Застосування наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, для збільшення позаклітинного рівня глутамату і гамма-аміномасляної кислоти в препараті нервових терміналей головного мозку щурів

Реферат: Застосування наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, для збільшення позаклітинного рівня глутамату і гамма-аміномасляної кислоти в препараті нервових терміналей головного мозку щурів. UA 114254 U (12) UA 114254 U UA 114254 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі біотехнології, токсикології, медицини та космічної технології. Задачею корисної моделі є виявлення дії наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, на позаклітинний рівень глутамату і гамма-аміномасляної кислоти (ГАМК) у препараті нервових терміналей головного мозку щурів. Назва "наноалмази, отримані методом детонаційного синтезу" означає: порошки алмазні синтетичні ультрадисперсні, отримані методом детонаційного синтезу, що призначені для застосування в біологічному середовищі, а також для виготовлення суспензій, паст, адсорбентів, каталізаторів, полікристалічних матеріалів, композиційних матеріалів, покриттів і наповнювачів. Порошки наноалмазів були отримані видобуванням та очищенням алмазу із застосуванням технологій, розроблених в Інституті надтвердих матеріалів ім. В.М. Бакуля НАН України, з продукту синтезу (шихти), що утворився при вибуховому розкладенню сумішей вибухових речовин з від'ємним кисневим балансом. Порошки наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу в сухому вигляді являють 2 собою агломерати частинок вуглецю sp - гібридизації (неалмазний вуглець - переважно 3 графітизований поверхневий шар) та sp -гібридизації (алмаз) розміром до 10-20 мкм. Середній розмір частинок алмазу, що утворюють агломерати, становить 8-10 нм [1-5]. Фізико-хімічні показники порошків наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, застосованих в цих дослідженнях: - масова частка вуглецю - не менше 98 %; - масова частка домішок у вигляді неспалюваного залишку - 4,0-5,0 %; - елементний склад домішок - Fe, Mn, Ni та т.п. 2 - питома поверхня, SБЕТ - 200-300 м /г; -8 3 - питома магнітна сприйнятливість, χ, - 150-155  10 м /кг; 3 - щільність - 2,7-3,4 г/см . Вивчення дії наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу на позаклітинний рівень глутамату і гамма-аміномасляної кислоти (ГАМК) у препараті нервових терміналей головного мозку щурів проведено у відділі нейрохімії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України з використанням зразків наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу [1-5], які підготовлені, охарактеризовані та надані Інститутом надтвердих матеріалів ім. В.М. Бакуля НАН України. Вуглецеві матеріали привертають багато уваги завдяки виявленим у них новим властивостям, які можуть бути реалізовані в області нанотехнологій. Наноалмази є одними з найбільш перспективних нанорозмірих частинок через їх унікальні механічні, оптичні та термічні властивості, велику площу поверхні і здатність поверхневих структур до модифікації [6-11]. Завдяки своїм поверхневим властивостям, які дозволяють модифікувати і приєднувати різні біофункціональні сполуки з метою контрольованої цільової доставки лікарських засобів, зокрема, не розчинних у воді лікарських засобів, а також кращого проникнення комплексу препарату всередину клітин, наноалмази є перспективним матеріалом з широким діапазоном можливих застосувань в галузі доставки лікарських