітності способів, звичайно використовуваних для введення екзогенної ДНК в прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїна, наприклад електропорація, осадження фосфатом кальцію, DEAEдекстран-трансфекція і т. п. Хоч можна експресувати антитіла даного винаходу або в прокаріотичних, або еукаріотических клітинах-хазяїнах, розглядається експресія антитіл в еукаріотических клітинах, наприклад в клітинах-хазяїнах ссавців, оскільки такі еукаріотичні клітини (зокрема, клітини ссавців) з більшою імовірністю, ніж прокаріотичні клітини, збираються і секретують правильно укладене і імунологічно активне антитіло. Клітини-хазяїни ссавців для експресії рекомбінантних антитіл даного винаходу включають клітини яєчника Китайського хом'ячка (клітини СНО) (включаючи dhfr-CHO клітини, описані в Urlaub and Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-4220, використовувані з DHFRселектованим маркером, наприклад, як описано в Kaufman and Sharp (1982), J. Mol. Biol. 159:601-621), мієломні клітини NS0, клітини COS і клітин SP2. При введенні рекомбінантних експресуючих векторів, що кодують гени антитіл, в клітини-хазяїни, антитіла продукуються культивуванням клітин-хазяїнів протягом періоду часу, достатнього для можливості експресії антитіла в клітинах-хазяїнах або, зокрема, секреції антитіла в культуральне середовище, в якому вирощують дріжджові клітини. Антитіла можуть бути витягнуті з культурального середовища з використанням стандартних способів очищення білків. Клітини-хазяїни можуть бути також використані для одержання функціональних фрагментів антитіл, таких як Fab-фрагменти або молекули scFv. Потрібно розуміти, що варіації вищеописаної процедури входять в обсяг даного винаходу. Наприклад, може бути бажаною трансфекція клітини-хазяїна ДНК, що кодує функціональні фрагменти легкого ланцюга і/або важкого ланцюга антитіла даного винаходу. Технологія рекомбінантних ДНК може бути також використана для видалення деякої кількості або всієї ДНК, що кодує будь-який або обидва з легкого і важкого ланцюгів, які не є необхідними для зв'язування з антигенами, що представляють інтерес. Молекули, експресовані з таких укорочених молекул ДНК, також включені в антитіла даного винаходу. Крім того, можуть бути одержані біфункціональні антитіла, в яких один важкий і один легкий ланцюги є антитілом даного винаходу, і інші важкий і легкий ланцюги є специфічними для антигену, іншого ніж антигени, що представляють інтерес, за допомогою стандартних способів хімічного перехресного зшивання. У одній ілюстративній системі рекомбінантної експресії антитіла або його антигензв'язувальної частини даного винаходу, рекомбінантний експресуючий вектор, що кодує як важкий ланцюг антитіла, так і легкий ланцюг антитіла, вводять в клітини dhfr-CHO опосередкованою фосфатом кальцію трансфекцією. У рекомбінантному експресуючому векторі гени важкого ланцюга і легкого ланцюга, кожний, функціонально зв'язуються з регуляторними елементами CMV-енхансер/AdMLP-промотор для індукування високих рівнів транскрипції генів. Рекомбінантний експресуючий вектор несе також ген DHFR, який дає можливість виконання селекції клітин CHO, які були трансфіковані даним вектором, з використанням селекції метотрексатом/ампліфікації. Відібрані трансформовані клітини-хазяїни культивують для забезпечення можливості експресії важкого і легкого ланцюгів антитіла, і інтактне антитіло витягують з культурального середовища. Стандартні способи молекулярної біології використовують для приготування рекомбінантного експресуючого вектора, трансфікують клітини-хазяїни, відбирають на трансформанти, культивують клітини-хазяїни і витягують антитіло з культурального середовища. Додатково, даний винахід забезпечує спосіб синтезу рекомбінантного антитіла даного винаходу культивуванням клітини-хазяїна даного винаходу у придатному культуральному середовищі, поки не синтезується рекомбінантне антитіло даного винаходу. Спосіб може додатково включати виділення рекомбінантного антитіла з культурального середовища. 