Застосування фторвмісного аналога g-аміномасляної кислоти із замісником b-cf2cf2h, для збільшення початкової швидкості накопичення та зниження стимульованого деполяризацією плазматичної мембрани вивільнення g-а

Реферат: Застосування фторвмісного аналога -аміномасляної кислоти із замісником -CF2CF2H, для збільшення початкової швидкості накопичення та зниження стимульованого деполяризацією плазматичної мембрани вивільнення -аміномасляної кислоти нервовими терміналями головного мозку щурів. UA 114258 U (12) UA 114258 U UA 114258 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до медицини, а саме до фармакології. Задачею корисної моделі є виявлення дії фторвмісного аналога γ-аміномасляної кислоти (ГАМК) із замісником β-CF2CF2H ((RS)-5) на початкову швидкість накопичення та стимульоване деполяризацією плазматичної мембрани вивільнення γ-аміномасляної кислоти нервовими терміналями головного мозку щурів (синаптосом). Вивчення дії фторвмісного аналога γ-аміномасляної кислоти із замісником β-CF2CF2H ((RS)5) на початкову швидкість накопичення та стимульоване деполяризацією плазматичної мембрани вивільнення γ-аміномасляної кислоти нервовими терміналями головного мозку щурів проведено у відділі нейрохімії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. Фторвмісний аналог γ-аміномасляної кислоти із замісником β-CF2CF2H ((RS)-5) синтезовано у відділі тонкого органічного синтезу Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України. Гальмівна ГАМКергічна система грає ключову роль у контролі нейрональної збудливості і підтримці балансу між процесами гальмування і збудження. Основним механізмом вивільнення γ-аміномасляної кислоти з пресинаптичних нервових терміналей є стимульований 2+ деполяризацією плазматичної мембрани Са - залежний екзоцитоз - злиття синаптичних везикул з плазматичною мембраною. ГАМК реалізує свою сигнальну функцію, діючи на іонотропні (ГАМК-А та ГАМК-С) та метаботропні (ГАМК-Б) рецептори, розташовані на поверхні клітин, що експресують їх. Тому концентрація ГАМК в позаклітинному середовищі визначає ступінь стимуляції рецепторів. Позаклітинний рівень ГАМК встановлюється як баланс між її транспортер-опосередкованим накопиченням і тонічним нестимульованим вивільненням. Позаклітинний рівень ГАМК може підтримуватися лише за допомогою транспортування її в клітину, тому що метаболізм цієї сполуки не відбувається в позаклітинному середовищі. Поглинання ГАМК нервовими клітинами забезпечується роботою високоафінних натрійзалежних транспортерів ГАМК, які локалізовані у плазматичній мембрані нейронів і гліальних клітин [1-3]. Сполуки, що впливають на процес гальмування, найчастіше входять до арсеналу протисудомних медичних препаратів, а дія ефективних антиконвульсантів найчастіше обумовлена їх впливом на функціонування транспортерів ГАМК, що має результатом підвищення рівня позаклітинної ГАМК. Серед інгібіторів ГАМК транспортерів тільки тіагабін селективний інгібітор транспортера GAT1 використовується в клінічній практиці при лікуванні судом, хоча інгібітори накопичення ГАМК є дуже перспективними агентами з їх потенційним застосуванням в лікуванні епілепсії, болю, наркоманії, порушення сну та ін. [3-9]. Одним з найбільш ефективних методичних підходів до розробки нових регуляторів внутрішньоклітинної/позаклітинної концентрації ГАМК та позаклітинного ГАМК гомеостазу в центральній нервовій системі є структурна модифікація ГАМК. Різні похідні ГАМК та її аналоги широко відомі як лікарські