засобів, створення функціональних нанокомпозитів для візуалізації субклітинної організації біологічних об'єктів, тканинної інженерії [6,8,12]. Наноалмази були визнані перспективною системою доставки лікарського засобу для впливу на злоякісні гліоми головного мозку [13]. Унікальні фізичні і хімічні властивості наноалмазів відкривають можливості для їх використання в тераностиці. У процесі синтезу в ядрі наноалмазів утворюється велика кількість дефектів кристалічної решітки з флуоресцентними властивостями. Ці центри можуть збуджуватись практично будь-якою довжиною хвилі збудження, а флуоресценція, яка випромінюється, є стабільною [14-18]. Важливість флуоресцентних нанозондів в біомедичних дослідженнях і практиці швидко зростає разом із швидким розвитком флуоресцентної мікроскопії, лазерних технологій та нанотехнологій. Наноалмази вважаються нетоксичним матеріалом, що робить їх придатними для широкого кола біомедичних застосувань [6]. Експерименти із застосуванням наноалмазів проводились переважно на клітинних моделях або мікроорганізмах, і тому існує необхідність проводити дослідження на більш складних рівнях, зокрема з використанням тваринних моделей. Взаємодія наноалмазів з органами і тканинами тварин, циркуляція та кліренс наноалмазів в організмі тварин систематично не вивчені [8]. Незважаючи на продемонстрований потенціал наноалмазів, як носій для доставки ліків, основні механізми їх взаємодії з клітинами все ще не досліджені. Глутамат та γ-аміномасляна кислота (ГАМК) у центральній нервовій системі ссавців є основними збуджуючим та гальмівним медіаторами відповідно, які беруть участь у здійсненні 1 UA 114254 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 більшості функцій головного мозку, зокрема розпізнаванні, пам'яті, навчанні. Баланс між процесами збудження і гальмування є ключовим фактором нормального функціонування ЦНС. Глутамат та ГАМК реалізують свою сигнальну функцію, діючи на рецептори, розташовані на поверхні клітин, що експресують їх. Тому концентрація цих нейромедіаторів в позаклітинному середовищі визначає ступінь стимуляції рецепторів. Позаклітинний рівень нейромедіаторів встановлюється як баланс між їх транспортер-опосередкованим накопиченням і тонічним нестимульованим вивільненням. Вкрай важливо, щоб позаклітинні концентрації нейромедіаторів підтримувалися на низькому рівні. У нервовій системі надлишковий позаклітинний глутамат має токсичні властивості, оскільки надмірна активація глутаматних рецепторів та масивний вхід кальцію може призвести до загибелі нейронів. Низький позаклітинний рівень нейромедіаторів може підтримуватися лише за допомогою транспортування їх в клітину, тому що метаболізм цих сполук не відбувається в позаклітинному середовищі. Поглинання глутамату та ГАМК нервовими клітинами забезпечується роботою високоафінних натрій-залежних глутаматних та ГАМК транспортерів, які локалізовані у плазматичній мембрані нейронів і гліальних клітин. Порушення транспорту глутамату та ГАМК є характерною рисою патогенезу майже всіх нейрологічних захворювань [19-25]. Ізольовані нервові терміналі (синаптосоми), виділені з головного мозку щурів, зберігають усі властивості інтактного нервового закінчення щодо забезпечення процесу передачі нервового імпульсу, а саме здатність накопичувати та вивільнювати нейромедіатори, підтримувати мембранний потенціал та функціональний стан синаптичних везикул [26]. Беручи до уваги дані, що наведені вище, доцільним є