1. Анти-hTNF-α-антитіла У таблиці 5 представлений перелік амінокислотних послідовностей VH- і VL-областей (послідовності CDR позначені жирним шрифтом) анти-TNF-α-антитіл даного винаходу. 24 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 2. Химерні анти-hTNF-α-антитіла Химерне антитіло є молекулою, в якій різні частини антитіла одержані з різних видів тварин таким чином, що антитіла мають варіабельні області, одержані з мишачого моноклонального антитіла і константної області імуноглобуліну людини. Способи одержання химерних антитіл відомі в даній галузі і обговорюються детально в прикладі 2.1. Див., наприклад, Morrison (1985), Science, 229:1202; Oi et al. (1986), BioTechniques, 4:214-221; Gillies et al. (1989), J. Immunol. Methods, 125:191-202; патенти США №№ 5807715; 4816567 і 4816397. Крім того, можуть бути використані способи, розроблені для одержання "химерних антитіл" (Morrison et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855; Neuberger et al. (1984), Nature, 312:604-608; Takeda et al. (1985), Nature, 314:452-454; сплайсингом генів з молекули антитіла миші придатної антигенспецифічності разом з генами з молекули антитіла людини придатної біологічної активності. У одному варіанті здійснення химерні антитіла даного винаходу одержують заміною константної області важкого ланцюга мишачих моноклональних анти-hTNF-α-антитіл, описаних в розділі 1, константною областю IgG1 людини. 3. CDR-трансплантовані анти-TNF-α-антитіла CDR-трансплантовані антитіла даного винаходу містять послідовності варіабельної області важкого і легкого ланцюгів з антитіла людини, де одна або більше CDR-областей VH і/або VL замінені CDR-послідовностями мишачих антитіл даного винаходу. Каркасна послідовність з будь-якого антитіла людини може служити як шаблон для трансплантування CDR. Однак пряма заміна ланцюга на такому каркасі часто приводить до деякої втрати афінності зв'язування з антигеном. Чим більш гомологічним є антитіло людини відносно вихідного мишачого антитіла, тим менш імовірною є можливість того, що об'єднання мишачих CDR з каркасом людини буде вводити спотворення в CDR, які можуть зменшити афінність. Таким чином, в одному варіанті здійснення варіабельний каркас людини, який вибраний для заміни мишачого варіабельного каркаса, за винятком CDR, має щонайменше 65 % ідентичність послідовності з варіабельною областю мишачого антитіла. У одному конкретному варіанті здійснення варіабельні області людини і миші, за винятком CDR, мають щонайменше 70 % ідентичність послідовності. У одному конкретному варіанті здійснення варіабельні області людини і миші, за винятком CDR, мають щонайменше 75 % ідентичність послідовності. У одному конкретному варіанті здійснення 25 UA 107490 C2 5 варіабельні області людини і миші, за винятком CDR, мають щонайменше 80 % ідентичність послідовності. Способи одержання химерних антитіл відомі в даній галузі і обговорюються детально в прикладі 2.2. (також див. Європейський патент № 0239400; PCT публікацію WO 91/09967; патенти США №№ 5225539; 5530101 і 5585089), підгонка структури CDR до антигену або переробка поверхні (EP 0592106; EP 0519596; Padlan (1991), Mol. Immunol. 28(4/5):489-498; Studnicka et al. (1994), Protein Eng. 7(6):805-814; Roguska et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:969-973) і перетасовування ланцюга (патент США № 5565352). У одному конкретному варіанті здійснення винахід забезпечує CDR-трансплантовані антитіла з VH- і/або VL-ланцюгами, описаними в таблиці 6. 