Потенціометричний біосенсор на основі креатиніндеімінази для визначення концентрацій креатиніну у водних розчинах

Реферат: Потенціометричний біосенсор на основі креатиніндеімінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах складається з потенціометричного датчика на основі двох рНчутливих польових транзисторів. На перший транзистор нанесено першу мембрану на основі силікаліту, на яку далі нанесено другу ферментну мембрану на основі креатиніндеімінази, що є чутливою до креатиніну. На другий транзистор також нанесено першу мембрану на основі силікаліту та другу референтну мембрану. Вказаний біосенсор призначений для підключення до приладу для потенціометричних вимірювань. Виходи цього приладу підключені до відповідних входів комп'ютера. UA 101078 U (12) UA 101078 U UA 101078 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заявлена корисна модель належить до галузі медицини та охорони здоров'я і може бути використана для перевірки функціональності нирок, печінки, а саме для визначення концентрації креатиніну під час процедури гемодіалізу та при прямому аналізі у сироватці крові, а більш конкретно до потенціометричного біосенсора на основі креатиніндеімінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах. Одним із основних кінцевих продуктів азотистого обміну людини є креатинін. В організмі людини креатинін продукується в результаті дефосфорилювання фосфокреатину або ж за рахунок дегідратації креатину [1]. Визначення рівня креатиніну у різних фізіологічних рідинах є корисним для оцінки ниркової, м'язової та щитовидної дисфункції [2]. Креатинін є маркером м'язової маси і є відображенням повільного обміну білка у м'язах. Креатиніновий показник можна розглядати як показник запасів азоту (наприклад, пацієнти з дистрофією мають низький вихід креатиніну). Фізіологічний рівень креатиніну сироватки крові знаходиться в межах 0,050,11 мМ [3]. Концентрація креатиніну вища, як 0,14 мМ вимагає додаткових лабораторних досліджень, тоді як рівень 0,5 мМ є індикатором ниркової дисфункції. За паталогічних екстремальних умов концентрація креатиніну може сягати 1 мМ [4, 5]. Рівень креатиніну у діалізаті становить 0,05-0,35 мМ. Для моніторингу цього аналіту часто використовують колориметричні методи аналізу. Всі ці методи складні у використанні, оскільки необхідний контроль температури, рН, складна пробо підготовка аналізованого зразку, що значно сповільнює аналіз. Колориметричне визначення креатиніну базується на реакції Яффе з використанням пікрату [6]. Основним недоліком методу Яффе є велика кількість інтерферентів, що призводять до хибних результатів. Відповідно, необхідно проводити додаткову обробку біозразків: адсорбцію, екстракцію, діаліз, використовувати ферменти, щоб видалити інтерферуючі речовини. Даний шлях призводить до зниження точності та підвищення вартості аналізу на креатинін. Окрім колориметричного визначення креатиніну існує друга група методів більш специфічних, які ґрунтуються на ферментативних реакціях з колориметричною детекцією. Найчастіше для визначення креатиніну використовують креатиніназу, що каталізує гідроліз креатиніну до креатину, який потім визначають в креатинкіназній реакції [7]. На жаль, ферментативні оптичні методи обмежені нестабільністю ферментів при зберіганні та експлуатації, складністю методики аналізу, а також високою вартістю обладнання і затратних матеріалів, крім того, необхідна наявність висококваліфікованого персоналу. На сьогоднішній день існує низка повідомлень про розробку біосенсорів та біосенсорних систем для визначення креатиніну [5, 8-14]. В основі роботи більшості цих систем лежать потенціометричні перетворювачі, які чутливі до амонію, тому ендогенний амоній, який присутній + + в біозразках, а також К , Na , стають причиною інтерференції. Для видалення інтерферуючих речовин було розроблено декілька стратегічних напрямків, наприклад розділення за допомогою газової