Застосування наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, для деполяризації плазматичної мембрани нервових терміналей головного мозку щурів

Реферат: Застосування наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, для деполяризації плазматичної мембрани нервових терміналей головного мозку щурів. UA 114257 U (12) UA 114257 U UA 114257 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі біотехнології, токсикології, медицини та космічної технології. Задачею корисної моделі є виявлення дії наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, на мембранний потенціал ізольованих нервових терміналей головного мозку щурів. Назва "наноалмази, отримані методом детонаційного синтезу" означає: порошки алмазні синтетичні ультрадисперсні, отримані методом детонаційного синтезу, що призначені для застосування в біологічному середовищі, а також для виготовлення суспензій, паст, адсорбентів, каталізаторів, полікристалічних матеріалів, композиційних матеріалів, покриттів і наповнювачів. Порошки наноалмазів були отримані видобуванням та очищенням алмазу із застосуванням технологій, розроблених в Інституті надтвердих матеріалів ім. В.М. Бакуля НАН України, з продукту синтезу (шихти), що утворився при вибуховому розкладенню сумішей вибухових речовин з від'ємним кисневим балансом. Порошки наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу в сухому вигляді являють 2 собою агломерати частинок вуглецю sp - гібридизації (неалмазний вуглець - переважно 3 графітизований поверхневий шар) та sp -гібридизації (алмаз) розміром до 10-20 мкм. Середній розмір частинок алмазу, що утворюють агломерати, становить 8-10 нм [1-5]. Фізико-хімічні показники порошків наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, застосованих в цих дослідженнях: - масова частка вуглецю - не менше 98 %; - масова частка домішок у вигляді неспалюваного залишку - 4,0-5,0 %; - елементний склад домішок - Fe, Mn, Ni та т.п. 2 - питома поверхня, SБЕТ-200-300 м /г; -8 3 - питома магнітна сприйнятливість, , - 150-155 × 10 м /кг; 3 - щільність - 2,7-3,4 г/см . Вивчення дії наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, на мембранний потенціал нервових терміналей головного мозку щурів проведено у відділі нейрохімії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України з використанням зразків наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу [1-5], які підготовлені, охарактеризовані та надані Інститутом надтвердих матеріалів ім. В.М. Бакуля НАН України. Наноалмази є одними з найбільш перспективних наночастинок, які мають великий біотехнологічний потенціал і широкі перспективи для застосування у медицині через їх унікальні механічні, оптичні та термічні властивості, велику площу поверхні і здатність поверхневих 3 структур до модифікації [6-9]. Ядро наноалмазів складається з вуглецевих структур з sp 2 гібридизацією, а на поверхні знаходяться структури з sp гібридизацією та дефектні вуглецеві атоми [9]. Наноалмази виробляються переважно двома способами: з використанням високих температур/високого тиску або детонації [6-11]. Поверхневі властивості наноалмазів дозволяють приєднувати до них різні біофункціональні сполуки з метою контрольованої цільової доставки лікарських засобів, зокрема не розчинних у воді лікарських засобів, а також кращого проникнення препаратів всередину клітин. Завдяки цьому наноалмази є перспективним матеріалом з широким діапазоном можливих застосувань в галузі доставки лікарських засобів для впливу на злоякісні пухлини, створення функціональних нанокомпозитів для візуалізації субклітинної організації