Спосіб одержання l-лізіну

ДЛЯ СЛУЖЕБНОГО ПОЛЬЗОВАНИЯ ЭКЗ N » СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК П9)Оу(Ц) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ 1 С 12 Р 13/08, С 12 N 1/20// //(С М N 1/20; ' 12 R 1ИЗ; С С 12 R 1:15) К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ( 2 0 4182424/28-13 '" " {22j 20.01.87 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекциипромышленных микроорганизмов, Трипольский биохимический завод и Научно-исследовательский институт кожевенно-обувной промышленности (72) З.М.Зайцева, В.М.Зохнюк, А.М.Лужков, Н.К.Краева, И.А.Аландаренко, Л.В.Коновалова, Н.А.Стащук, Л.И.Карпухина, Л.Н.Борисенко, Л.И.Носик, Ю.А.Колос и Я.К.Петрусевич (53) 663.15(088.8) (56) Патент ФРГ № 3316901, кл. G 12 Р 13/08, 1983. Авторское свидетельство СССР № 306736, кл. С 12 Р 13/08, 1969. *jf -•! • ' 38-88 ?ffi!# (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА (57) Иіобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения лизина, который может быть использован в сельском хозяйстве в качестве кормовой добавки в рационах домашних животных и птиц. Ц^лью изобретения является удешевление способа. Способ заключается в использовании в качестве источника ростовых факторов в составе ферментационной среды гидролнзатов коллаген- или кератинсодержащих отходов кожевенного, мясо- и прицеперерабатывающего производства или продуктов из этих отходов в количестве, обеспечивающем сумма?-', а ное содержание в питательной среде треонина и нзолейцина от 0,5 до 1,0 г/л. А табл. 1 Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения лизина, который может быть использован в сельском хозяйстве в ка-,, честве кормовой добавки в рационах домашних животных и птицы. Целью изобретения является удешевление способа. Способ заключается в следующем. JQ При получении L-лизина, включающем глубинное культивирование продуцентов при аэрации на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и гидролизаты^ белоксодержащего сырья в качестве источника ростовых факторов, используют гидролизаты коллаген- и кератинсодержащих отходов кожевенных, мясои птицеперерабатывающих производств 20 или получаемых из этих отходов полуфабрикатов и продуктов в количестве, обеспечивающем содержание в питательной среде треонина и изолейцина в общей сумме 0,5-1,0 г/л. 25 Отходы кожевенной промышленности содержат высокий процент белка (5590%). Некоторые из отходов используются для получения желатина, белко- - o j эина (колбасная оболочка), клея, кормовых добавок или для удобрения почвы. Однако около 50% отходов не используется и выводится в отвалы (мездра, краевые участки шкур» гольевая, спинковая и окантовочная обрези, хромеодержащие отходы), что приводит к загрязнению среды. Некоторые отходы применяются нерентабельно, например мездра для получения клея (выход клея 2-3%). Предлагается при- 40 менять в качестве компонентов питательной среды для получения лизина гидролизаты коллаген- и кератинсодер жащих кожевенных отходов, а также 45 гидролизаты полупродуктов, получаемых из мездры и краевых участков шкур, обрези (ТУ 17-06-98-84) или продуктов (кормовая мука, мука удобрительная) , получаемых из стружки или обрези нафтенового или хромового про- ^0 изводства (ТУ 17 РСФСР 12-11-84, ТУ УССР 14-13-85) или других неиспользуемых кожевенных отходов, после удаления из них токсичных веществ известными способами. Предлагается так- 55 же использовать коллаген- и кератинсодержащие отходы мясо- и птицеперерабатывающих комбинатов, например мя сокостную муку или кормовую добавку, приготовленную на основе пуха и пера. В кожевенных отходах содержатся нежелательные для кормовых продуктов и полуфабрикатов токсичные вещества, используемые для консервирования ис=" ходного сырья и переработки его на кожу (кремиефтористнй и сернистый натрий, парадихлорбензол, хром). Разработаны различные способы предварительной обработки кожевенных отходов, обеспечивающих полуфабрикатам и продуктам снижение содержания токсичных веществ до уровня ниже допустимого. Многие продукты и полуфабрикаты имеют технические условия (табл.1), некоторые из них могут применяться для кормления животных, другие в качестве удобрения. Химический состав кожевенных отходов и некоторых полуфабрикатов и продуктов, получаемых из них, представлен в табл. 1 и 2, Все субстраты содержат высокий процент белка (5590%), в состав которого входит