дифузії чи іонообмінної колонки, що в свою чергу, призводить до складної попередньої підготовки проби з використанням додаткового обладнання. В основі роботи меншої частини відомих біосенсорів [11-14] лежать більш перспективні потенціометричні перетворювачі, які чутливі до протонів. Але зазвичай в процесі іммобілізації використовують шкідливі для здоров'я людини токсичні реагенти або ультрафіолетове випромінювання [12, 13]. В роботі [13] описано потенціометричний біосенсор на основі креатиніндеімінази для визначення креатиніну, що складається з потенціометричного датчика на основі двох рНчутливих польових транзисторів, на один з яких нанесена робоча ферментна мембрана на основі креатиніндеімінази, іммобілізованої в PVA-SBQ, що є чутливою до креатиніну. Для виготовлення даного типу біосенсора необхідно використовувати шкідливе для опромінення людини ультрафіолетове випромінювання. Відповідно при виготовленні даного типу біосенсора з урахуванням усіх норм безпеки необхідно використовувати дуже складну методику іммобілізації ферменту. Крім того, з використанням даного типу іммобілізації отримані біосенсори характеризуються не найкращою чутливістю з границею визначення креатиніну - 20 мкМ. В роботі [14] описано відомий потенціометричний біосенсор на основі рН-чутливих польових транзисторів та креатиніндеімінази коіммобілізованої з бичачим сироватковим альбуміном (БСА) на поверхні перетворювача зшиваючим токсичним реагентом глутаровим альдегідом (ГА). Оскільки відомо, що глутаровий альдегід це токсична речовина при виготовленні даного типу біосенсора з урахуванням усіх норм безпеки, необхідно також використовувати дуже складну методику іммобілізації ферменту. Крім того, з використанням даного типу іммобілізації отримані біосенсори також характеризуються не найкращою чутливістю та швидкістю сигналу (3-4 хв) з границею визначення креатиніну - 20 мкМ. 1 UA 101078 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В основу запропонованої корисної моделі поставлена задача створення такого потенціометричного біосенсора на основі креатиніндеімінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах, який би характеризувався кращою чутливістю до креатиніну (границя визначення - 2 мкМ) та був більш перспективним та дешевим для подальшого масового виробництва. Поставлена задача вирішується запропонованим потенціометричним біосенсором на основі креатиніндеімінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах, що складається з потенціометричного датчика на основі двох рН-чутливих польових транзисторів, а відповідно до пропозиції, на перший транзистор нанесено першу мембрану на основі силікаліту, на яку далі нанесено другу ферментну мембрану на основі креатиніндеімінази, що є чутливою до креатиніну, на другий транзистор також нанесено першу мембрану на основі силікаліту та другу референтну мембрану, а вказаний біосенсор призначений для підключення до приладу для потенціометричних вимірювань, а виходи цього приладу підключені до відповідних входів комп'ютера. Поставлена задача вирішується за рахунок безпечної, простої та швидкої процедури іммобілізації, а саме адсорбцією креатиніндеімінази на силікаліті. Прилад для потенціометричних вимірювань, розроблений та виготовлений в Інституті фізики напівпровідників ім. В.Є. Лашкарьова НАН України [15] Визначення креатиніну запропонованим потенціометричним біосенсором на основі креатиніндеімінази для визначення концентрацій креатиніну у водних розчинах, дозволило проводити більш швидкий та точний аналіз біозразків, а сам біосенсор став більш перспективним для подальшого виробництва, за рахунок відмови, в процесі іммобілізації, від токсичних речовин та шкідливого УФ випромінювання. В іншу чергу, застосування при створенні біосенсора методу адсорбції креатиніндеімінази на силікаліті зменшило границю визначення креатиніну. В основі роботи потенціометричниого біосенсора на основі креатиніндеімінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах лежить наступна ферментативна реакція: + Креатиніндеіміназа Креатинін + Н2О  N-метилгідантоїн + NH4 В процесі проходження ферментативної реакції креатиніндеімінази розщеплює креатинін при цьому змінюється концентрація протонів у ферментній мембрані, відповідно, відбувається зміна рН, яку і можна реєструвати за допомогою рН-чутливого польового транзистора [16]. Суть пропонованої корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де на фіг. 1 схематично представлено пропонований ферментний біосенсор на основі рН-ПТ для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах; на фіг.2 показано блок-схему портативної потенціометричної біосенсорної системи для визначення концентрації креатиніну; на фіг. 3 наведено калібрувальні графіки залежності величини відгуків біосенсорів на основі креатиніндеімінази адсорбованої на силікаліті та іммобілізованої в парах ГА від концентрації креатиніну; а на фіг. 4 продемонстровано таблицю порівняння основних робочих характеристик потенціометричного біосенсору на основі креатиніндеімінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах. Пропонований потенціометричний біосенсор на основі креатиніндеімінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах (Фіг. 1) складається з двох рН-ПТ (зигзагоподібні області затворів) - 1, 2, на які спочатку наносяться перші ідентичні мембрани на основі силікаліту - 3 та 4, відповідно. Далі на перший транзистор з мембраною на основі силікаліту (3) наносять другу робочу мембрану з креатиніндеіміназою селективною до креатиніну (5), а на другий транзистор з першою мембраною на основі силікаліту (4) наносять другу референтну мембрану з сироватковим альбуміном бика (6). Зигзагоподібна геометрія затворних областей транзисторів має відношення довжини каналу до його ширини рівним 100, що забезпечує + достатній рівень крутизни перехідної характеристики. р -дифузійні шини (7) з контактами до стоку і витоку кожного з транзисторів виведені на край чипу, як і виводи до вбудованих мікроелектродів порівняння - 8. В центрі транзисторів розташовані контакти до η-підкладок - 9. Алюмінієві контактні площини до усіх транзисторних виходів, виведені на край кожного з чипів 10. Вказаний потенціометричний біосенсор 11 /ПБ/ (Фіг.2) підключений до відповідних входів портативного потенціометричного приладу 12 /ПП/. Виходи приладу 12 /ПП/ підключені до відповідних входів блоку живлення 13 /БЖ/ та комп'ютера 14 /ПК/. Пропонований потенціометричний біосенсор на основі креатиніндеімінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах працює наступним чином. 2 UA 101078 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Попередньо виготовляли біоселективні мембрани. Для створення гелю для першої мембрани готували розчин з вмістом 5 % силікаліту у 5 мМ калій-фосфатному буфері рН 7,4. Отриманий розчин силікаліту поміщали в ультразвукову баню на дві години для гомогенізації розчину. Далі, на робочі поверхні обох рН-чутливих польових транзисторів, наносили 0,2 мкл гомогенного розчину силікаліту. Для фіксації силікаліту на поверхні транзисторів, датчик розміщували у сухо-жаровій шафі на 20-25 хвилин за температури 60-70 С. Для створення гелю для другої ферментної мембрани готували розчин з вмістом 20 % креатиніндеімінази, 20 % БСА, 4 % лактітол, 0,4 % DEAE-декстран, 10 % гліцерину у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,4. До складу гелів додавався гліцерин для стабілізації ферменту при іммобілізації та запобігання передчасному підсиханню розчину, нанесеного на поверхню перетворювача. В свою чергу, сироватковий альбумін бика в складі ферментних мембран відігравав роль стабілізуючого агенту для ферментів. Гель для створення другої референтної мембрани готувався з вмістом 40 % БСА, 10 % гліцерину у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,4. Далі приготовлені ферментний та референтний