2-(3-аліл-4-оксо-3,4-дигідрохіназолін-2-їл-сульфаніл)-n-(2,6-дихлорфеніл)-ацетамід, що має протипухлинну дію

Реферат: Винахід належить до органічної, фармацевтичної хімії та медицини, а саме до онкофармакологічних засобів, які мають виражену протипухлинну дію при недрібноклітинному раку легенів, і стосується 2-(3-аліл-4-оксо-3,4-дигідрохіназолін-2-їл-сульфаніл)-N-(2,6дихлорфеніл)-ацетаміду (DAM003105), що має протипухлинну активність. UA 111432 C2 (12) UA 111432 C2 O N N S Cl H N O Cl UA 111432 C2 Патент на винахід належить до органічної, фармацевтичної хімії та медицини, а саме до одержання біологічно активної сполуки 2-(3-аліл-4-оксо-3,4-дигідрохіназолін-2-іл-сульфаніл)-N(2,6-дихлорфеніл)-ацетаміду, сполуки, яка має формулу: O N N S Cl H N O Cl 5 10 15 20 25 30 , що проявляє протипухлинну активність та може бути використана при лікуванні хворих на недрібноклітинний рак легень. Рак легенів є однією з найбільш важливих проблем онкології як в Україні, так і в світі. Захворюваність раком легенів в Україні серед чоловіків становить 16 183 випадки на рік (20,2 % всіх злоякісних новоутворень у чоловіків), серед жінок - 3344 випадки на рік (4 % всіх злоякісних новоутворень у жінок). Крім значної захворюваності, необхідно відмітити надзвичайно високий рівень смертності від цієї форми пухлинної хвороби. Серед захворювань на рак легенів недрібноклітинний рак становить близько 85 % пухлин цієї локалізації. За останні 25 років прогрес ефективності лікування та підвищення виживаності хворих на недрібноклітинний рак легенів проходить дуже повільними темпами, боротьба йде не за роки життя, а за тижні. Ефективність хіміотерапії практично дійшла до свого піка. Виникла необхідність у більш ефективних та безпечних терапевтичних стратегіях, які на сьогодні починають намічатися у вигляді таргетної терапії (спрямованої на певну ціль в пухлинних клітинах). Для лікування хворих на недрібноклітинний рак легенів розроблений препарат Ерлотиніб (Тарцева, компанія Genentech, що входить до структури Roche Group). Препарат схвалений FDA та ЕМА, який зареєстровано в Україні. Ерлотиніб - таргетний препарат, що має свою мішень - рецептор епідермального фактора росту (EGFR) [1], він взаємодіє з тирозинкіназою рецептора, її АТФ-зв'язуючим доменом. Тарцева блокує каскад реакцій щодо передачі мітогенних сигналів від клітинної поверхні до ядра. Внаслідок цього пригнічується проліферація пухлини, її ріст, інвазія, метастазування, ангіогенез, підсилюється апоптоз [1]. На сьогодні Тарцева - єдиний інгібітор EGFR, для якого підтверджено значне поліпшення виживання хворих з недрібноклітинним раком легенів. O O O N N O H HN Ерлотиніб (Тарцева) 35 40 Поряд із здатністю гальмувати пухлинний ріст, Тарцева має ряд побічних ефектів, найбільш частими з яких є слабкість, погіршення апетиту, діарея, кашель, висипання, диспное [1, 2]. Значним недоліком препарату на шляху його широкого впровадження в онкологічну практику є його висока вартість. Нами було поставлено задачу пошуку інгібіторів активності епідермального фактору росту серед похідних хіназоліну. Поставлена задача вирішувалась тим, що було синтезовано сполуку 1 UA 111432 C2 5 2-(3-аліл-4-оксо-3,4-дигідрохшазолін-2-їл-сульфаніл)-N-(2,6-дихлорфеніл)-ацетамід (DAM003105), у якої виявлена здатність блокувати рецептор епідермального фактора росту. Сполуку 2-(3-аліл-4-оксо-3,4-дигідрохіназолін-2-їл-сульфаніл)-N-(2,6-дихлорфеніл)-ацетамід (DAM003105) одержують при конденсації 3-аліл-2-меркапто-3Н-хіназолін-4-ону [3] з 2-хлоро-N(2,6-дихлорфеніл)-ацетамідом [4] в лужному середовищі (схема 1). Синтез 2-(3-аліл-4-оксо-3,4-дигідрохіназолін-2-їл-сульфаніл)-МN-(2,6-дихлорфеніл)-ацетамід (DAM003105). O N Cl O O N Cl N N + S K2CO3 HN O Cl SH HN Cl Cl . 