Застосування наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, для дисипації протонного градієнта синаптичних везикул у нервових терміналях головного мозку щурів

Реферат: Застосування наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, для дисипації протонного градієнта синаптичних везикул у нервових терміналях головного мозку щурів. UA 114256 U (12) UA 114256 U UA 114256 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі нанобіотехнології, токсикології, медицини та космічної технології. Задачею корисної моделі є виявлення дії наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, на протонний градієнт синаптичних везикул в нервових терміналях головного мозку щурів. Назва «наноалмази, отримані методом детонаційного синтезу» означає: порошки алмазні синтетичні ультрадисперсні, отримані методом детонаційного синтезу, що призначені для застосування в біологічному середовищі, а також для виготовлення суспензій, паст, адсорбентів, каталізаторів, полікристалічних матеріалів, композиційних матеріалів, покриттів і наповнювачів. Порошки наноалмазів були отримані видобуванням та очищенням алмазу із застосуванням технологій, розроблених в Інституті надтвердих матеріалів ім. В.М. Бакуля НАН України, з продукту синтезу (шихти), що утворився при вибуховому розкладенні сумішей вибухових речовин з від'ємним кисневим балансом. Порошки наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, в сухому вигляді являють 2 собою агломерати частинок вуглецю sp -гібридизації (неалмазний вуглець - переважно 2 графітизований поверхневий шар) та sp -гібридизації (алмаз) розміром до 10-20 мкм. Середній розмір частинок алмазу, що утворюють агломерати, становить 8-10 нм [1-5]. Фізико-хімічні показники порошків наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, застосованих в цих дослідженнях: - масова частка вуглецю - не менше 98 %; - масова частка домішок у вигляді неспалюваного залишку - 4.0-5.0 %; - елементний склад домішок - Fe, Mn, Ni та т.п. 2 - питома поверхня, SБЕТ - 200-300 м /г; -8 3 - питома магнітна сприйнятливість, , - 150-15510 м /кг; 3 - щільність - 2.7-3.4 г/см . Вивчення дії наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, на протонний градієнт синаптичних везикул нервових терміналей головного мозку щурів проведено у відділі нейрохімії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України з використанням зразків наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу [1-5], які підготовлені, охарактеризовані та надані Інститутом надтвердих матеріалів ім. В.М. Бакуля НАН України. Наноалмази є одними з найбільш перспективних наночастинок, які мають великий біотехнологічний потенціал і широкі перспективи для застосування у медицині через їх унікальні механічні, оптичні та термічні властивості, велику площу поверхні і здатність поверхневих 3 структур до модифікації [6-9]. Ядро наноалмазів складається з вуглецевих структур з sp 2 гібридизацією, а на поверхні знаходяться структури з sp гібридизацією та дефектні вуглецеві атоми [9]. Наноалмази виробляються переважно двома способами: з використанням високих температур/високого тиску або детонації [6-11]. Поверхневі властивості наноалмазів дозволяють приєднувати до них різні біофункціональні сполуки з метою контрольованої цільової доставки лікарських засобів, зокрема не розчинних у воді лікарських засобів, а також кращого проникнення препаратів всередину клітин. Завдяки цьому наноалмази є перспективним матеріалом з широким діапазоном можливих застосувань в галузі доставки лікарських засобів для впливу на злоякісні пухлини, створення функціональних нанокомпозитів для візуалізації субклітинної організації біологічних об'єктів, тканинної інженерії [8-14]. У процесі синтезу в ядрі наноалмазів утворюється велика кількість дефектів кристалічної решітки, які мають флуоресцентні властивості. Ці центри можуть збуджуватись практично будьякою довжиною хвилі збудження, а флуоресценція, яка