гелі наносили на поверхню транзисторів вкритих першими мембранами на основі силікаліту (по 0,1 мкл робочого та референтного) і залишали на відкритому повітрі на 15-20 хвилин до повного висихання. Таким чином, біоселективна мембрана біосенсора, нанесена на робочу область першого рН-чутливого польового транзистора, складалась з 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,4, та з наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): 2-10 силікаліт, 5-15 креатиніндеіміназа, 5-15 БСА, 5-15 гліцерин, 1-5 лактітол, 0,1-0,6 DEAE-декстран. Ідентична референтна мембрана наносились на робочі області обох біосенсорів, і складались з 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,4, та з наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): 2-10 силікаліт, 10-30 БСА, 5-15 гліцерин 1-5 лактітол, 0,1-0,6 DEAE-декстран. Співвідношення компонентів біоселективних мембран біосенсорної системи було отримано експериментально. Його підібрали для покращення аналітичних характеристик біосенсорів, таких як селективність, чутливість, операційна стабільність та ін. Після процесу іммобілізації біосенсори висушували 15 хвилин на повітрі за кімнатної температури. Перед початком роботи, для видалення надлишку незв'язаних силікаліту, ферменту та інших компонентів мембран, біосенсори відмивали протягом 20 хвилин у буфері, в якому і проводили подальші досліди. Приклад аналізу вмісту креатиніну в розчині. Біосенсор заздалегідь під'єднаний до приладу для потенціометричних вимірювань поміщали до вимірювальної комірки 1,5 мл, заповненої 5 мМ фосфатним буфером, рН 7,4, та витримували декілька хвилин для отримання стабільної базової лінії. Потім додавали певну аліквоту модельного розчину креатиніну, отримували сигнал. Сигнал від біосенсора автоматично оброблявся комп'ютером і виводився у графічному вигляді на екран монітора. Шляхом додавання різної кількості певних аліквот модельних розчинів креатиніну було побудовано калібрувальну криву для визначення концентрації креатиніну (Фіг.З). Після отримання кожного відгуку біосенсор відмивали від продукту, змінюючи робочий буфер мінімум 3 рази кожні 15-30 с, до виходу сигналу на базову лінію. Границя визначення креатиніну становила - 2 мкМ, що в 10 разів нижче ніж у найбільш близького за технічною суттю біосенсора з границею визначення 20 мкМ. Визначення концентрації креатиніну в аналізованих зразках діалізату та крові здійснювали за калібрувальною кривою. Спочатку додавали аліквоту проби до вимірювальної комірки та отримували відгук біосенсора. Далі за калібрувальною кривою вираховували концентрацію креатиніну в невідомій пробі. Основні робочі характеристики запропонованого потенціометричного біосенсора на основі креатиніндеімінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах та найбільш близького до нього за технічною суттю біосенсора на основі креатиніндеімінази іммобілізованої в парах ГА дуже відрізнялись (Фіг.4). Наприклад, час відгуку запропанованого біосенсора на основі креатиніндеамінази адсорбованої на силікаліті та 3 UA 101078 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 його час регенерації складали - 1 хв, що щонайменше в три рази швидше, ніж у біосенсора на основі фермента іммобілізованого в парах ГА. Також запропонований біосенсор характеризувався ширшим лінійним діапазоном, кращою чутливістю до субстрату та в 10 разів меншою похибкою вимірювання. Джерела інформації:: 1. М. Czauderna, J.Kowalczyk, Simple, selective, and sensitive measurement of urea in body fluids of mammals by reversed-phase ultra-fast liquid chromatography // Czech J. Anim. Sci. -2012.Vol. 57. -Jftl.-P. 19-27. 2. J.-C. Chen, A.S. Kumar, H.-H. Chung, S.-H. Chien, M.-C. Kuo, J.-M. Zen, An enzymeless electrochemical sensor for the selective determination of creatinine in human urine // Sensor and Actuators B. - 2006. - Vol. 115. - P. 473-480. 