біологічних об'єктів, тканинної інженерії [8-14]. У процесі синтезу в ядрі наноалмазів утворюється велика кількість дефектів кристалічної решітки, які мають флуоресцентні властивості. Ці центри можуть збуджуватись практично будь-якою довжиною хвилі збудження, а флуоресценція, яка випромінюється, є стабільною [14-18]. Отже, ці унікальні властивості, наноалмазів відкривають можливості для їх використання в тераностиці. Біосумісність і нетоксичність є основними вимогами при створенні нанозондів для біологічного та медичного використання. Наноалмази вважаються нетоксичним матеріалом, що робить їх придатними для широкого кола біомедичних застосувань [6]. Незважаючи на продемонстрований потенціал наноалмазів як носіїв для доставки ліків, основні механізми їх взаємодії з клітинами все ще не досліджені. Експерименти із застосуванням наноалмазів проводились переважно на клітинних моделях або мікроорганізмах, і тому існує необхідність проводити дослідження на більш складних рівнях, зокрема з використанням тваринних моделей. Взаємодія наноалмазів з органами і тканинами тварин, циркуляція та кліренс наноалмазів в організмі тварин систематично не вивчені [8]. Наночастинки можуть негативно впливати на клітини, зокрема: механічно пошкоджувати плазматичну мембрану та внутрішньоклітинні органели; спричиняти утворення активних форм кисню; сприяти надмірному 2+ збільшенню концентрації цитозольного Са [19-22]. 1 UA 114257 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Основною мікроструктурою, що забезпечує передачу інформації від одного нейрона до іншого є синапс. Основним механізмом вивільненню нейромедіаторів з пресинаптичних 2+ нервових терміналей є стимульований деполяризацією плазматичної мембрани Са -залежний екзоцитоз - злиття синаптичних везикул з плазматичною мембраною. Процес вивільнення нейромедіаторів є строго контрольованим і відбувається у відповідь на потенціал дії у пресинапсі. Зміна мембранного потенціалу на плазмалемі пресинапсу призводить до зміни 2+ 2+ провідності потенціал-керованих Са каналів, це забезпечує вхід Са з позаклітинного середовища в нервову терміналь і, як наслідок, активацію процесу злиття синаптичних везикул з плазмалемою і вивільнення нейромедіаторів в синаптичну щілину [23]. Мембранний потенціал на плазматичній мембрані нервових закінчень є одним з ключових параметрів, який визначає синаптичну передачу. Процеси, які призводять до генерації нервового імпульсу полягають в короткочасних змінах мембранного потенціалу. Зниження мембранного потенціалу призводить до модуляції роботи потенціал-залежних іонних каналів, натрій-залежних транспортерів і т.д., що може викликати зміни вивільнення нейромедіаторів шляхом екзоцитозу. Оскільки вивільнений з нервових закінчень в синаптичну щілину нейромедіатор зв'язується з мембранними рецепторами на постсинаптичній мембрані та активує відповідні сигнальні шляхи, то зменшення сигналу може викликати значні порушення процесу синаптичної передачі [22-27]. З розвитком технічного прогресу, зокрема авіаційної та космічної галузі, створюються умови, за яких організм людини зазнає впливу космічного ультрадисперсного пилу. Було показано, що частинки місячного ґрунту сорбуються на скафандрах і потрапляють всередину космічних станцій. В результаті прямого контакту з частинками місячного пилу протягом декількох місій Apollo спостерігалось подразнення очей, дихальних шляхів та шкіри астронавтів [28-30]. Частинки пилу в міжзоряному просторі переважно утворені вуглецем. Встановлено, що метеорити, які падають на Землю, містять вуглець, до 10 % якого складають мікро- та