випромінюється, є стабільною [14-18]. Отже, ці унікальні властивості наноалмазів відкривають можливості для їх використання в тераностиці. Біосумісність і нетоксичність є основними вимогами при створенні нанозондів для біологічного та медичного використання. Наноалмази вважаються нетоксичним матеріалом, що робить їх придатними для широкого кола біомедичних застосувань [6]. Незважаючи на продемонстрований потенціал наноалмазів як носіїв для доставки ліків, основні механізми їх взаємодії з клітинами все ще не досліджені. Експерименти із застосуванням наноалмазів проводились переважно на клітинних моделях або мікроорганізмах, і тому існує необхідність проводити дослідження на більш складних рівнях, зокрема з використанням тваринних моделей. Взаємодія наноалмазів з органами і тканинами тварин, циркуляція та кліренс наноалмазів в організмі тварин систематично не вивчені [8]. Наночастинки можуть негативно впливати на клітини, зокрема: механічно пошкоджувати плазматичну мембрану та внутрішньоклітинні органели; спричиняти утворення активних форм кисню; сприяти надмірному 1 UA 114256 U 2+ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 збільшенню концентрації цитозольного Са [19-22]. Оскільки розміри наноалмазів без покриття складають менш ніж 10 нм, можна припустити, що за рахунок невеликого розміру вони можуть потрапляти в нервові закінчення під час рециклізації синаптичних везикул, тобто екзо/ендоцитозу і, можливо, накопичуватися в синаптичних везикулах, впливаючи на їх закислення та функціональний стан. Якщо це так, то наноалмази можуть бути використані як потенційні флуоресцентні маркери для візуалізації рециклінгу синаптичних везикул. Синаптичні везикули є компартментами нервових закінчень з кислим рН, які накопичують нейромедіатор, що вивільнюється під час екзоцитозу при деполяризації плазматичної мембрани. Активний транспорт глутамату, ацетилхоліну, моноамінів, -аміномасляної кислоти/гліцину в синаптичні везикули здійснюється за рахунок роботи везикулярних + транспортерів нейромедіаторів, яка залежить від протонного електрохімічного градієнта Н , сформованого V-АТФазою, яка накачує протони всередину везикул [23, 24]. У цьому контексті закислення синаптичних везикул є вирішальним фактором, який забезпечує накопичення нейромедіаторів [25]. Оскільки протонний градієнт синаптичних везикул є важливим для акумуляції нейромедіатора, очевидно, що зменшення закислення везикул може призвести до екзоцитозу спустошених везикул у відповідь на деполяризацію плазматичної мембрани. Було показано, що недостатнє заповнення синаптичних везикул нейромедіатором призводить до зниження вивільнення шляхом екзоцитозу, що не супроводжується змінами в злитті синаптичних везикул і/або інших стадій екзоцитозу [25-27]. Оскільки вивільнений з нервових закінчень в синаптичну щілину нейромедіатор зв'язується з мембранними рецепторами на постсинаптичній мембрані та активує відповідні сигнальні шляхи, то зменшення сигналу може викликати значні порушення процесу синаптичної передачі. Ізольовані нервові терміналі (синаптосоми), виділені з головного мозку щурів, зберігають усі властивості інтактного нервового закінчення щодо забезпечення процесу передачі нервового імпульсу, а саме, здатність накопичувати та вивільнювати нейромедіатори, підтримувати мембранний потенціал та функціональний стан синаптичних везикул [28]. Беручи до уваги дані, що наведені вище, доцільним є аналіз впливу наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, на протонний градієнт синаптичних везикул в нервових терміналях головного мозку щурів (синаптосом), що матиме значення для використання наноалмазів у галузі біотехнології, нейротераностики та медицини для модуляції транспорту нейромедіаторів у нервових терміналях головного мозку. В основу корисної моделі поставлено задачу застосування наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, що викликає дисипацію протонного градієнта синаптичних везикул у