аналіз впливу наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, на позаклітинний рівень глутамату та ГАМК у препараті ізольованих нервових термінал ей головного мозку (синаптосом), що матиме значення для використання наноалмазів у галузі біотехнології, нейротераностики та медицини для модуляції транспорту глутамату та ГАМК у нервових терміналях головного мозку. В основу корисної моделі поставлено задачу застосування наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, що підвищує позаклітинний рівень глутамату та ГАМК в препараті нервових терміналей головного мозку щурів. Показано, що наноалмази (0,05-1,00 мг/мл) викликають дозо-залежне збільшення 14 3 позаклітинного рівня радіоактивно мічених L-[ С]глутамату та [ Н]ГАМК в препараті нервових терміналей головного мозку (синаптосом). 14 Позаклітинний рівень L-[ С]глутамату становить за відсутності наноалмазів 0.174±0,014 нмоль/мг протеїну, у присутності наноалмазів за концентрації 0,05 мг/мл у середовищі інкубації упродовж 5 хв. - 0,190±0,026 нмоль/мг протеїну; у присутності наноалмазів за концентрації 0,10 мг/мл - 0,209±0,03нмоль/мг протеїну; у присутності наноалмазів за концентрації 0,50 мг/мл 0,286±0,019 нмоль/мг протеїну (Р0,05; t-тест Стьюдента, n=4), а у присутності наноалмазів за концентрації 1,00 мг/мл - 0,383±0,022 нмоль/мг протеїну (Р0,001; t-тест Стьюдента, n=4). 3 Позаклітинний рівень [ Н]ГАМК становить за відсутності наноалмазів - 110,9±5,11 нмоль/мг протеїну, у присутності наноалмазів за концентрації 0,05 мг/мл у середовищі інкубації упродовж 5 хв. - 115,05±3,04 нмоль/мг протеїну; у присутності наноалмазів за концентрації 0,10 мг/мл 128,64±7,73 нмоль/мг протеїну; у присутності наноалмазів за концентрації 0,50 мг/мл 138,96±9,73 нмоль/мг протеїну (Р0,05; t-тест Стьюдента, n=4); а у присутності наноалмазів за концентрації 1,00 мг/мл - 167,37±6,24 нмоль/мг протеїну (Р0,001; t-тест Стьюдента, n=4). Цей факт є важливим для використання наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, у галузі біотехнології, нейротераностики та медицини для модуляції транспорту глутамату та ГАМК у нервових терміналях головного мозку. Приклад 1. Виділення синаптосом з головного мозку щурів. Щурів-самців лінії Wistar масою 100-120 г декапітують, великі півкулі головного мозку швидко переносять в розчин, що містить 0,32 М сахарози, 5 мМ Hepes-NaOH (pH 7,4) та 0,2 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА). Усі операції проводять при 4 °C. Синаптосоми виділяють з гомогенату мозку диференційним центрифугуванням і центрифугуванням в градієнті щільності фіколлу, застосовуючи метод Котмана [27], у такій модифікації: розчин сахарози для приготування градієнту фіколлу містить 5 мМ Hepes-NaOH (pH 7,4) і 0,2 мМ ЕДТА. Синаптосомальну фракцію, отриману при центрифугуванні гомогенату головного мозку в градієнті щільності фіколлу, розводять 10 об'ємами 0,32 М сахарози, 5 мМ Hepes-NaOH (pH 7,4) і 0,2 мМ ЕДТА та центрифугують при 20000 g упродовж 20 хв. Отриманий осад повільно суспендують в 4 мл оксигенованого холодного середовища, що містить (в мМ): NaCl-126, КСl-5, MgCl2-1,4, NaH2PO4-1,0, HEPES-20, СаСl2-2, d-глюкозу - 10 (pH 7,4). При цьому кінцева концентрація протеїну становить 4 мг/мл. Синаптосоми використовують в експериментах 2 UA 114254 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 упродовж 2-4 годин після отримання. Концентрацію протеїну визначають за методом Ларсона [28]. 