Спосіб виявлення радіотропізму мікроміцетів

Реферат: Спосіб виявлення радіотропізму мікроміцетів включає вирощування грибів на поживних середовищах за наявності впливу радіоактивного випромінювання. Мікроміцети вирощують на агаризованому поживному середовищі з борозенками для посіву конідій у пластикових чашках Петрі з нанесеною сіткою квадратів для візуалізації реакцій. В процесі вирощування та/або після його завершення одержують цифрове фотомікроскопічне зображення. Радіотропізм визначають при використанні вказаного фотомікроскопічного зображення за кутом повороту дистального кінця кожної грибної гіфи до точки потоку -квантів від джерела випромінювання. UA 68061 U (12) UA 68061 U UA 68061 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікробіології, а саме до способів, що забезпечують дослідження властивостей мікроорганізмів. Зокрема, спосіб стосується дослідження радіотропізму мікроскопічних грибів, тобто їх здатності позитивно реагувати на дію значних доз радіоактивного випромінювання. Спосіб може знайти своє застосування для виявлення грибів, які є здатними рости у космосі, а також в умовах високого радіаційного забруднення, що є актуальним для України після чорнобильської катастрофи 1986 року. Відомо, що під дією малих доз радіаційного випромінювання метаболізм ряду мікроскопічних грибів прискорюється. На сьогоднішній день це явище ще недостатньо вивчене. В 2004 році вперше була показана радіостимуляція у грибів при дії значних доз опромінення. Такий вплив радіаційного випромінювання на метаболізм грибів пов'язують із наявністю у складі грибів пігменту меланіну. Цей пігмент відіграє суттєву роль в енергетичному метаболізмі мікроміцетів. Вважають, що під дією радіації змінюються електронні властивості меланіну так, що він стає більш активним у біохімічних реакціях. Деякі гриби під дією радіації ростуть на поживному середовищі більш швидко у порівнянні з неопроміненими грибами та опроміненими грибами, позбавленими меланіну. Дослідження таких грибів є перспективним, оскільки створює передумови для успішного розвитку технологій, що можуть використовувати позитивний радіотропізм мікроскопічних грибів. Зокрема, вивчення радіотропізму є надзвичайно актуальним з огляду на здатність таких грибів "розрихляти" гарячі частинки та інші скупчення радіонуклідів, перетворюючи їх в іонообмінні форми, здатні включатися у трофічні ланцюги, що впливає на транслокацію радіонуклідів у ґрунті. Такий вплив на швидкість як вертикальної, так і горизонтальної міграції радіонуклідів має надзвичайно велике значення під час біоремедіації радіоактивно забруднених територій. Крім того, здатність до радіотропізму грибів можна використовувати для біологічної індикації радіаційного забруднення. Такі способи дослідження стануть у нагоді при вивченні взаємодії радіоактивних частинок з мікобіотою, на частку якої припадає в мікробній біомасі до 80 %, зокрема, з ґрунтовими мікроскопічними грибами, що є надзвичайно актуальним у зоні відчуження в результаті чорнобильської аварії. Розробка способів надійного визначення наявності радіотропізму дасть можливість виявити гриби, що можна вирощувати у космосі, де існує достатньо високий рівень іонізуючого опромінення, яке можна використовувати з одержанням користі. У зв'язку з цим актуальною є розробка надійного способу виявлення радіотропізму у грибів. За прототип даного способу є вибраним спосіб, описаний Ждановою Н.Н. із співавторами (Жданова Н.Н., Лашко Т.Н., Редчиц Т.