наноалмази [31-33]. Таким чином, пілотовані позаземні місії, які включають вихід у відкритий космос, вимагають оцінки ризику токсичності пилу, який міститься у міжзоряному просторі. У галузі космічної біології вивченню цього питання приділяється значна увага, однак, ця проблема залишається нерозв'язаною. Ізольовані нервові терміналі (синаптосоми), виділені з головного мозку щурів, зберігають усі властивості інтактного нервового закінчення щодо забезпечення процесу передачі нервового імпульсу, а саме здатність накопичувати та вивільнювати нейромедіатори, підтримувати мембранний потенціал та функціональний стан синаптичних везикул [23]. Беручи до уваги дані, що наведені вище, доцільним є аналіз впливу наноалмазів. отриманих методом детонаційного синтезу, на мембранний потенціал ізольованих нервових терміналей головного мозку щурів (синаптосом), що матиме значення для використання наноалмазів у галузі біотехнології, медицини та космічної біології. В основу корисної моделі поставлено задачу застосування наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, що викликає деполяризацію плазматичної мембрани нервових терміналей головного мозку щурів. Додавання наноалмазів (0,05-1,00 мг/мл) до синаптосом, попередньо навантажених потенціал-чутливим флуоресцентним зондом родаміном 6G, призводить до вивільнення флуоресцентного зонду з синаптосом. Дія наноалмазів є дозо-залежною. Мінімальна концентрація наноалмазів, при якій було зареєстроване статистично достовірне збільшення флуоресценції родаміну 6G, становила 0,10 мг/мл. Цей факт є важливим для використання наноалмазів у галузі біотехнології, нейротераностики та медицини для модуляції вивільнення нейромедіаторів шляхом екзоцитозу з нервових терміналей головного мозку. Приклад 1. Виділення синаптосом з головного мозку щурів. Щурів-самців лінії Wistar масою 100-120 г декапітують, великі півкулі головного мозку швидко переносять в розчин, що містить 0,32 М сахарози, 5 мМ Hepes-NaOH (pH 7,4) та 0,2 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА). Усі операції проводять при 4 °C. Синаптосоми виділяють з гомогенату мозку диференційним центрифугуванням і центрифугуванням в градієнті щільності фіколлу, застосовуючи метод Котмана [34], у такій модифікації: розчин сахарози для приготування градієнту фіколлу містить 5 мМ Hepes-NaOH (pH 7,4) і 0,2 мМ ЕДТА. Синаптосомальну фракцію, отриману при центрифугуванні гомогенату головного мозку в градієнті щільності фіколлу, розводять 10 об'ємами 0,32 М сахарози, 5 мМ Hepes-NaOH (pH 7,4) і 0,2 мМ ЕДТА та центрифугують при 20000 g упродовж 20 хв. Отриманий осад повільно суспендують в 4 мл оксигенованого холодного середовища, що містить (в мМ): NaCl-126, КСl-5, 2 UA 114257 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 MgCl2-1,4, NaH2PO4-1,0, HEPES-20, СаСl2-2, d-глюкозу - 10 (pH 7,4). При цьому кінцева концентрація протеїну становить 4 мг/мл. Синаптосоми використовують в експериментах упродовж 2-4 годин після отримання. Концентрацію протеїну визначають за методом Ларсона [35]. Приклад 2. Вимірювання потенціалу плазматичної мембрани. Дослідження змін потенціалу плазматичної мембрани проводяться з використанням потенціал-чутливого флуоресцентного зонду родаміну 6G (Molecular Probes, США), який зв'язується з плазмалемою та мембраною мітохондрій відповідно до їх потенціалів [22]. Щоб виключити внесок мітохондрій у зміни загального рівня флуоресценції, дослідження проводяться в присутності блокатора дихального ланцюга - ротенону (5 мкМ), та інгібітора мітохондріальної АТФази - олігоміцину (5 мг/мл). Реакція починається додаванням