14 Приклад 2. Визначення позаклітинного рівня L-[ С]глутамату в препараті синаптосом. Суспензія синаптосом розводиться стандартним сольовим розчином до 1 мг протеїну/мл і 14 після 10 хв преінкубації при 37 °C навантажується L-[ С]глутаматом (500 нМ, 238 мСі/ммол) (Amersham, Великобританія) в кальцієвому стандартному сольовому розчині упродовж 10 хв. Після цього суспензія синаптосом відмивається 10 об'ємами льодяного стандартного сольового розчину, розводиться до концентрації 1 мг протеїну/мл і відразу використовується для 14 визначення вивільнення L-[ С]глутамату з синаптосом. 14 Аліквоти навантажених L-[ С]глутаматом синаптосом (120 мкл; 50 мкг/мл) преінкубуються 10 хв при 37 °C, потім додаються наноалмази (0,05-1,00 мг/мл), інкубуються впродовж 5 хв., після чого швидко осаджуються в мікроцентрифузі, 10000 g протягом 20 с Аліквоти надосаду (90 мкл) та солюбілізованого додецилсульфатом натрію осаду (90 мкл) змішуються з сцинтиляційною рідиною ACS (Amersham, Великобританія) (1,5 мл). Радіоактивність вимірюється за допомогою сцинтиляційного лічильника Тгасог Analytic Delta 300 (США). Загальний вміст радіоактивності визначається як сума радіоактивності у аліквоті надосаду та у аліквоті солюбілізованого осаду. 3 Приклад 3. Визначення позаклітинного рівня [ H]ГАМК в препараті синаптосом. Синаптосоми (2 мг протеїну/мл) в оксигенованому стандартному сольовому розчині, який -7 містить 10 мкМ амінооксіоцтової кислоти, інкубують 5 хв. при 37 °C в присутності 510 М (0,1 3 3 Кі/мл) [ Н]ГАМК (γ-[2,3- H(N)]-аміномасляна кислота; Perkin Elmer, США). Після охолодження на льоду, суспензію втричі розводять охолодженим сольовим розчином і центрифугують при 4000g 5 хв. Осад суспендують при 4 °C і концентрації протеїну 1 мг/мл в сольовому розчині, який містить 10мкМ амінооксиоцтової кислоти. Аліквоти суспензії синаптосом (120 мкл) преінкубують 10 хв. при 37 °C, потім додають наноалмази (0,05-1,00 мг/мл) та інкубують 5 хв., після чого центрифугують у мікроцентрифузі Eppendorf (10,000g, 20 s). Рівень радіоактивності, 3 вивільненої [ Н]ГАМК в аліквотах супернатанту (90 мкл), вимірюють в лічильнику Delta 300 ("Tracor Analytic", США), з використанням сцинтиляційної рідини ACS (Amersham, 3 Великобританія) (1 мл). Вміст [ Н]ГАМК у супернатантах виражають у відсотках від загального 3 вмісту [ Н]ГАМК в синаптосомах. Згідно з методологічним протоколом, дослідження позаклітинного рівня глутамату та ГАМК в препараті ізольованих нервових терміналей головного мозку щурів проводиться з 14 3 використанням радіоактивно мічених L-[ С]глутамата та [ Н]ГАМК, якими попередньо навантажують синаптосоми (приклади 1, 2, 3). Аплікація наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, до препарату пресинаптичних нервових закінчень (синаптосом) 14 3 призводить до дозо-залежного підвищення позаклітинного рівня L-[ С]глутамату та [ Н]ГАМК. Наноалмази за концентрації 0,05-1,00 мг/мл дозо-залежно підвищують позаклітинний рівень 14 L-[ C] глутамату при інкубуванні з ізольованими нервовими терміналями впродовж 5 хв. 14 Позаклітинний рівень L-[ C]глутамату становить за відсутності наноалмазів 0,174±0,014 нмоль/мг протеїну, у присутності наноалмазів за концентрації 0,05 мг/мл у середовищі інкубації упродовж 5 хв. - 0,190±0,026 нмоль/мг протеїну; у присутності наноалмазів за концентрації 0,10 мг/мл - 0,209±0,030 нмоль/мг протеїну; у присутності наноалмазів за концентрації 0,50 мг/мл 0,286±0,019 нмоль/мг протеїну (Р0,05; t-тест Стьюдента, n=4), а у присутності наноалмазів за концентрації 1,00 мг/мл - 0,383±0,022 нмоль/мг протеїну (Р0,001; t-тест Стьюдента, n=4) (фіг. 1). 