нервових терміналях головного мозку щурів. Показано, що наноалмази (0,05-1,00 мг/мл) викликають дисипацію протонного градієнта синаптичних везикул в нервових терміналях головного мозку щурів. Синаптосоми попередньо навантажують рН-чутливим флуоресцентним зондом акридиновим оранжевим (АО), який акумулюється в кислих компартментах синаптосом, а саме синаптичних везикулах. Додавання наноалмазів (0,05-1,00 мг/мл) миттєво викликає вивільнення флуоресцентного зонду з синаптосом, що свідчить про дисипацію протонного градієнта синаптичних везикул. Мінімальна концентрація наноалмазів, при якій реєструється статистично достовірне збільшення флуоресценції акридинового оранжевого становить 0,10 мг/мл. Цей факт є важливим для використання наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, у галузі біотехнології, нейротераностики та медицини для модуляції транспорту глутамату та ГАМК у нервових терміналях головного мозку. Приклад 1. Виділення синаптосом з головного мозку щурів. Щурів-самців лінії Wistar масою 100-120 г декапітують, великі півкулі головного мозку швидко переносять в розчин, що містить 0,32 М сахарози, 5 мМ Hepes-NaOH (pH 7,4) та 0,2 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА). Усі операції проводять при 4 °С. Синаптосоми виділяють з гомогенату мозку диференційним центрифугуванням і центрифугуванням в градієнті щільності фіколлу, застосовуючи метод Котмана [29], у такій модифікації: розчин сахарози для приготування градієнту фіколлу містить 5 мМ Hepes-NaOH (pH 7,4) і 0,2 мМ ЕДТА. Синаптосомальну фракцію, отриману при центрифугуванні гомогенату головного мозку в градієнті щільності фіколлу, розводять 10 об'ємами 0,32 М сахарози, 5 мМ Hepes-NaOH (pH 7,4) і 0,2 мМ ЕДТА та центрифугують при 20000 g упродовж 20 хв. Отриманий осад повільно суспендують в 4 мл оксигенованого холодного середовища, що містить (в мМ): NaCl - 126, КСl 5, MgCl2 - 1,4, NaH2PO4 - 1,0, HEPES - 20, СаСl2 - 2, d-глюкозу - 10 (pH 7,4). При цьому кінцева концентрація протеїну становить 4 мг/мл. Синаптосоми використовують в експериментах упродовж 2-4 годин після отримання. Концентрацію протеїну визначають за методом Ларсона [30]. 2 UA 114256 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 2. Визначення рівня закислення синаптичних везикул Для дослідження закислення синаптичних везикул використовується рН-чутливий флуоресцентний барвник акридиновий оранжевий (Molecular Probes, США), який селективно накопичується у компартментах з кислими значенням рН (зокрема в синаптичних везикулах) [25]. Акридиновий оранжевий - це ліпофільний амін, непротонована форма якого здатна вільно проникати крізь мембрану. Після протонування в кислому просторі органел, що мають всередині позитивний мембранний потенціал, барвник втрачає здатність до проникності через мембрану. Інтенсивність флуоресценції акридинового оранжевого, акумульованого у везикулах, відображає рівень закислення в синаптичних везикулах, і таким чином здатність везикул до накопичення нейромедіатора. Зміни інтенсивності флуоресценції реєструють на спектрофлуориметрі Hitachi MPF-4 (Японія), на довжинах хвиль збудження та емісії 490 та 530 нм, відповідно (ширина щілин по 5 нм) в термостатованій кюветі (при 37 °С) при постійному перемішуванні. Реакція починається додаванням суспензії синаптосом (кінцева концентрація протеїну 0,2 мг/мл) до кювети з розчином акридинового оранжевого (кінцева концентрація 5 мкМ). Після досягнення стаціонарного рівня флуоресценції додають наноалмази (0,05-1,00 мг/мл) та фіксують новий стаціонарний рівень флуоресценції акридинового оранжевого. Флуоресценцію визначають згідно формули: F = Ft/F0, де F0 та Ft - інтенсивності флуоресценції акридинового оранжевого за відсутності та в присутності синаптосом відповідно. Значення F0 розраховують шляхом екстраполяції функції експоненційного затухання до t = 0. Згідно з методологічним протоколом, для дослідження закислення синаптичних везикул використовується