суспензії синаптосом (кінцева концентрація протеїну 0,15 мг/мл) до кювети з розчином родаміну 6G (кінцева концентрація 0,5 мкМ). Після досягнення стаціонарного рівня флуоресценції додаються наноалмази (0,05-1,00 мг/мл) та фіксується новий стаціонарний рівень флуоресценції родаміну 6G. Для оцінки зміни потенціалу плазматичної мембрани застосовується індекс мембранного потенціалу (відношення F): F=Ft/F0 де F0 та Ft - інтенсивності флуоресценції родаміну 6G відповідно за відсутності та в присутності синаптосом. Виміри флуоресценції родаміну 6G проводяться на спектрофлуориметрі Hitachi MPF-4 (Японія), на довжинах хвиль збудження та емісії 528 та 551 нм, відповідно (ширина щілин по 5 нм), в термостатованій кюветі (при 37 °C) при постійному перемішуванні. Згідно з методологічним протоколом, для дослідження змін потенціалу плазматичної мембрани використовується потенціал-чутливий флуоресцентний зонд родамін 6G, яким попередньо навантажують синаптосоми (методи 1, 2). Аплікація наноалмазів, отриманих методом детонаційного синтезу, до препарату синаптосом призводить до деполяризації плазматичної мембрани. Спектр емісії родаміну 6G не зазнає змін у відповідь на додавання наноалмазів в діапазоні концентрацій 0,05-1,00 мг/мл (Фіг. 1). Наноалмази (0,05-1,00 мг/мл) викликають дозо-залежне гасіння флуоресценції родаміну 6G за умов відсутності синаптосом (Фіг. 2). Накопичення родаміну 6G синаптосомами відбувається упродовж 3 хв. до досягнення стаціонарного рівня флуоресценції (Фіг. 3). Наступне додавання наноалмазів (0,05-1,00 мг/мл) призводить до вивільнення накопиченого родаміну 6G, що свідчить про деполяризацію плазматичної мембрани синаптосом, обумовлену дією наноалмазів (Фіг. 3). В наших дослідженнях мінімальна концентрація наноалмазів, при якій реєструється статистично достовірне збільшення флуоресценції родаміну 6G становить 0,10 мг/мл. Ступінь деполяризації мембрани зростає при збільшенні концентрації наноалмазів в інкубаційному середовищі від 0,10 до 1,00 мг/мл, що вказує на дозо-залежність зазначеного ефекту. В присутності наноалмазів в концентрації 0,10 мг/мл в середовищі інкубації флуоресцентний сигнал підвищується на 10 % (*, Р0,05; t-тест Стьюдента, n=4) у порівнянні з новим стаціонарним рівнем (враховуючи гасіння). Додавання 0,50 та 1,00 мг/мл наноалмазів призводить до збільшення сигналу на 13 % та 30 % відповідно (*, Р0,05; t-тест Стьюдента, n=4) (Фіг. 4). Синаптосоми не втрачають здатність до відповіді на калієву деполяризацію (Фіг. 3). Оскільки родамін 6G зв'язується з плазматичною мембраною синаптосом та з внутрішньою мембраною мітохондрій відповідно до їх потенціалів, для визначення впливу наноалмазів саме на плазматичну мембрану, виключивши при цьому внесок мітохондрій у зміни загального рівня флуоресценції, використовується блокатор дихального ланцюга мітохондрій - ротенон (5 мкМ) та інгібітор мітохондріальної АТФ синтетази - олігоміцин (5 мг/мл). Порівняльний аналіз виявляє однаковий рівень підвищення інтенсивності флуоресцентного сигналу родаміну 6G в присутності 1,00 мг/мл наноалмазів як у нормі, так і за умов скасованого мітохондріальногопотенціалу (Фіг. 5). Це свідчить про обумовлену наноалмазами деполяризацію безпосередньо плазматичної мембрани синаптосом. Таким чином, наведені результати експериментів підтверджують досягнення наступного технічного результату при здійсненні корисної моделі: - наноалмази (0,05-1,00 мг/мл) викликають вивільнення попередньо накопиченого синаптосомами потенціал-чутливого флуоресцентного зонду родаміну 6G, що свідчить про деполяризацію плазматичної мембрани нервових терміналей. - ефект