3 Отримані експериментальні результати показують, що позаклітинний рівень [ Н]ГАМК становить за відсутності наноалмазів 110,90±5,11 нмоль/мг протеїну, у присутності наноалмазів за концентрації 0,05 мг/мл в середовищі інкубації упродовж 5 хв. - 115,05±3,04 нмоль/мг протеїну; у присутності наноалмазів за концентрації 0,10 мг/мл - 128,64±7,73 нмоль/мг протеїну; у присутності наноалмазів за концентрації 0,50 мг/мл - 138,96±9,73 нмоль/мг протеїну (Р0,05; tтест Стьюдента, n=4); а у присутності наноалмазів за концентрації 1,00 мг/мл - 167,37±6,24 нмоль/мг протеїну (Р0,001; t-тест Стьюдента, n=4) (фіг. 2). Таким чином, наведені результати експериментів підтверджують досягнення наступного технічного результату при здійсненні корисної моделі: 14 3 - наноалмази дозо-залежно збільшують позаклітинний рівень L-[ С]глутамату та [ Н]ГАМК в препараті ізольованих нервових закінчень головного мозку щурів (синаптосом); мінімальна концентрація наноалмазів, при якій відбувається статистично достовірне підвищення позаклітинного рівня нейромедіаторів становить 0,50 мг/мл; 14 - наноалмази за концентрації 0,50 мг/мл збільшують позаклітинний рівень L-[ С]глутамату в препараті синаптосом на 60 %, а за концентрації 1,00 мг/мл-на 120 %; 3 UA 114254 U 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - наноалмази за концентрації 0,50 мг/мл збільшують позаклітинний рівень[ Н]ГАМК в препараті синаптосом на 25 %, а за концентрації 1,0 мг/мл - на 50 %. Джерела інформації: 1. Novikov N. V., Bogatyreva G. P. and Voloshin M. N. Detonation Diamonds in Ukraine // Physics of the Solid State. - 2004. - V. 46. - No.4. - P. 600-605. Translated from Fizika Tverdogo Tela. - 2004. - V. 46. - №.4. - P. 585-590. 2. Богатырева Г.П., Волошин M.H., Шамраева B.C. Седиментационная устойчивость суспензий наноалмаза в водных средах. // Сверхтвердые материалы. - 2002. - № 4. - С. 55-60. 3. Наноалмазы: синтез, свойства, применение. Сб. Контенант. - М., 2010. - № 1. - С. 3-22. 4. ТУ У 26.8-05417377-177:2007. Порошки алмазні ультрадисперсні. 5. Методические рекомендации по изучению физико-химических свойств сверхтвердых материалов // под. ред. Богатыревой Г.П. - К.: ИСМ НАН Украины. - 1992.- 40 с. 6. Mochalin V.N., Shenderova О., Но D., Gogotsi Y. The properties and applications of nanodiamonds. // Nat. Nanotechnol. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved. - 2012. - V. 7. - P. 11-23. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nnano.2011.209 7. Man H.B., Ho D. Nanodiamonds as platforms for biology and medicine. // J. Lab. Autom. - 2013. - V. 18. - P. 12-18. 8. Perevedentseva E., Lin Y-C, Jani M., Cheng C-L… Biomedical applications of nanodiamonds in imaging and therapy. // Nanomedicine (Lond). - 2013. - V. 8. - P. 2041-2060. 9. Butler J.E., Sumant A.V. The CVD of Nanodiamond Materials. // Chem. Vap. Depos. 2008. V. 14. P. 145-160. Available from: http://doi.wiley.eom/l 0.1002/cvde.200700037 10. Dolmatov V.Y. Detonation synthesis ultradispersed diamonds: properties and applications. // Russ. Chem. Rev. - 2001. - V. 70. - P. 607-626. 