10 15 20 25 30 35 4. Гуманізовані анти-hTNF-α-антитіла Гуманізовані антитіла являють собою молекули антитіл з антитіла виду нелюдини, що зв'язують бажаний антиген, які мають одну або більше областей, що визначають комплементарність (CDR), з виду нелюдини і каркасних областей з молекули імуноглобуліну людини. Відомі Ig-послідовності людини описані, наприклад, в: www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html; 26 UA 107490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/lNTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk;abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). Такі імпортовані послідовності можуть бути використані для зменшення імуногенності або зменшення, збільшення або модифікації зв'язування, афінності, швидкості асоціації, швидкості дисоціації, авідності, специфічності, напівжиття в організмі або будь-якої іншої придатної характеристики, як відомо в даній галузі. Каркасні залишки в каркасних областях людини можуть бути замінені відповідним залишком з CDR донорного антитіла для зміни, поліпшення, зв'язування антигену. Каркасні заміни ідентифікують способами, добре відомими в даній галузі, наприклад моделюванням взаємодій CDR і каркасних залишків для ідентифікації каркасних залишків, важливих для зв'язування антигену і порівняння послідовності для ідентифікації незвичайних каркасних залишків в конкретних положеннях (див., наприклад, патент США № 5585089; Riechmann et al. (1988), Nature, 332:323-327). Тривимірні моделі імуноглобуліну є звичайно доступними і знайомі фахівцям в даній галузі. Доступними є комп'ютерні програми, які ілюструють і відтворюють можливі тривимірні конформаційні структури вибраних кандидатних послідовностей імуноглобуліну. Інспекція таких відтворень робить можливим аналіз імовірної ролі залишків в функціонуванні кандидатної послідовності імуноглобуліну, тобто аналіз залишків, які впливають на здатність кандидатного імуноглобуліну зв'язувати його антиген. Таким чином, залишки FR можуть бути вибрані і об'єднані з консенсусних і імпортних послідовностей так, що досягається бажана характеристика антитіла, така як збільшена афінність відносно антигену-мішені (антигенів-мішеней). Як правило, залишки CDR прямо і найбільш суттєво впливають на зв'язування антигену. Антитіла можуть бути гуманізовані з використанням різних способів, відомих в даній галузі, таких як, але без обмеження, способи, описані в Jones et al. (1986), Nairn, 321:522-525; Verhoeyen et al. (1988), Science, 239:1534-1536; Sims et al. (1993), J. Immunol. 151:2296-2308; Chothia and Lesk (1987), J. Mol. Biol. 196:901-917; Carter et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289; Presta et al. (1993), J. Immunol. 151:2623-2632; Padlan (1991), Mol. Immunol. 28(4/5):489-498; Studnicka et al. (1994), Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska. et al. (1994), Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 91:969-973; PCT публікації WO 91/09967, WO 99/06834 (міжнародна заявка № PCT/US98/16280), WO 97/20032 (заявка № PCT/US96/18978), WO 92/11272 (заявка № PCT/US91/09630), WO 92/03461 (заявка № PCT/US91/05939), WO 94/18219 (заявка № PCT/US94/01234), WO 92/01047 (заявка № PCT/GB91/01134), WO 93/06213 (заявка № PCT/GB92/01755), WO 90/14443, WO 90/14424 і WO 90/14430; Європейські публікації EP 0592106, EP 0519596 і EP 0239400, патенти США №№ 5565332; 5723323; 5976862; 5824514; 5817483; 5814476; 5763192; 5723323; 5,766,886; 5714352; 6204023; 6180370; 5693762; 5530101; 5585089; 5225539 і 4816567. С. Одержання антитіл і продукуючих антитіла клітинних ліній У одному варіанті здійснення анти-TNF-α-антитіла даного винаходу виявляють високу здатність знижувати або нейтралізувати активність TNF-α, наприклад, як оцінювали будь-яким з декількох аналізів in vitro і in vivo, відомих в даній галузі. Альтернативно, анти-TNF-α-антитіла даного винаходу виявляють також високу здатність збільшення або агонізації активності TNF-α. У конкретних варіантах здійснення ізольоване антитіло або його антигензв'язувальна частина зв'язує TNF-α, причому антитіло або його антигензв'язувальна частина дисоціюється з -1 TNF-α людини з константою швидкості дисоціації приблизно 0,1 с або менше, як визначено поверхневим плазмонним резонансом, або може інгібувати активність TNF-α людини з IC50 -6 приблизно 