наноалмазів є дозо-залежним. Мінімальна концентрація наноалмазів, при якій реєструється статистично достовірна зміна мембранного потенціалу становить 0,10 мг/мл. 3 UA 114257 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - наноалмази за концентрації 0,10 мг/мл підвищують флуоресцентний сигнал родаміну 6G на 10 %; за концентрації 0,50 мг/мл - на 13 %, за концентрації 1,00 мг/мл - на 30 %. Джерела інформації: 1. Novikov N. V., Bogatyreva G. P. and Voloshin M. N. Detonation Diamonds in Ukraine // Physics of the Solid State. - 2004. - V. 46. - №.4. - P. 600-605. Translated from Fizika Tverdogo Tela. - 2004. V. 46. - №.4. - P. 585-590. 2. Богатырева Г.П., Волошин M.H., Шамраева B.C. Седиментационная устойчивость суспензий наноалмаза в водных средах. // Сверхтвердые материалы. - 2002. - № 4. - С. 55-60. 3. Наноалмазы: синтез, свойства, применение. Сб. Контенант. - М., 2010. - № 1. - С. 3-22. 4. ТУ У 26.8-05417377-177:2007. Порошки алмазні ультрадисперсні. 5. Методические рекомендации по изучению физико-химических свойств сверхтвердых материалов // под. ред. Богатыревой Г.П. - Киев. - ИСМ НАН Украины. - 1992. - 40 с. 6. Mochalin V.N., Shenderova О., Ho D., Gogotsi Y. The properties and applications of nanodiamonds. // Nat. Nanotechnol. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved. - 2012. - V. 7. - P. 11-23. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nnano.2011.209 7. Man H.B., Ho D. Nanodiamonds as platforms for biology and medicine. // J. Lab. Autom. - 2013. - V. 18. - P. 12-18. 8. Perevedentseva E., Lin Y-C, Jani M., Cheng C-L… Biomedical applications of nanodiamonds in imaging and therapy. // Nanomedicine (Lond). - 2013. - V. 8. - P. 2041-2060. 9. Butler J.E., Sumant A.V. The CVD of Nanodiamond Materials. // Chem. Vap. Depos. 2008. V. 14. P. 145-160. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/cvde.200700037 10. Dolmatov V.Y. Detonation synthesis ultradispersed diamonds: properties and applications. // Russ. Chem. Rev. - 2001. - V. 70. - P. 607-626. 11.Orel V.E., Shevchenko A.D., Bogatyreva G.P., Leshchenko O. V., Romanov A. V., Rykhal's'kii O.Y., et al. Magnetic characteristics and anticancer activity of a nanocomplex consisting of detonation nanodiamond and doxorubicin. // J. Superhard Mater. 2012. V. 34. P. 179-185. Available from: http://www.springerlink.com/index/10.3103/S1063457612030057 12. Chen M., Pierstorff E.D., Lam R., Li S-Y., Huang H., Osawa E., et al. Nanodiamond-mediated delivery of water-insoluble therapeutics. // ACS Nano. - 2009. - V. 3. - P. 2016-2022. 13. Xi G., Robinson E., Mania-Farnell В., Vanin E.F., Shim K-W., Такао Т., et al. Convectionenhanced delivery of nanodiamond drug delivery platforms for intracranial tumor treatment. // Nanomedicine. - 2014. - V. 10. - P. 381-391. 14. Davies G., Hamer M.F. Optical Studies of the 1.945 eV Vibronic Band in Diamond. // Proc. R. Soc. A Math. Phys. Eng. Sci. - 1976. - V. 348. - P. 285-298. 15. Davies G. Properties and growth of diamond. // EMIS Data Rev. - Ser. N. 9, INSPEC. (Ed.), London, UK. 1994. 16. Gruber A. Drabenstedt A., Tietz C, Fleury L., Wrachtrup J., von Borczyskowski C. Scanning confocal optical microscopy and magnetic resonance on single defect centers. // Science. - 1997. - V. 276. - P. 2012-2014. 17. Walker J. Optical absorption and luminescence in diamond. // Reports Prog. Phys. IOP Publishing. 1979. V. 42. P. 1605-1659. Available from: http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0034-4885/42/10/001. 