засоби, наприклад вігабатрин [10], баклофен (Lioresal® and Baclon*) [11], габапентин (GBP, Neurontin*) [12], прегабалін (Lyrica®, β-і-Bu-GABA) [13,14]. Фторвмісні аналоги природних речовин відіграють важливу роль у розробці нових біологічно активних сполук [15]. Пошук ефективних препаратів на основі молекули ГАМК показав, що більш ліпофільні аналоги здатні легко подолати гематоенцефалічний бар'єр [16]. Цей факт вказує на перспективу відповідних досліджень в галузі дизайну протисудомних препаратів [16,17]. Введення гідроксильної групи в С-3 положення в молекулі ГАМК сприяє підвищенню антиконвульсивної активності речовини. Хіральність молекули також має важливу роль. Введення об'ємних ліпофільних замісників в β-положення структурного ядра ГАМК також є один з важливих чинників, що призводить до отримання нових ефективних регуляторів. У рамках даної роботи була синтезована сполука - фторвмісний аналог γ-аміномасляної кислоти із замісником β-CF2CF2H ((RS)-5) [18,19], хімічна структура та 3D-модель якої наведено нижче: 1 UA 114258 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 . Проведено порівняльний аналіз впливу фторвмісного аналога ГАМК з існуючим комерційним медичним препаратом Прегабаліном (Lyrica®), [(S)-(+)-3-ізобутил-ГАМК]. Синтезована сполука є структурним, але не функціональним аналогом ГАМК. При первинній оцінці біологічної дії (RS)-5 в експериментах на мишах не було виявлено токсичного ефекту [18]. Прегабалін схвалений в США і Європі для додаткової терапії парціальних епілептичних нападів у дорослих, для лікування болю від діабетичної нейропатії або постгерпетичної невралгії у дорослих, фіброміалгії, а останнім часом і для лікування тривожних розладів [20, 21]. Механізми, що лежать в основі різних дій цього медичного препарату в мозку остаточно не з'ясовані, незважаючи на його широке клінічне застосування [22]. Фармакологічні властивості Прегабаліну в значній мірі обумовлені його високою афінністю до α2-δ-субодиниці потенціалзалежних кальцієвих каналів. Модуляція кальцієвого струму всередину нейрона під дією Прегабаліну призводить до зменшення вивільнення нейротрансмітерів з пресинаптичних нервових терміналей. Було висловлене також припущення, що Прегабалін модулює вивільнення або накопичення ГАМК нервовими закінченнями, зокрема перерозподіл транспортерів ГАМК GAT1 типу [22, 23]. Дослідження проводились на ізольованих нервових терміналях головного мозку синаптосомах, виділених з головного мозку щурів. Синаптосоми зберігають усі властивості інтактного нервового закінчення щодо забезпечення процесу передачі нервового імпульсу, а саме, здатність накопичувати та вивільнювати нейромедіатори, підтримувати мембранний потенціал та функціональний стан синаптичних везикул. Синаптосоми вважаються однією з найкращих систем для дослідження взаємозв'язку між структурою білків, їх біохімічними і клітинно-біологічними властивостями та фізіологічними функціями [24]. Беручи до уваги дані, що наведені вище, доцільним є аналіз впливу фторвмісного аналога ГАМК із замісником β-CF2CF2H ((RS)-5) на початкову швидкість накопичення та стимульоване 3 деполяризацією плазматичної мембрани вивільнення радіоактивно міченої [ Н]ГАМК нервовими терміналями головного мозку щурів (синаптосомами), що матиме значення для використання цієї сполуки у галузі фармакології для модуляції транспорту ГАМК у нервових терміналях головного мозку. В основу корисної моделі поставлено задачу застосування фторвмісного аналога ГАМК