110 M або менше. Альтернативно, антитіло або його антигензв'язувальна частина -2 -1 може дисоціюватися з TNF-α людини з константою швидкості дисоціації Koff приблизно 110 с або менше, як визначено поверхневим плазмонним резонансом, або може інгібувати активність 27 UA 107490 C2 -7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 TNF-α людини з IC50 приблизно 110 М або менше. Альтернативно, антитіло або його антигензв'язувальна частина може дисоціюватися з TNF-α людини з константою швидкості -3 -1 дисоціації приблизно 110 с або менше, як визначено поверхневим плазмонним резонансом, -8 або може інгібувати активність TNF-α людини з IC50 приблизно 110 М або менше. Альтернативно, антитіло або його антигензв'язувальна частина може дисоціюватися з TNF-α -4 -1 людини з константою швидкості дисоціації приблизно 110 с або менше, як визначено поверхневим плазмонним резонансом, або може інгібувати активність TNF-α людини з IC50 -9 приблизно 110 М або менше. Альтернативно, антитіло або його антигензв'язувальна частина -5 -1 може дисоціюватися з TNF-α людини з константою швидкості дисоціації приблизно 110 с або менше, як визначено поверхневим плазмонним резонансом, або може інгібувати активність -10 TNF-α людини з IC50 приблизно 110 М або менше. Альтернативно, антитіло або його антигензв'язувальна частина може дисоціюватися з TNF-α людини з константою швидкості -5 -1 дисоціації приблизно 110 с або менше, як визначено поверхневим плазмонним резонансом, -11 або може інгібувати активність TNF-α людини з IC50 приблизно 110 М або менше. У деяких варіантах здійснення антитіло містить константні області важкого ланцюга, такі як константні області IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM або IgD. У одному варіанті здійснення константні області важкого ланцюга являють собою константні області важкого ланцюга IgG1 або константні області важкого ланцюга IgG4. Крім того, антитіло може містити константну область легкого ланцюга або константну область легкого ланцюга каппа, або константну область легкого ланцюга лямбда. У іншому варіанті здійснення антитіло містить константну область легкого ланцюга каппа. Альтернативно, частина антитіла може бути, наприклад, Fabфрагментом або одноланцюжковим Fv-фрагментом. Заміни амінокислотних залишків в Fc-частині для зміни ефекторної функції антитіла відомі в даній галузі (див. патенти США №№ 5648260 і 5624821). Fc-частина антитіла опосередковує декілька важливих ефекторних функцій, наприклад індукцію цитокінів, ADCC, фагоцитоз, комплементзалежну цитотоксичність (CDC) і період напівжиття/швидкість кліренсу антитіла і комплексів антиген-антитіло. У деяких випадках ефекторні функції є бажаними для терапевтичного антитіла, але в інших випадках можуть не бути необхідними або навіть бути шкідливими, залежно від терапевтичних цілей. Деякі ізотипи IgG людини, зокрема IgG1 і IgG3, опосередковують ADCC і CDC за допомогою зв'язування з FcγR і комплементом Clq, відповідно. Неонатальні Fc-рецептори (FcRn) є критичними компонентами, що визначають час напівжиття антитіл в кровотоці. Ще в іншому варіанті здійснення щонайменше один амінокислотний залишок замінений в константній області антитіла, наприклад Fc-області антитіла, так що ефекторні функції антитіла є зміненими. Один варіант здійснення забезпечує мічений зв'язувальний білок, де антитіло або частина антитіла є дериватизованими або зв'язаними з іншою функціональною молекулою (наприклад, іншим пептидом або білком). Наприклад, мічений зв'язувальний білок даного винаходу може бути одержаний функціональним зв'язуванням антитіла або частини антитіла даного винаходу (хімічним зв'язуванням, генетичним злиттям, нековалентною асоціацією або іншим чином) з однією або декількома іншими молекулярними частинками, такими як інше антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло або діатіло), детектуючий агент, цитотоксичний агент, фармацевтичний агент і/або білок або пептид, які