рН-чутливий флуоресцентний барвник акридиновий оранжевий, яким попередньо навантажують синаптосоми (методи 1, 2). Аплікація наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, до препарату синаптосом призводить до дозо-залежного зниження протонного градієнта синаптичних везикул. Спектр емісії акридинового оранжевого не зазнає змін у відповідь на додавання наноалмазів за концентрацій 0,05-1,00 мг/мл (Фіг. 1). Наноалмази (0,05-1,0 мг/мл) викликають дозо-залежне гасіння флуоресценції акридинового оранжевого за умов відсутності синаптосом (Фіг. 2). Додавання синаптосомальної суспензії до розчину акридинового оранжевого супроводжується частковим гасінням флуоресценції внаслідок накопичення барвника кислими компартментами синаптосом, а саме синаптичними везикулами. Накопичення акридинового оранжевого не є швидким процесом, досягнення стаціонарного рівня флуоресцентного сигналу відбувається впродовж декількох хвилин (Фіг. 3). Після накопичення акридинового оранжевого синаптичними везикулами, у середовище інкубації вносять наноалмази (0,05-1,00 мг/мл), що призводить до збільшення флуоресценції акридинового оранжевого, яке вказує на зниження закислення синаптичних везикул (Фіг. 3). Мінімальна концентрація наноалмазів, при якій реєструється статистично достовірне збільшення флуоресценції акридинового оранжевого становить 0,10 мг/мл. У присутності наноалмазів за концентрації 0,10 мг/мл у середовищі інкубації флуоресцентний сигнал підвищується на 11 % (*, Р0,05; t-тест Стьюдента, n=4) у порівнянні з новим стаціонарним рівнем (враховуючи гасіння). Додавання 0,50 і 1,00 мг/мл наноалмазів призводить до суттєвого збільшення сигналу - на 23 % та 30 % (*, Р0,05; t-тест Стьюдента, n=4), що свідчить про миттєву дисипацію протонного градієнту синаптичних везикул, викликану наноалмазами (Фіг.4). Таким чином, наведені результати експериментів підтверджують досягнення наступного технічного результату при здійсненні корисної моделі: - наноалмази дозо-залежно викликають дисипацію протонного градієнта синаптичних везикул в нервових терміналях головного мозку щурів; - мінімальна концентрація наноалмазів, при якій відбувається статистично достовірне зниження протонного градієнта синаптичних везикул становить 0,10 мг/мл; - наноалмази за концентрації 0,10 мг/мл знижують протонний градієнт синаптичних везикул синаптосом на 11%; за концентрації 0,50 мг/мл - на 23 %, а 1,00 мг/мл - на 30 %. Джерела інформації 1. Novikov N. V., Bogatyreva G. P. and Voloshin M. N. Detonation Diamonds in Ukraine // Physics of the Solid State. - 2004. - V. 46. - №. 4. - P. 600-605. Translated from Fizika Tverdogo Tela. - 2004. - V. 46. - № 4. - P. 585-590. 2. Богатырева Г.П., Волошин M.H., Шамраева B.C. Седиментационная устойчивость суспензий наноалмаза в водных средах. // Сверхтвердые материалы. - 2002. - № 4. - С. 55-60. 3. Наноалмазы: синтез, свойства, применение. Сб. Контенант. - М., 2010. - № 1. - С. 3-22. 3 UA 114256 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 4. ТУ У 26.8-05417377-177:2007. Порошки алмазні ультрадисперсні. 5. Методические рекомендации по изучению физико-химических свойств сверхтвердых материалов // под. ред. Богатыревой Г.П. - К.: ИСМ НАН Украины. - 1992. - 40 с. 6. Mochalin V.N., Shenderova О., Но D., Gogotsi Y. The properties and applications of nanodiamonds. // Nat. Nanotechnol. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved. - 2012. - V. 7. - P. 11-23. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nnano.2011.209 7. Man H.B., Ho D. Nanodiamonds as platforms for biology and medicine. // J. Lab. Autom. - 2013. - V. 18. - P. 12-18. 8. Perevedentseva E., Lin Y-C, Jani M., Cheng C-L.. Biomedical applications of nanodiamonds in imaging and therapy. // Nanomedicine (Lond). - 2013. - V. 8. - P. 2041-2060. 9. Butler J.E., Sumant A.V. The CVD of Nanodiamond Materials. // Chem. Vap. Depos. - 2008. V. 14. - P. 145-160. 