із замісником β-CF2CF2H ((RS)-5), що викликає збільшення початкової швидкості накопичення та зниження стимульованого деполяризацією плазматичної мембрани вивільнення радіоактивно 3 міченої [ Н]ГАМК нервовими терміналями головного мозку щурів. Фторвмісний аналог ГАМК із замісником β-CF2CF2H ((RS)-5) викликає збільшення початкової 3 швидкості накопичення ГАМК, яка реєструється як накопичення [ Н]ГАМК у синаптосомах за першу хвилину процесу. Вплив (RS)-5 (100мкМ) оцінюють після його попередньої інкубації з 3 синаптосомами протягом 20 хв. Початкова швидкість накопичення [ Н]ГАМК, яка в контролі складає 153,0±7,7 нмоль/хв. мг протеїну, у присутності (RS)-5 підвищується на 22 % і складає 187,7±10,9 нмоль/хв. мг протеїну (Р0,05; t-тест Стьюдента, n=6). Прегабалін (100мкМ), так само, як і (RS)-5, після попередньої інкубації з синаптосомами протягом 20 хв. підвищує 3 початкову швидкість накопичення [ Н]ГАМК, яка дорівнює 182,1±8,9 нмоль/хв. мг протеїну. Фторвмісний аналог ГАМК із замісником β-CF2CF2H ((RS)-5) викликає зниження стимульованого калієвою деполяризацією (15 мМ КС1) плазматичної мембрани вивільнення 3 [ Н]ГАМК шляхом екзоцитозу з синаптосом головного мозку щурів. У контролі вивільнення 3 [ Н]ГАМК з синаптосом складає 21,7±0,7 %, а за присутності (RS)-5 (100 мкМ) знижується на 34 % і складає 14,3±1,1 % від загальної кількості накопиченої синаптосомами мітки (Р0,05; t 2 UA 114258 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 тест Стьюдента, n=6). Прегабалін (100 мкМ) спричиняє незначне, але статистично достовірне 3 зниження вивільнення [ Н]ГАМК (на 15 %), яке складає 18,3±1,1 %, від загальної кількості накопиченої синаптосомами мітки (Р0,05; t-тест Стьюдента, n=6). (RS)-5 виявляється 3 ефективнішим у модуляції вивільнення [ Н]ГАМК за існуючий комерційний медичний препарат Прегабалін (Lyrica®). Цей факт є важливим для використання синтезованої сполуки у галузі фармакології для модуляції транспорту ГАМК у нервових терміналях головного мозку. Приклад 1. Синтез аналога ГАМК із замісником β-CF2CF2H ((RS)-5) Схема синтезу включає такі основні стадії (які є звичайними для органічної хімії): отримання суміші цис- та транс-ізомерів кротонату 2 з доступного гідрату тетрафторпропіоналю, приєднання нітрометану до подвійного зв'язку, з наступним каталітичним відновленням нітрогрупи, гідролізом та виділенням за допомогою іонообмінної смоли [18,19]. Схема синтеза аналога ГАМК із замісником β-CF2CF2H , де: і - Ph3P=CH2CO2Et, CH2Cl2; іі-СН3NO2, ДБУ; ііі - Н2, Pd(OH)2/C, CH3COOH; iv - НСl, Н2О; v-Amberlite IR-120. Приклад 2. Виділення синаптосом з головного мозку щурів. Щурів-самців лінії Wistar масою 100-120 г декапітують, великі півкулі головного мозку швидко переносять в розчин, що містить 0,32 М сахарози, 5 мМ Hepes-NaOH (pH 7,4) та 0,2 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА). Усі операції проводять при 4 °C. Синаптосоми виділяють з гомогенату мозку диференційним центрифугуванням і центрифугуванням в градієнті щільності фіколлу, застосовуючи метод Котмана [25], у такій модифікації: розчин сахарози для приготування градієнту фіколлу містить 5 мМ Hepes-NaOH (pH 7,4) і 0,2 мМ ЕДТА. Синаптосомальну фракцію, отриману при центрифугуванні гомогенату головного мозку в градієнті щільності фіколлу, розводять 10 об'ємами 0,32 М сахарози, 5 мМ Hepes-NaOH (pH 7,4) і 0,2 мМ ЕДТА та центрифугують при 20000 g упродовж 20 хв. Отриманий осад повільно суспендують в 4 мл оксигенованого холодного середовища, що містить (в мМ): NaCl-126, КСl-5, MgCl2-1,4, NaH2PO4-1,0, HEPES-20, СаСl2-2, d-глюкозу - 10 (pH 7,4). При цьому кінцева концентрація протеїну становить 4 мг/мл. Синаптосоми використовують в експериментах упродовж 2-4 годин після отримання. Концентрацію протеїну визначають за методом Ларсона [26]. 