10 15 За препарат-аналог нами взятий Ерлотиніб (Тарцева). Здатність сполуки 2-(3-аліл-4-оксо3,4-дигідрохіназолін-2-їл-сульфаніл)-N-(2,6-дихлорфеніл)-ацетамід (DAM003105) та Ерлотинібу (Тарцеви) інгібувати активність рецептора епідермального фактора росту прогнозували за методом докінг-аналізу [5-7]. Для визначення зв'язування рецептора епідермального фактора росту (EGFR) з інгібіторами тирозинкіназ в їх АТФ-акцепторній кишені були використані кристалічні структури макромолекул (1М 17, 2ITY, 2GS2) із бази даних білків [8]. Результати надані в табл. 1. Таблиця 1 Результати молекулярного докінгу - енергії міжмолекулярного комплексу "EGFR-інгібітор" Сполука, препарат DAM003105 Ерлотиніб (Тарцева) Кристалічні макромолекули, енергія міжмолекулярного комплексу, АЕ DeltaG_2GS2* DeltaG_2ITY* DeltaG_lM17* -22.35 -18.03 -21.88 -27.28 -24.65 -39.68 Примітка: * ΔЕ (критерій значущості - ΔЕ>20 ккал/моль) 20 25 30 35 Результатом молекулярного докінгу були характеристики зв'язку амінокислотних залишків EGFR з фрагментом молекули інгібітора (сполуки 3105 та Ерлотинібу) за енергією міжмолекулярного комплексу "EGFR-інгібітор", обчисленою за програмою [9]. Енергія комплексу вважалась ефективною при її рівні АЕ >20 ккал/моль. Одержані дані свідчать, що на зазначеному рівні чи близькому до нього знаходяться обидві речовини (сполука DAM003105 та Ерлотиніб). Це передбачає здатність сполуки DAMOO31O5 інгібувати активність тирозинкіназ, яка не поступається такій у Ерлотинібу (Тарцеви). Приклади конкретного виконання. Приклад 1. Синтез 2-(3-аліл-4-оксо-3,4-дигідрохіназолін-2-їл-сульфаніл)-N-(2,6дихлорфеніл)-ацетамід (DAM003105). До розчину 0.005 моля 2-меркапто-3-аліл-3Н-хіназолін-4ону в 40 мл ацетонітрилу додавали при перемішуванні 0.015 моль прожареного поташу. Потім при перемішуванні додавали розчин 0.005 моля 2,6-діхлорфеніл-а-хлорацетаніліду в 30 мл ацетонітрилу. Реакційну суміш кип'ятили 3 години. Після охолодження до кімнатної температури суміш додавали до 200 мл води. Осад, що утворився, відфільтровували, сушили, 1 кристалізували з пропанову-2. Вихід: 69 %. Т.топл.=220-221 °C. Спектр ЯМР Н, δ, м.ч. (DMSOd6): 4.21 (с, 2Н, СН2), 4.82 (д, 2Н, СН2), 5.30 (м, 2Н, СН2=СН), 5.97 (м, 1Н, СН=СН2), 7.20-8.15 (м, 7Н, ароматичні протони), 9.65 (с, 1Н, NH). Знайдено, %: N 9.73; S 7,47. C 19CIN3O2S. Вирахувано, %: N 9,99; S 7,61. 2 UA 111432 C2 5 10 15 20 Приклад 2. Цитотоксична дія сполуки DAM003105 в порівнянні з Ерлотинібом (Тарцевою) вивчена на культурі пухлинних клітин з експресованою активністю рецепторів епідермального фактора росту Дослідження були проведені на клітинах недрібноклітинного раку легені людини А549, що культивувалися у поживному середовищі RPMI-1640 з додаванням 10 % ембріональної сироватки теляти у зволоженій атмосфері з 5 % СО2, 95 % повітря (стандартні умови). Клітини були висіяні у 96-лунковий планшет в концентрації 2000 клітин на