3. Koncki R., Recent development in potentiometric biosensors for biomedical analysis // Analytica Chimica Acta. - 2007. - Vol. 599. - P. 7-15. 4. Р.С. Pandey, A.P. Mishra, Novel potentiometric sensing of creatinine // Sensor and Actuators B. - 2004. - Vol. 99. - P. 230-235. 5. A.P. Soldatkin, J. Montoriol, W. Sant, С Martelet, N. Jaffrezic-Renault, Creatinine sensitive biosensor based on ISFETs and creatinine deiminase immobilised in BSA membrane // Talanta. 2002. - Vol. 58. - P. 351-357. 6. M. Jaffe, Uber den Niederschlag, welchen Pikrinsaure in normalen Harn erzeugt. und iiber eine neue Reaction and Kreatinins // Z. Physiol. Chem. - 1886. - Vol. 10. - P. 391-400. 7. P.K. Jaynes, R.D. Feld, G.F. Johnson, An enzymatic reaction-rate assay for serum creatinine with a centrifugal analyzer // Clin. Chem. - 1982. - Vol. 28. - P. 114-117. 8. Anna Radomska, Robert Koncki, Krystyna pyrzynska, Stanislaw Gla_b, Bionanalytical system for control of hemodialysis treatment based on potentiometric biosensor for urea and creatinine // Analytica Chimica Acta. - 2004. - Vol. 523. - P. 193-200. 9. Jurkiewicz M, Alegret S., Almirall J., Garcia M, Fabregas E., Development of a biparametric bioanalyser for creatinine and urea. Validation of the determination of biochemical parameters associated with hemodialysis // Analyst. - 1998. - Vol. 123. - P. 1321-1327. 10. Manuel Gutierrez, Salvador Alegret, Manuel del Valle, Bioelectronic tongue for the simultaneous determination of urea, creatinine and alkaline ions in clinical samples // Biosensor and Bioelectronics. - 2008. - Vol. 23. - P. 795-802. 11. O.A. Zinchenko, S.V. Marchenko, T.A. Sergeyeva, A.L. Kukla, A.S. Pavlyuchenko, E.K. Krasyuk, A.P. Soldatkin, A.V. El'skaya, Application of creatinine-sensitive biosensor for hemodialysis control // Biosensors and Bioelectronics. - 2012,- Vol. 35. - P. 466-469. 12. A.P. Soldatkin, J. Montoriol, W. Sant, C. Martelet, N. Jaffrezic-Renault, Development of potentiometric creatinine-sensitive biosensor based on ISFET and creatinine deiminase immobilised in PVA/SbQ photopolymeric membrane // Materials Science and Engineering С - 2002. - Vol. 21. - P. 75-79. 13. Марченко С.В., Зінченко O.A., Поляков Л.С., Герешко A.M., Дзядевич С.В., Солдаткін О.П.// Біосенсор на основі креатиніндеімінази та рН-чутливого польового транзистора для аналізу креатиніну в сироватці крові // Biotechnologia Acta. - 2013. - Vol. 6, №5.-c.79-86. 14. Марченко С.В., Назаренко O.A., Кукла О.Л., Павлюченко О.С., Красюк Е.К., Солдаткін О.П. Розробка креатинін-чутливого біосенсора для медичного застосування // Sensor Electronics and Microsystem Technologies. - 2009. - Vol. 4. - с 55-62. 15. Кукла О.Л., Павлюченко О.С., Бушма О.В., Голтвянський Ю.В., Дзядевич С.В., Солдаткін О.П., Патент України на корисну модель "Аналого-цифровий іонно-сенсорний вимірювач параметрів рідких середовищ", UA №48359 МПК G01N 27/26, 27/27, заявл.26.10.2009, опубл. 10.03.2010, Бюл. №5. 16. S.V.Dzyadevych, A.P.Soldatkin, A.V.El'skaya, C.Martelet, N.Jaffrezic-Renault. Enzyme biosensors based on ion-selective field-effect transistors // Analytica Chimica Acta. - 2006, 568.P.248-258. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 60 Потенціометричний біосенсор на основі креатиніндеімінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах, що складається з потенціометричного датчика на основі двох рНчутливих польових транзисторів, який відрізняється тим, що на перший транзистор нанесено першу мембрану на основі силікаліту, на яку далі нанесено другу ферментну мембрану на основі креатиніндеімінази, що є чутливою до креатиніну, на другий транзистор також нанесено першу мембрану на основі силікаліту та другу референтну мембрану, а вказаний біосенсор 4 UA 101078 U підключений до входів приладу для потенціометричних вимірювань, а виходи цього приладу підключені до відповідних входів комп'ютера. 5 UA 101078 U Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6