18. Yu S-J., Kang M-W., Chang H-C, Chen K-M., Yu Y-C. Bright fluorescent nanodiamonds: no photobleaching and low cytotoxicity. // J. Am. Chem. Soc. - 2005. - V. 127. - P. 17604-17605. 19. Yang Z., Liu Z.W., Allaker R.P., Reip P., Oxford J., Ahmad Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. // J. R. Soc. 2010. - 7 Suppl 4. - S411-22. 20. Borysov A., Krisanova N., Chunihin O., Ostapchenko L., Pozdnyakova N., Borisova T. A comparative study of neurotoxic potential of synthesized polysaccharide-coated and native ferritinbased magnetic nanoparticles. // Croat. Med. J. - 2014.- V. 55. - P. 195-205. 21. Fedorovich S.V., Alekseenko A.V., Waseem T.V. Are synapses targets of nanoparticles? // Biochem. Soc. Trans. - 2010. - V. 38. - P. 536-538. 22. Borisova Т., Nazarova A., Dekaliuk M., Krisanova N., Pozdnyakova N., Borysov A., et al. Neuromodulatory properties of fluorescent carbon dots: effect on exocytotic release, uptake and ambient level of glutamate and GABA in brain nerve terminals. // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2015-V. 59. - P. 203-215. 23. Sudhof T.C. The synaptic vesicle cycle // Annu. Rev. Neurosci. - 2004. - 27. - P. 509-547. 24. Richerson G.B., Wu Y. Dynamic equilibrium of neurotransmitter transporters: not just for reuptake anymore. // J Neurophysiol. - 2003. - Vol. - 90. - P. 1363-74. 4 UA 114257 U 5 10 15 20 25. Borden LA. GAB A transporter heterogeneity: pharmacology and cellular localization // Neurochem Int. 1996. Vol. 29. P. 335-356. doi:10.1016/0197-0186(95)00158-1. 26. Danbolt N.C. Glutamate uptake. // Prog Neurobiol. - 2001. - V. 65. - P. 1-105. 27. Zhou Y., Danbolt N. С GABA and glutamate transporters in brain. Front Endocrinol. // 2013. V. 4. - № 165. - P. 1-14. doi:10.3389/fendo.2013.00165. 28. Rehders, M., Grosshauser, B.B., Smarandache, A., Sadhukhan, A., Mirastschijski, U., Kempf, J., Dunne, M., Slenzka, K., Brix K… Effects of lunar and mars dust simulants on HaCaT keratinocytes and CHO-K1 fibroblasts. // Adv. Space Res. - 2011. - V. 47. - P. 1200-1213. 29. Wallace, W.T., Tayler, L.A., Liu, Y., Cooper, B.L., McKay, D.S., Chen, В., Jeevarajan, A.S. Lunar dust and lunar simulant activation and monitoring. // Meteorit. Planet. Sci. - 2009. - V. 44. - P. 961-970. 30. Linnarsson D.,Carpenter J., Fubini В., Gerde P., Karlsson L.L., Loftus D.J., Prisk G.K., Staufer U., Tranfield E.M., van Westrenen, W. Toxicity of lunar dust. // Planetary and Space Science. - 2012. V. 74. - P. 57-71. doi:10.1016/j.pss.2012.05.023. 31. Garai J., Haggerty S.E., Rekhi S., Chance M. Infrared absorption investigations confirm the extraterrestrial origin of carbonado diamonds. // Astrophys J. - 2006. - V. 653. – P. 153-156. 32. Lewis R.S, Anders E., Draine B.T. Properties, detectability and origin of interstellar diamonds in meteorites. // Nature. - 1989. - V. 339. - P. 117-121. DOI:10.1038/339117a0. 33. Jones A.P., d'Hendecourt L.B., Sheu S-Y., Chang H-C, Cheng C-L., Hill H.G.M. Surface C-H stretching features on meteoritic nanodiamonds. // Astron Astrophys. - 2004. - V. 416. - P. 235-241. 34. Cotman C. W. Isolation of synaptosomal and synaptic plasma membrane fractions // Meth. Enzymol. - 1974. - V. 31. - P. 445-452. 35. Larson E., Howlett В., Jagendorf A. Artificial reductant enhancement of the Lowry method for protein determination // Anal. Biochem. - 1986. - V. 155. - P. 243-248. 25 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Застосування наноалмазів, що отримані методом детонаційного синтезу, для деполяризації плазматичної мембрани нервових терміналей головного мозку щурів. 5 UA 114257 U 6 UA 114257 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7