лунку і культивувалися за стандартних умов протягом 5 діб (до досягнення рівня конфлюентності 90 %). Визначали цитотоксичну дію кожної з досліджуваних речовин у шести концентраціях. Для цього по 10 мг отриманих речовин розчиняли в ДМСО і вносили у відповідні лунки мікротитрувального планшету, що вже містили клітини і повне поживне середовище, до концентрації, при якій вміст розчинника не перевищував 0,5 %. Отримані розчини розтитровували двократними розведеннями і культивували протягом 24 годин. Оцінку цитотоксичної активності речовин проводили на клітинах недрібноклітинного раку легені людини А549 в колориметричному тесті з використанням жовтого барвника (3-(4,5диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразоліум броміду (МТТ), що в живих клітинах перетворюється на пурпурний формазан [10]. Після закінчення експозиції досліджуваних сполук з лунок видаляли культуральне середовище і вносили по 20 мкл розчину МТТ із 100 мкл свіжого поживного середовища та інкубували протягом 4 годин у темряві за стандартних умов. Після цього вміст лунок видаляли і розчиняли МТТ-формазанові кристали додаванням 50 мкл ДМСО у кожну лунку. Оптичну густину зафарбованих клітин вимірювали на спектрофотометрі для мікропланшет при довжині хвилі збудження 490 нм. Ступінь пригнічення росту клітин (N) вираховувався за формулою: N=(1 25 30 Оптична густина в дослідній групі Оптична густина в контрольній групі )*100% . Цитотоксичну та антипроліферативну активність визначали за допомогою показника концентрації напівмаксимального інгібування (ІС50 - концентрація досліджуваної речовини, при якій гине 50 % клітин), що вираховувався у програмі Origin 6.1 (OriginLab Co, США). 4 Сполука вважається цитотоксично активною при її ІС5010- М (тобто, lоg(IС50)-4)[11]. Порівняння одержаних показників показує, що активність сполуки DAM003105 подібна до такої препарату порівняння Ерлотинібу (Тарцеви), відповідно log(IC50)=-4,3 у сполуки 3105 та 4.4 у Ерлотиніба (Тарцеви). Таблиця 2 Результати цитотоксичної активності на клітинах лінії недрібноклітинного раку легені людини А549 з експресованою активністю рецепторів епідермального фактора росту Сполука, препарат DAM003105 Ерлотиніб (Тарцева) 35 40 45 Концентрація напівмаксимального інгібування моль/л log -5 5,4*10 -4,3 -5 3,8*10 -4,4 Приклад 3. Протипухлинна активність сполуки DAM003105 in vivo в порівнянні з Ерлотинібом (Тарцевою) на саркомі 180. Трансплантацію саркоми 180 (S 180) проводили у відповідності до вимог методичних рекомендацій та СОП відділу онкофармакології ДУ "ІФТ НАМНУ" [12, 13]. Тварини були розподілені на 2 дослідні групи (по 7 мишей у кожній) та контрольну групу (n=17). На наступну добу після трансплантації пухлин розпочинали введення досліджуваних сполук з розрахунку 100 мкг речовини на 1 мл сироватки крові тварини, що проводили кожні наступні 24 години (всього 6 введень). Параметром ефекту слугував відсоток гальмування росту пухлин за об'ємом (об'єм вимірювали після 3 та 6 введень) в дослідних групах у порівнянні з контролем. Результати дослідження наведені у табл. 3. 3 UA 111432 C2 Таблиця 3 Протипухлинна дія на саркомі 180 (М±m) Сполука, препарат DAM003105 Ерлотиніб (Тарцева) Гальмування пухлинного росту за об'ємом, % (М±m) Після 3 введень Після 6 введень 67,00 % * 26,33 % 57,95 % * 26,73 % Примітка: * - р