можуть опосередковувати асоціацію антитіла або частини антитіла з іншою молекулою (такою як корова область стрептавідину або полігістидинова мітка). Використовувані детектовані агенти, якими може бути дериватизоване антитіло або частина антитіла, включають флуоресцентні сполуки. Приклади флуоресцентних детектованих агентів включають флуоресцеїн, ізотіоціанат флуоресцеїну, родамін, 5-диметиламін-1нафталінсульфонілхлорид, фікоеритрин і т. п. Антитіло може бути також дериватизоване детектованими ферментами, такими як лужна фосфатаза, пероксидаза хрону, глюкозооксидаза і т. п. При дериватизації антитіла детектованим ферментом його детектують додаванням додаткових реагентів, які цей фермент використовують для продукування детектованого продукту реакції. Наприклад, в присутності як детектованого агента пероксидази хрону, додавання пероксиду водню і діамінобензидину приводить до забарвленого продукту реакції, який є детектованим. Антитіло може бути також дериватизоване біотином і детектоване за допомогою посереднього вимірювання зв'язування авідину або стрептавідину. Інший варіант даного винаходу забезпечує кристалізований зв'язувальний білок. У одному варіанті здійснення винахід стосується кристалів повних анти-TNF-α-антитіл і їх фрагментів, і препаратів і композицій, що містять такі кристали. У одному варіанті здійснення кристалізований білок має більший час напівжиття in vivo, ніж розчинна копія зв'язувального білка. У іншому варіанті здійснення зв'язувальний білок зберігає біологічну активність після кристалізації. Кристалізовані зв'язувальні білки даного винаходу можуть бути одержані згідно зі 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюTnf-a
Автори англійськоюBenatuil, Lorenzo, Ghayur, Tariq, Goodreau, Carrie, L., Isakson, Peter, C., Salfeld, Jochen
Автори російськоюБенатуил Лоренцо, Гхаюр Тарик, Гудро Керри Л., Исаксон Питер С., Зальфелд Йохен
МПК / Мітки
МПК: A61K 39/395
Мітки: білок, tnf-a-зв'язувальний
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/78-107490-tnf-a-zvyazuvalnijj-bilok.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Tnf-a-зв’язувальний білок</a>
Дезоксирибонуклеїнова кислота, яка кодує білок глутатіон-s-трансферазу, білок
Номер патенту: 51642
Опубліковано: 16.12.2002
Автори: Бізелер Барбара, Хайн Рюдігер, Манн Карльхайнц, Райф Ханс-Йорг, Томцік Юрген, Райнемер Петер
МПК: C12N 1/21, A01H 5/00, C12N 15/82, C12N 9/10, C12N 15/54
Мітки: дезоксирибонуклеїнова, кодує, білок, яка, глутатіон-s-трансферазу, кислота
Формула / Реферат:
1. ДНК (дезоксирибонуклеїнова кислота), яка кодує білок глутатіон-S-трансферазу IIIс (GSTIIIc) з послідовністю:.2. ДНК згідно з п. 1, яка відрізняється тим, що має послідовність3. ДНК згідно з п. 1, яка відрізняється тим, що має послідовність ДНК GSTIIIc, яка міститься у векторній плазміді рЕТЗа- GSTIIIc.4. ДНК згідно з будь яким з пп. 1-3, яка відрізняється тим, що існує у формі дволанцюгової...
Рекомбінантний, очищений, модифікований генноінженерно білок, продукований бактеріями е.coli, імітуючий коровий білок вірусу імунодефіциту людини першого типу ( gag віл-1)
Номер патенту: 14847
Опубліковано: 18.02.1997
Автори: Міхайлова Татьяна Гавріловна, Чумак Ростислав Максимович, Мартиненко Дмитро Леонідович, Чєрєпанов Пьотр Алєксєєвіч
МПК: C07K 14/155, C12N 15/49
Мітки: вірусу, віл-1, людини, очищений, коровий, імунодефіциту, продукований, бактеріями, e.coli, рекомбінантний, генноінженерно, типу, першого, білок, модифікований, імітуючий
Формула / Реферат:
Рекомбінантний, очищений, модифікований генно-інженерно білок, продукований бактеріями Е.соlі, імітуючий коровий білок вірусу імунодефіциту людини першого типу (GAG ВІЛ-1), який має основні імунодомінантігі епітопи, притаманні нативним білкам gpl7, gp24 і gpl5 BІЛ-1, злитний, має молекулярну масу 70376 Д, містить в собі 623 амінокислотних залишка, ізоелектричну точку 8,54 і відповідає загальній формулі N-бета-Gal-pl7-p24-pl5-COOH.