3 Приклад 3. Визначення накопичення [ Н]ГАМК синаптосомами. 3 3 В дослідах з накопичення [ Н]ГАМК (γ-[2,3- Н(N)]-аміномасляна кислота; Perkin Elmer, США) синаптосомами стандартний сольовий розчин містить 100 мкМ амінооксіоцтової кислоти, інгібітора ГАМК-трансамінази, для запобігання утворення метаболітів ГАМК. Концентрація протеїну синаптосом в пробі дорівнює 200 мкг/мл, об'єм проби дорівнює 0,6 мл. Синаптосоми преінкубують 20 хв. при 37 °C з (RS)-5 (100 мкМ) або Прегабаліном (100 мкМ), після чого ініціюють процес накопичення внесенням суміші ГАМК (1 мкМ ГАМК та 50 nМ - 0,2 мкКі/мл 3 [ Н]ГАМК). Через 1 хв. аліквоти (0,5мл) фільтрують через GF/C фільтри (Sigma, США). Фільтри двічі промивають охолодженим стандартним сольовим розчином, висушують та вимірюють рівень радіоактивності у сцинтиляційній рідині OCS (Amersham, Великобританія) (1 мл) в лічильнику Delta 300 ("Tracor Analytic", США). 3 Приклад 4. Вивільнення [ Н]ГАМК із синаптосом головного мозку щурів 3 UA 114258 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Синаптосоми (2 мг протеїну/мл) в оксигенованому стандартному сольовому розчині, який -7 містить 10 мкМ амінооксіоцтової кислоти, інкубують 5 хв. при 37 °C в присутності 510 М (0,1 3 Кі/мл) [ Н]ГАМК. Після охолодження на льоду, суспензію втричі розводять охолодженим сольовим розчином і центрифугують при 4000 g 5 хв. Осад суспендують при температурі 4 °C і концентрації протеїну 1 мг/мл в сольовому розчині, який містить 10 мкМ амінооксіоцтової кислоти. Синаптосоми (120 мкл суспензії) преінкубують 10 хв. при 37 °C, потім 20 хв. з (RS)-5 3 (100 мкМ) або Прегабаліном (100 мкМ). Вивільнення [ Н]ГАМК викликають деполяризацією синаптосом 15 мМ КСl. Зразки інкубують 5 хв., після чого центрифугують у мікроцентрифузі 3 Eppendorf (10,000 xg, , 20 s). Рівень радіоактивності вивільненої [ Н]ГАМК в аліквотах супернатанту (90 мкл) вимірюють в лічильнику Delta 300 ("Tracor Analytic", США), з використанням сцинтиляційної рідини ACS (1 мл на 1 аліквоту). Вміст міченої ГАМК у 3 супернатантах виражають у відсотках від загального вмісту [ Н]ГАМК в синаптосомах. 3 Вивільнення [ Н]ГАМК з синаптосом, преінкубованих без стимулюючого агента (15 мМ КС1) 3 приймається за базальне вивільнення. Стимульоване вивільнення [ Н]ГАМК обчислюється як 3 різниця між кількістю [ Н]ГАМК, що вивільнюється під впливом стимулюючого агента, і базальним вивільненням [8,9]. Згідно з методологічним протоколом, дослідження транспортер-залежного накопичення та стимульованого деполяризацією плазматичної мембрани вивільнення ГАМК ізольованими нервовими терміналями головного мозку щурів проводяться з використанням радіоактивно 3 міченої [ Н]ГАМК (методи 2,3,4). Фторвмісний аналог ГАМК із замісником β-CF2CF2H ((RS)-5) викликає збільшення початкової швидкості накопичення та зниження стимульованого деполяризацією плазматичної мембрани 3 вивільнення [ Н]ГАМК нервовими терміналями головного мозку щурів. 3 Початкова швидкість накопичення, що реєструється як накопичення [ Н]ГАМК за першу хвилину процесу, в контролі складає 153,0±7,7 нмоль/хв. мг протеїну, в присутності (RS)-5 підвищується на 22 % і складає 187,7±10,9 нмоль/хв. мг протеїну (Р