Н. и др. Взаимодействие почвенных микромицетов с "горячими" частицами в модельной системе // Микробиол. журн. 1991. - Т.53. - Вып. 4. - С. 9-17), призначений для виявлення здатності до радіотропізму у мікроскопічних грибів. Згідно з цим способом конідії грибів поміщали у комірку з рідким середовищем Чапека та піддавали 8 опромінюванню при використанні штучного джерела випромінювання з активністю 10 Бк. Після цього оцінювали стимуляцію росту грибів. Проте описаний спосіб дозволяв лише якісно виявляти направлений ріст до джерела випромінювання, не дозволяв враховувати реакціївідповіді на певний діапазон доз опромінення, враховувати характер росту в динаміці. При використанні цього способу не завжди вдавалося отримати відтворювані результати. Задачею заявленої корисної моделі є забезпечення одержання відтворюваних результатів визначення радіотропізму, а також напівкількісної оцінки здатності мікроскопічних грибів позитивно реагувати на радіоактивне опромінення (радіотропізму). Поставлена задача вирішується шляхом розробки способу виявлення радіотропізму мікроміцетів, який включає вирощування мікроскопічних грибів на агаризованих поживних середовищах зі спеціально створеними борозенками для посіву конідій у пластикових чашках Петрі з нанесеною сіткою квадратів для візуалізації реакцій за наявності радіоактивного випромінювання, в процесі вирощування та/або після його завершення одержують цифрове фотомікроскопічне зображення, яке піддають аналізу, позитивну реакцію на опромінення та її кількісну характеристику визначають за кутом повороту дистального кінця кожної грибної гіфи до точки потоку -квантів від джерела випромінювання, при цьому кут повороту від 0 до 90° свідчить про ріст до джерела опромінення, тобто про позитивний радіотропізм, а кут повороту, що перевищує 90°, свідчить про ріст від джерела опромінення, тобто про негативний радіотропізм. При цьому кут повороту дистального кінця грибної гіфи від 0 до 50° характеризує значний ступінь позитивного радіотропізму, кут повороту від 51° до 75° свідчить про середній ступінь позитивного радіотропізму, кут повороту від 76° до 90° характеризує низький рівень позитивного радіотропізму. У способі використовували пластикові чашки Петрі, які практично не поглинають енергії квантів, застосування різних поживних середовищ дозволяло змінювати швидкість росту мікроміцетів. Слід зазначити, що використання твердого агаризованого поживного середовища 1 UA 68061 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 сприяє посіву конідій у визначені точки, дає змогу створити відтворювані умови експерименту щодо аерації. Кольорова сітка, нанесена на дно чашки Петрі, забезпечує кращу візуалізацію, а нанесення борозенок на поверхні агару допомагає чітко визначати реакції-відповіді грибів на дію певної величини потоку -квантів. Фотомікроскопічні зображення одержували при використанні цифрового фотоапарата Nicon Coolpix в динаміці проростання та росту грибної гіфи. Кут повороту визначали у 30-50 конідій. Кожний експеримент проводили у трикратній повторності. За контроль брали ріст гіф за відсутності опромінення. Визначення кута повороту здійснювали за допомогою комп'ютерної програми Scion Image. Статистичну обробку результатів здійснювали при використанні програми Statistica 6.0. На Фігурі 1 представлений пристрій з двома коліматорами для здійснення способу згідно із заявленою корисною моделлю. Пристрій складається із джерела випромінювання (7), свинцевого корпусу джерела випромінювання (1), алюмінієвої капсули (2), циліндричного коліматора (3), клиноподібного (градієнтного) коліматора (4). Досліджувані зразки розміщуються на агаризованому середовищі (5) у чашці Петрі (6). Джерело випромінювання знаходиться в алюмінієвій капсулі, яка закінчується циліндричним коліматором. При цьому джерело випромінювання можна переміщати по вертикальному каналу за допомогою