11. Orel V.E., Shevchenko A.D., Bogatyreva G.P., Leshchenko O. V., Romanov A. V., Rykhal's'kii O.Y., et al. Magnetic characteristics and anticancer activity of a nanocomplex consisting of detonation nanodiamond and doxorubicin. // J. Superhard Mater. - 2012. - V. 34. - P. 179-185. Available from: http://www.springerlink.eom/index/l 0.3103/S1063457612030057 12. Chen M., Pierstorff E.D., Lam R., Li S-Y., Huang H., Osawa E., et al. Nanodiamond-mediated delivery of water-insoluble therapeutics. // ACS Nano. - 2009. - V. 3. - P. 2016-2022. 13. Хі G., Robinson E., Mania-Farnell В., Vanin E.F., Shim K-W., Такао Т., et al. Convectionenhanced delivery of nanodiamond drug delivery platforms for intracranial tumor treatment. // Nanomedicine. - 2014. - V. 10. - P. 381-391. 14. Davies G., Hamer M.F. Optical Studies of the 1.945 eV Vibronic Band in Diamond. // Proc. R. Soc. A Math. Phys. Eng. Sci. - 1976. - V. 348. - P. 285-298. 15. Davies G. Properties and growth of diamond. // EMIS Data Rev. - Ser. №. 9, INSPEC. (Ed.), London, UK. 1994. 16. Gruber A. Drabenstedt A., Tietz C, Fleury L., Wrachtrup J., von Borczyskowski С Scanning confocal optical microscopy and magnetic resonance on single defect centers. // Science. - 1997. - V. 276. - P. 2012-2014. 17. Walker J. Optical absorption and luminescence in diamond. // Reports Prog. Phys. IOP Publishing. - 1979. - V. 42. - P. 1605-1659. Available from: http://iopscience.iop.Org/article/l 0.1088/0034-4885/42/10/001 18. Yu S-J., Kang M-W., Chang H-C, Chen K-M., Yu Y-C. Bright fluorescent nanodiamonds: no photobleaching and low cytotoxicity. // J. Am. Chem. Soc. - 2005. - V. 127. - P. 17604-17605. 19. Richerson G. В., Wu Y. Role of GABA transporter in epilepsy.// Adv. Exp. Med. Biol. - 2004. V. 548. - P. 76-91. - doi: 10.1007/978-1-4757-6376-8_6. 20. Richerson G. В., Wu Y. The dynamic equilibrium of neurotransmitter transporters: not just for reuptake anymore. // J. Neurophysiol. - 2003. - V. 90. - P. 1363-1374. 21. Borden L. A. GABA transporter heterogeneity: pharmacology and cellular localization. // Neurochem. Int. - 1996. - V. 29. - P. 335-356. doi:10.1016/0197-0186(95)00158-l. 22. Schousboe A., Kanner B. GABA transporters: Functional and pharmacological properties. In: Glutamate and GABA Receptors and Transporters; Structure, Function and Pharmacology. London: Taylor and Francis. - 2002. - V. 43. - P. 337-349. 23. Zhou Y., Danbolt N. C. GABA and Glutamate Transporters in Brain. // Front Endocrinol. 2013. - V.4. - № 165. - P. l-14. doi:10.3389/fendo.2013.00165. 24. Borisova Т., Krisanova N. Presynaptic transporter-mediated release of glutamate evoked by the protonophore FCCP increases under altered gravity conditions. // Adv Space Res. - 2008. - V. 42. - P. 1971-1979. 4 UA 114254 U 5 10 25. Borisova Т., Krisanova N., Sivko R., Borysov A. Cholesterol depletion attenuates tonic release but increases the ambient level of glutamate in rat brain synaptosomes. // Neurochem Int. - 2010. - V. 56. - P. 466-478. 26. Sudhof T.C. The synaptic vesicle cycle // Annu. Rev. Neurosci. - 2004. - V. 27. - P. 509-547. 27. Cotman C. W. Isolation of synaptosomal and synaptic plasma membrane fractions // Meth. Enzymol. - 1974. - V. 31. - P. 445-452. 28. Larson E., Howlett В., Jagendorf A. Artificial reductant enhancement of the Lowry method for protein determination // Anal. Biochem. - 1986.- V. 155. - P. 243-248. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Застосування наноалмазів, що отримані методом детонаційного синтезу, для збільшення позаклітинного рівня глутамату і гамма-аміномасляної кислоти в препараті нервових терміналей головного мозку щурів. 5 UA 114254 U Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6