10. Dolmatov V.Y. Detonation synthesis ultradispersed diamonds: properties and applications. // Russ. Chem. Rev. - 2001. - V. 70. - P. 607-626. 11. Orel V.E., Shevchenko A.D., Bogatyreva G.P., Leshchenko O. V., Romanov A. V., Rykhal's'kii O.Y., et al. Magnetic characteristics and anticancer activity of a nanocomplex consisting of detonation nanodiamond and doxorubicin. // J. Superhard Mater. - 2012. - V. 34. - P. 179-185. 12. Chen M., Pierstorff E.D., Lam R., Li S-Y., Huang H., Osawa E., et al. Nanodiamond-mediated delivery of water-insoluble therapeutics. // ACS Nano. - 2009. - V. 3. - P. 2016-2022. 13. Xi G., Robinson E., Mania-Farnell В., Vanin E.F., Shim K-W., Такао Т., et al. Convectionenhanced delivery of nanodiamond drug delivery platforms for intracranial tumor treatment. // Nanomedicine. - 2014. - V. 10. - P. 381-391. 14. Davies G., Hamer M.F. Optical Studies of the 1.945 eV Vibronic Band in Diamond. // Proc. R. Soc. A Math. Phys. Eng. Sci. - 1976. - V. 348. - P. 285-298. 15. Davies G. Properties and growth of diamond. // EMIS Data Rev. - Ser. N. 9, INSPEC. (Ed.), London, UK., 1994. 16. Gruber A. Drabenstedt A., Tietz C., Fleury L., Wrachtrup J., von Borczyskowski C. Scanning confocal optical microscopy and magnetic resonance on single defect centers. // Science. - 1997. - V. 276. - P. 2012-2014. 17. Walker J. Optical absorption and luminescence in diamond. // Reports Prog. Phys. IOP Publishing. - 1979. - V. 42. - P. 1605-1659. 18. Yu S-J., Kang M-W., Chang H-C, Chen K-M., Yu Y-C. Bright fluorescent nanodiamonds: no photobleaching and low cytotoxicity. // J. Am. Chem. Soc. - 2005. - V. 127. - P. 17604-17605. 19. Yang Z., Liu Z.W., Allaker R.P., Reip P., Oxford J., Ahmad Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. // J. R. Soc., 2010. - 7 Suppl 4. - P. 411-22. 20. Borysov A., Krisanova N., Chunihin O., Ostapchenko L., Pozdnyakova N., Borisova T. A comparative study of neurotoxic potential of synthesized polysaccharide-coated and native ferritinbased magnetic nanoparticles. // Croat. Med. J. - 2014. - V. 55. - P. 195-205. 21. Fedorovich S.V., Alekseenko A.V., Waseem T.V. Are synapses targets of nanoparticles? // Biochem. Soc. Trans. - 2010. - V. 38. - P. 536-538. 22. Borisova Т., Nazarova A., Dekaliuk M, Krisanova N., Pozdnyakova N., Borysov A., et al. Neuromodulatory properties of fluorescent carbon dots: effect on exocytotic release, uptake and ambient level of glutamate and GAB A in brain nerve terminals. // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2015 - V. 59. - P. 203-215. 23. Moriyama Y., Maeda M., Futai M. The role of V-ATPase in neuronal and endocrine systems.//J Exp Biol. - 1992. - V. 172. - P. 171-178. 24. Nelson N. Structure and function of V-ATPases in endocytic and secretory organelles. // J Exp Biol. - 1992. - V. 172. - P. 149-153. 25. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. // J. Neurochem. - 1999. - V. 72. - P.625-633. 26. Drose S. and Altendorf K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and PATPases. // J. Exp. Biol. - 1997. - V. 200. - P. 1-8. 27. Floor E., Leventhal P.S., Schaeffer S.F. Partial purification and characterization of the vacuolar H(+)-ATPase of mammalian synaptic vesicles. // J. Neurochem. - 1990. - V. 55. - P. 16631670. 28. Sudhof T.C. The synaptic vesicle cycle // Annu. Rev. Neurosci. - 2004. - V. 27. - P. 509-547. 29. Cotman С W. Isolation of synaptosomal and synaptic plasma membrane fractions // Meth. Enzymol. - 1974. - V. 31. - P. 445-452. 4 UA 114256 U 30. Larson E., Howlett В., Jagendorf A. Artificial reductant enhancement of the Lowry method for protein determination // Anal. Biochem. - 1986.- V. 155. - P. 243-248. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Застосування наноалмазів, що отримані методом детонаційного синтезу, для дисипації протонного градієнта синаптичних везикул у нервових терміналях головного мозку щурів. 5 UA 114256 U Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6