різьбового сполучення з кроком 1 мм. Така конструкція забезпечує можливість вибору різної віддаленості джерела випромінювання від свинцевого коліматора з товщиною 5 мм з діаметром колімуючого отвору 1 мм, що дозволяє регулювати потік -квантів на виході коліматора. Клиноподібний коліматор призначений для створення градієнта потоку -квантів в об'ємі агаризованого середовища для впливу на ріст грибів. Як джерела випромінювання 109 8 32 8 І23 8 використовували Cd - 2×10 Бк; Р - 2×10 Бк, Те - 2×10 Бк. На Фігурі 2 проілюстроване визначення кута повороту гіф досліджуваних мікроміцетів. Для здійснення способу, згідно з винаходом, досліджувані ізоляти мікроміцетів поміщали у борозенки, зроблені в агаризованому середовищі у чашках Петрі. Під впливом випромінювання, що створюється джерелом випромінювання, конідії досліджуваних мікроміцетів починали проростати або у напрямку до джерела випромінювання -квантів, або від нього, при цьому тропізм визначали за кутом повороту дистального кінця кожної грибної гіфи до точки потоку квантів. Спосіб дозволяє оцінити не тільки наявність радіотропізму мікроміцетів, а також ступінь його прояву. Спосіб, згідно із заявленою корисною моделлю, пояснюється приведеними нижче прикладами його реалізації. Приклад 1. Для здійснення способу використовували різні ізоляти мікроміцетів родів Реnісіllium, Paecilomyces та Cladosporium. Використовувані для дослідження ізоляти були виділені з ґрунту радіоактивно забруднених районів (поблизу 4-ого блока ЧАЕС), інші були ізольовані з менш забруднених областей або до аварії на ЧАЕС, частину ізолятів було отримано з віддалених від зони радіоактивного забруднення місць усі ізоляти зберігаються у культурі в Інституті мікробіології та вірусології НАН України. Культури мікроміцетів підтримували на агаризованому середовищі Чапека до використання в експерименті. Конідії досліджуваних штамів 6 суспендували у стерильній дистильованій воді до отримання титру 10 конідій/мл та наносили у борозенки агаризованого середовища Чапека зі зниженим вмістом сахарози (100 мг/л) або за відсутності сахарози у пластикових чашках Петрі (d=60 мм). Чашки поміщали на вершину пристрою. Таким чином досліджували розмноження спор та подальший ріст гіф у відповідь на вплив джерела випромінювання. Час опромінення складав від 24 до 48 годин (в залежності від часу, який є необхідним для проростання конідій, що відрізняється для різних видів мікроміцетів, зокрема Cladosporium sphaerospermum, має більш низьку швидкість росту, ніж інші використовувані види, і вимагає 48 годин інкубації) при температурі 20 °C. Отримували цифрові зображення до та після опромінення у зоні впливу та при визначеній відстані від цієї зони. Зображення піддавали аналізу при використанні цифрового фотоапарата Nicon Coolpix. Кут повороту визначали у 30-50 конідій. Кожний експеримент проводили у трикратній повторності при використанні тих самих штамів мікроміцетів. За контроль брали ріст гіф за відсутності опромінення. Визначення кута повороту здійснювали за допомогою комп'ютерної програми Scion Image. Статистичну обробку результатів здійснювали при використанні програми Statistica 6.0. Дослідження радіотропізму здійснювали за кутом повороту дистального кінця кожної грибної гіфи до точки потоку -квантів від джерела випромінювання. При цьому кут повороту, менший за 90°, свідчить про ріст до джерела випромінювання та позитивний радіотропізм, а кут повороту 90-180° свідчить про ріст від джерела, що є показовим для негативного радіотропізму. Досліджувані ізоляти та одержані в результаті експерименту відповідні характеристиками 2 UA 68061 U радіотропізму на основі кутів повороту дистального кінця грибної