Рекомбінантний, очищений, модифікований генно-інженерно білок, продукований бактеріями е.coli, імітуючий білок оболонки вірусу імунодефіциту людини першого типу (env biл-1)
Номер патенту: 14845
Опубліковано: 18.02.1997
Автори: Чумак Ростислав Максимович, Міхайлова Татьяна Гавріловна, Мартиненко Дмитро Леонідович, Чєрєпанов Пьотр Алєксєєвіч
МПК: C12N 15/49, C07K 14/155
Мітки: очищений, рекомбінантний, імітуючий, biл-1, людини, імунодефіциту, бактеріями, продукований, білок, вірусу, типу, генно-інженерно, модифікований, оболонки, першого, e.coli
Формула / Реферат:
Рекомбінаитний, очищений, модифікований генно-інженерно білок, продукований бактеріями Е.соlі, імітуючий білок оболонки вірусу імунодефіциту людини першого типу (Env ВІЛ-1), містить в собі 531 амінокислотний залишок і відповідає загальній формулі N-бета-Gal-pl20-р41-СООН.
Рекомбінантний, очищений, модифікований генно-інженерно білок, продуктований бактеріями e.coli, імітуючий білок оболонки trepanema pallidum
Номер патенту: 14746
Опубліковано: 04.02.1997
Автори: Чєрєпанов Пьотр Алєксєєвіч, Чумак Ростислав Максимович, Мартиненко Дмитро Леонідович, Міхайлова Татьяна Гавріловна
МПК: C12N 15/31, C07K 14/20
Мітки: білок, очищений, бактеріями, імітуючий, оболонки, trepanema, рекомбінантний, pallidum, e.coli, продуктований, генно-інженерно, модифікований
Формула / Реферат:
Рекомбінантний, очищений, модифікований генно-інженерно білок, продукований бактеріями Е.соlі, імітуючий білок оболонки Trepanema pallidum, який має основні імунодомінантні епітопи, притаманні нативному білку, має молекулярну масу 106 кД, містить в собі 883 амінокислотних залишків і відповідає загальній формулі N-бетa-Gal-pTr-COOH.
Рекомбінантний, очищений, модифікований генно-інжерно білок, продукований бактеріями е.coli, імітуючий білок оболонки вірусу імунодефіциту людини другого типу ( env віл-2)
Номер патенту: 14842
Опубліковано: 18.02.1997
Автори: Мартиненко Дмитро Леонідович, Міхайлова Татьяна Гавріловна, Чєрєпанов Пьотр Алєксєєвіч, Чумак Ростислав Максимович
МПК: G01N 33/531, C07K 14/155, C12N 15/49
Мітки: очищений, імітуючий, типу, e.coli, вірусу, генно-інжерно, бактеріями, людини, модифікований, другого, білок, імунодефіциту, віл-2, продукований, оболонки, рекомбінантний
Формула / Реферат:
Рекомбінантний, очищений, модифікований генно-інженерно білок, продукований бактеріями Е.соlі, імітуючий білок оболонки вірусу імунодефіциту людини другого типу (Env ВІЛ-2), який має основні імунодомінантні епітопи, притаманні нативним білкам gp 110, gp38 ВІЛ-2, злитний, має молекулярну масу 67750 Д, містить в собі 1382 амінокислотних залишка і відповідає загальній формулі N-бета-GаІ-рІ 10-р38-СООН.
Попередній патент: Спосіб виготовлення будівельної панелі (варіанти)
Наступний патент: Похідні арилетинілу
Випадковий патент: Пристрій для стиснення цифрових телевізійних сигналів кольорового зображення