Штам bacillus subtilis для одержання кормової добавки з пробіотичними властивостями

Реферат: Штам Bacillus subtilis IMB B-7513 для одержання кормової добавки з пробіотичними властивостями. UA 103296 U (12) UA 103296 U UA 103296 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільськогосподарської мікробіології та біотехнології, а саме до нового штаму Bacillus subtilis для одержання кормової добавки з антагоністичними властивостями щодо патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів, що може використовуватися при виробництві пробіотичних препаратів для лікування та профілактики хвороб сільськогосподарських тварин. В останні роки пробіотики - кормові добавки на основі штамів живих мікроорганізмів - все частіше застосовуються при вирощуванні сільськогосподарської худоби, при цьому вони забезпечують позитивний вплив на фізіологічні, біохімічні та імунні реакції через стабілізацію та оптимізацію функції його нормальної мікрофлори. Пробіотики застосовуються при дисбактеріозах, для регулювання мікробіологічних процесів у травному тракті, профілактики та лікування деяких розладів травлення інфекційної та аліментарної етіології, як замінники антибіотиків і т.д. За ефективністю дії пробіотичні препарати не поступаються деяким антибіотикам та хіміотерапевтичним засобам, але при цьому вони не спричинюють згубного впливу на нормальну мікрофлору травного тракту, не забруднюють продукти тваринництва та навколишнє середовище, тобто є екологічно чистими. На сьогоднішній день пробіотики на основі біфідобактерій, лактобактерій, аеробних спороутворюючих бактерій роду Bacillus знаходять широке застосування для профілактики та лікування інфекційних захворювань людини, сільськогосподарських тварин та птахів. Бацили, що складають основу багатьох добре відомих пробіотичних препаратів (бактисубтил, біосубтил, біоспорин, споробактерин, ентерогермін та інші), характеризуються різними спектрами антимікробної активності. Серед пробіотиків на основі штамів Bacillus subtilis на Україні застосовується біопрепарат Ендоспорин, що являє собою етіотропний пробіотик для лікування та профілактики кишкових та гнійних інфекцій та післяпологових ендометритів у сільськогосподарських тварин (Патент України №7669, МПК А61К 35/74, опубл. 01.08.2006). Він характеризується антагоністичною активністю щодо штамів бактерій родів Pseudomonas, Streptococcus, Acinetobacter, Staphylococcus, Escherichia, Proteus, Salmonella, Shigella, Candida. До його складу входять ліофілізовані життєздатні клітини штамів Bacillus subtilis IMB В-7142 та В.subtilis IMB В-7143, які доповнюють один одного за біологічною активністю. Проте недоліком даного препарату можна вважати його недостатньо високу ефективність, яка зумовлена частковою нейтралізацією пробіотичної складової травними соками шлунково-кишкового тракту. Є також відомим пробіотичний препарат "Субалін" (патент RU№ 2035185, опубл. 20.05.95), що містить рекомбінантний штам Bacillus subtilis ВКПМ В-4759, який характеризується антагоністичною активністю по відношенню до широкого спектру патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів та антивірусною активністю за рахунок синтезу інтерферону. Проте антагоністична активність вказаного штаму стосовно патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів є недостатньою. У патенті РФ № 2388813, опубл. 10.05.2010 р., описаний штам Bacillus subtilis ЗА (№282 ГИСК им. Л.А. Тарасевича), що входить до складу пробіотичного препарату, що характеризується високою антагоністичною та бактерицидною активністю за рахунок наявності амілолітичної активності. Проте додаткове підвищення рівня амілаз в організмі може мати небажаний вплив на процеси травлення. Задача даної корисної моделі полягає у створенні штаму Bacillus subtilis для одержання кормової добавки з пробіотичними властивостями, який забезпечує високий рівень антагоністичної активності щодо патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів та має здатність додатково синтезувати каротиноїди. Поставлена задача вирішується шляхом створення штаму Bacillus subtilis 1MB В-7513, який призначений для одержання кормової добавки з пробіотичними властивостями. Заявлений штам має широкий спектр антагоністичної активності щодо патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів та синтезує каротиноїди, що являють собою біологічно активні пігменти, які є ізомерами каротину, що у печінці перетворюється на вітамін А. Каротиноїди та їх метаболіти мають вплив на цілий ряд біологічних процесів, зокрема виявляють антиоксидантний вплив, що є важливим для створення оптимального раціону харчування для сільськогосподарських тварин, та дає можливість одночасного контролю інфекцій та компенсації дефіциту каротину в організмі тварин. Інфекційні захворювання шлунково-кишкового тракту та дефіцит вітаміну А призводить до значних втрат поголів'я птиці, зниження маси тіла, рівня імунітету, продуктивності тощо. Зазвичай вирішення цих проблем базується на додаванні у корм синтетичного β-каротину (вітамінні добавки вітатон, вітадекс), міцелія каротинсинтезувальних грибів Blakeslea trispora та дріжджів Rhodotorula spp. (ліколін, лікоцинол), а також біологічних препаратів на основі пробіотичних штамів бактерій роду Bacillus (BioGrow, BioPlus 2B, Toyocerin), які відновлюють 1 UA 103296 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 видовий і кількісний склад мікробіоти кишечнику та покращують загальний стан організму. Проте на сьогоднішній день не існує комплексних засобів, які б поєднували пробіотичні властивості та якості вітамінної добавки. Заявлений штам Bacillus subtilis IMB В-7513 ізольований з Оболонського заливу м. Києва у 2010 році Спосіб одержання штаму: штам отримують шляхом посіву на поживні середовища: МПА, ТС А, сусло-агар, Гаузе № 2, КА та ін. Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості штаму: грампозитивні аеробні спороутворюючі палички. На м'ясо-пептонному агарі (МПА), триптонсоєвому агарі (ТСА), картопляному агарі (КА), середовищах Гаузе № 2 та Громико виявлено значний ріст. На МПА утворює складчасті колонії з підвищеним центром, консистенція пастоподібна, жовто-гарячого кольору, краї правильної форми. На ТСА утворює складчасті колонії з підвищеним центром жовто-гарячого кольору, консистенція пастоподібна, краї правильної форми. На середовищі Громико - складчасті колонії з підвищеним центром, консистенція пастоподібна, яскраво червоного кольору, краї правильної форми. На середовищі Гаузе 2 - складчасті колонії з підвищеним центром, консистенція пастоподібна, яскраво червоного кольору, краї правильної форми. На картопляному агарі - колонії світло-бежевого кольору, консистенція пастоподібна, краї рівні. В мазках з колоній, які виросли на ТСА через 18 годин можна побачити прямі паличкоподібні клітини розміром 2,5×0,4 мкм, що розташовані поодиноко, попарно та ланцюгом. Клітина при спороутворенні не роздувається, після росту на глюкозному агарі в протоплазмі вакуолі не утворюються. На МПБ культура утворює плівку. Ферментує глюкозу, фруктозу, арабінозу, манніт, ксилозу з утворенням кислоти, дає позитивну реакцію Фогес-Проскауера, гідролізуєескулін, крохмаль, казеїн, желатину, росте при 7 % NaCl, не утилізує цитрат, не використовує пропіонат. Культура не росте в анаеробних умовах і при 10 % NaCl, не утворює газ з NO3 в анаеробних умовах. Каталазна та оксидазна реакції позитивні. Штам здатен утворювати пігменти каротиноїдної природи. Умови культивування: культивується на середовищі сусло-агар, МПА, Громико, картопляний агар за температури 37 °C. Активність штаму, а також інші промислові показники: високоактивний штам, який має виражені антагоністичні властивості щодо широкого спектра патогенних та умовно-патогенних бактерій, а саме, стафілококів, стрептококів (зони затримки росту >15 мм), ешерихій (зони затримки росту >12 мм), сальмонел (зони затримки росту >10 мм). Спосіб визначення: антагоністичні властивості досліджували методом радіальних штрихів (Єгоров, 1969). 18-год. культура висівається в центр чашки діаметром 12 см на площу, яка окреслена кругом діаметром 2,5 см. Через 3 доби інкубування за температури 37 °C підсівають 8 радіальним штрихом тест-культури з бактеріальної суспензії 5×10 кл/мл. Зони затримки росту враховують після 18-24 год. інкубування. Контролем слугували чашки без Bacillus subtilis IMB В7513. Спосіб, умови та склад середовища для довгострокового культивування штаму: штам зберігається на середовищі сусло-агар, Громико (МПА+СА), агаризованому середовищі Гаузе № 2 під шаром стерильного вазелінового масла. Пересів 1 раз в рік. Спосіб, умови та склад середовища для культивування штаму: розмноження можна проводити на середовищах аналогічного складу. Відомості про патогенність: штам не патогенний для теплокровних тварин. На кресленні наведені показники продуктивності каротинсинтезувальних штамів (вихід АСБ та кількість каротиноїдних пігментів). Корисна модель пояснюється прикладами конкретного здійснення. Приклад 1. Вирощування штаму Bacillus subtilis IMB В-7513. Культивування Bacillus subtilis lMB В-7513 проводили в умовах глибинного культивування у періодичних умовах з використанням синтетичного середовища (рН=7,0±0,3) наступного складу (г/л): Na3C6H5O7×3H2O-1,29, (NH4)2HPO4-4,75, KН2РО4-9,60, MgSO4-0,18, глюкоза - 20,00 та напівсинтетичного середовища (рН=7,5±0,2) (г/л): меляса (ДСТУ 3696-98) - 23; (NH4)2SO4-4,6; K2НРО4-2,0; FeSO4-0,035. Норма внесення інокуляту культури бактерій складала 5 об. %, що 6 7 відповідало 10 -10 колонієутворювальних одиниць на 1 мл середовища (КУО/мл). Культивування бактерій здійснювали на качалках (n=200 об/хв) за температури 37 °C протягом 2 UA 103296 U 5 10 15 36 годин. Параметри росту (фази росту, питому швидкість росту, час генерації) визначали згідно з рекомендаціями Перт С. Дж. (Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. - М.: Мир, 1978. - 116 с.) Приклад 2. Дослідження антагоністичної активності заявленого штаму. Необхідними характеристиками штамів для одержання пробіотичних препаратів є висока антагоністична активність щодо патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів, стійкість до низьких значень рН середовища та жовчі, низька адгезивна активність, відсутність генів стійкості до антибіотиків, а також авірулентність. Антагоністичну активність штаму Bacillus subtilis IMB В-7513 досліджували щодо колекційних тест-культур: Salmonella thyphimurium УКМ В-928, S. enterica УКМ В-920, S. derby ДІСК 1519, Shigella flexnery ДІСК 36/59, Proteus vulgaris УКМ В-905, P. vulgaris УКМ U-8, Staphylococcus aureus УКМ В-918, Escherichia coli УКМ В-906, отриманих з колекції культур відділу антибіотиків lMB НАН України. Антагоністичну активність заявленого штаму щодо вказаних патогенних мікроорганізмів вивчали методом відстроченого антагонізму. Рівень антагоністичної активності досліджуваних штамів оцінювали за зонами затримки росту тест-культур і виражали у мм. Штам вважали низько активним, якщо зона затримки росту тест-культур становила