гіфи до точки потоку -квантів від джерела випромінювання приведені у Таблиці 1. Таблиця 1 Досліджувані ізоляти Кут повороту до джерела іонізуючого випромінювання, 109 Cd Реnісіllium roseopurpureum147 60 Реnісіllium lanosum 10 70 Реnісіllium hirsutum 3 25 Реnісіllium westlingii 8 Реnісіllium roseopurpureum 100 Paecilomyces lilacinus 101 Paecilomyces lilacinus 1941 60 Cladosporium sphaerospermum 60 60 Cladosporium cladosporoides 396 10,1 Cladosporium cladosporoides 10 50 Cladosporium cladosporoides 4 5 75 40 Кут повороту до джерела Радіоактивність Радіотропізм іонізуючого місць ізоляції та його ступінь випромінювання, штамів 32 Р Позитивний 6 1,4×10 Бк/кг ґрунту радіотропізм 60 Ґрунт 10-км зони середній ЧАЕС, 1987 р. ступінь Позитивний радіотропізм 20 мР/год. 4-ий блок 70 середній ЧАЕС, 2002 р. ступінь Позитивний 6 1,5×10 Бк Гарячі радіотропізм 45 частинки ґрунту, високий 2002 р. ступінь Позитивний радіотропізм 20 мР/год. 4-ий блок 75 низький ЧАЕС, 2002 р. ступінь Фоновий рівень Негативний радіоактивності 100 радіотропізм Повітря бібліотеки, 1999 Позитивний Фоновий рівень радіотропізм радіоактивності 75 низький Крим, ґрунт, 2000 ступінь р. Позитивний 4 3,2×10 Бк/кг грунту радіотропізм 50 Ґрунт 10-км зони середній ЧАЕС, 1994 р. ступінь Позитивний 2 0-50 Бк/см грунту радіотропізм 60 4-ий блок ЧАЕС, середній 1997 р. ступінь Позитивний Фоновий рівень радіотропізм радіоактивності низький Чорнозем, 1957 р. ступінь Позитивний радіотропізм 20 мР/год. 4-ий блок середній ЧАЕС, 2002 р. ступінь Позитивний 7 4,05×10 Бк/кг радіотропізм 50 грунту Ґрунт 10-км високий зони ЧАЕС, 1986 р. ступінь На основі проведених експериментів встановлено, що ряд ізолятів, зокрема Penicillium roseopurpureum 100, виявляє негативний радіотропізм, Реnісіllium westlingii 8, Paecilomyces lilacinus 101, Cladosporium cladosporoides 396 виявляють низький ступінь позитивного радіотропізму, Реnісіllium roseopurpureum 147, Реnісіllium lanosum 10, Paecilomyces lilacinus 1941, Cladosporium sphaerospermum 60 виявляють середній ступінь позитивного радіотропізму, 3 UA 68061 U ізоляти Реnісіllium hirsutum 3 та Cladosporium cladosporoides 4 характеризуються високим ступенем позитивного радіотропізму. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 20 1. Спосіб виявлення радіотропізму мікроміцетів, який включає вирощування грибів на поживних середовищах за наявності впливу радіоактивного випромінювання, який відрізняється тим, що мікроміцети вирощують на агаризованому поживному середовищі з борозенками для посіву конідій у пластикових чашках Петрі з нанесеною сіткою квадратів для візуалізації реакцій, в процесі вирощування та/або після його завершення одержують цифрове фотомікроскопічне зображення, при цьому радіотропізм визначають при використанні вказаного фотомікроскопічного зображення за кутом повороту дистального кінця кожної грибної гіфи до точки потоку -квантів від джерела випромінювання. 2. Спосіб виявлення радіотропізму за пунктом 1, який відрізняється тим, що кут повороту дистального кінця кожної грибної гіфи до точки потоку -квантів від джерела випромінювання від 0 до 90° свідчить про позитивний радіотропізм, а кут повороту, що перевищує 90° свідчить про негативний радіотропізм мікроміцетів. 3. Спосіб виявлення радіотропізму за пунктом 1 або 2, який відрізняється тим, що кут повороту дистального кінця грибної гіфи від 0 до 50° характеризує значний ступінь позитивного радіотропізму, кут повороту від 51° до 75° свідчить про середній ступінь позитивного радіотропізму, кут повороту від 76° до 90° характеризує низький рівень позитивного радіотропізму. 4 UA 68061 U 5 UA 68061 U Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6