значительное количество аминокислот, требующихся продуцентам лизина (треонин, метионин, иэолейцин). Стоимость отходов в 1,5-75 раз ниже стоимости БВК (табл. 1 ) . большинство кожевенных отходов легко гидролизуется неорганическими кислотами (НС1, H.S0 4 ) и в виде гидролизатов может применяться в качестве компонентов питательной среды при ферментации лизина, обеспечивая при оптимальном содержании их в среде почти такой же уровень накопления лизина, что и НБК. Оптимальная концентрация различных кожевенных отходов в питательной среде варьирует в пределах 1,0-5,0%, В зависимости от состава и условий выращивания кожевенные гидролизаты добавляют в питательную среду в качестве единственного источника ростовых факторов или в комбинации с кукурузным экстрактом. При этом кукурузный экстракт используют в незначительном количестве как дополнительный источник витаминов . Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. В качестве продуцентов используют ауксотрофные мутанты Brevibacterium sp. 531' или Corynebacterium glutaraicum 95-10 или Т-3 и другие штаммы. Для осуществления процесса получения лизина культуру микроорганизма 1431341 \ 4 Меласса 30,0 (МН 4 ) 2 S0 4 4,0 СаС0 3 3,0 Гидролизат муки кормовой 1,5 (по сухой массе муки), Содержание ростовых аминокислот (треонин + изолейцин) в питательной • среде 0,75 мг/л. Для приготовления гидролизата кормовую муку (табл. 1, образец 2) суспендируют в количестве 15% в растворе 10% НСІ, а затем гидролизуют при 95+1 °С в течение 10 ч, Гидролизат нейтрализуют водным аммиаком до рН 6,5-6,7 и добавляют в питательную среду. Ферментацию проводят в колJ бах на качалке (220 об/мин) при ?S t ±1 С, Через 72 ч выращивания в культуральной жидкости накапливается 45,6 г/л лизина. Конверсия сахара 33,4%. Накопление лизина при ферментации на средах с другими концентрациями гидролизата кормовой муки при тех же условиях выращивания представлено в табл. 4. Количество лизина на контрольной питательной среде с оптимальным содержанием гидролизата БВК (1%) составляет 40,3 г/л (табл. 3 ) . і П р и м е р 2 . В качестве продуцента лизина используют культуру При оценке эффективности новых Corynebacterium glutamicum T-3. Повидов сырья - источников ростовых факторов - в качестве контроля ис35 севной материал выращивают как в примере 1 и передают в ферментационную пользуют гидролизат ББК, применяемый среду в количестве 8% (по объему). в производстве лизина на отечественСостав ферментационной среды, %: ных заводах (табл. 3 ) . Лизин полуМеласса 26,0 чают в виде концентрата (сухого) с NH 4 HjF0 4 0,1 содержанием целевого продукта 10-12% 40 СаСО, 3,0 либо в виде кристаллов известными 3,0 NH 4 C1 способами. 4 П р и м е р 1. В качестве продуГидролизат муки удобрительной 2,5 цента лизина используют культуру (по сухой массе муки). Brevibacterium sp,531 (штамм депони- ^5 Содержание треонина + изолейцина рован во всесоюзной коллекции промышв среде 0,62 г/л. ленных микроорганизмов под номером Муку удобрительную (табл. 1, обКПМ В-1959). разец 4) суспендируют в количестве Односуточную культуру пересеива15% в 17%-ном растворе соляной кисют с агара Хоттингера на жидкую пита- -J лоты. Гидролиз проводят при 105 С тельную среду (%) : меласса 3,0; кукув течение 3 ч. Гидролизат нейтрализурузный экстракт 4; NaCl 0,5. Посевной ют аммиаком до рИ 6,6-6,8 и добавляют материал выращивают в колбах Зрленв питательную среду. мейера (объем 250 мл) с объемом среФерментацию осуществляют в колды 25 мл на качалке (220-240 об/мин) 5 с бах на качалке как в примере 1, Чепри 29+1 °С в течение 16 ч. Посевной рез 70 ч выращивания в культуральной материал передают в количестве 5% жидкости накапливается лизина , (по объему) в ферментационную среду 42,8 г/л. Накопление лизина в кульследующего состава, %: туральной жидкости при других концентвыращивают на агаризовлнной питательной среде Хоттингера в течение 1624 ч при 28-32 С. Затем суспензию клеток переносят в колбы с посевной средой, содержащей (%) мелассу 3-4; кукурузный экстракт 4-5; NaCl 0,4. Выращивание проводят при интенсивной аэрации в колбах на качалке в течение 18-24 ч. Посевной материал пере- JQ носят в ферментационную среду в количестве 4-10Z. Процесе биосинтеза осуществляют в колбах на качалке или в ферментерах (объем 0,5-20 л) при интенсивной аэрации и перемешивании 15 в течение 70-72 ч при 28-30°С и рН 6,7-7,5 на питательной среде, содержащей мелассу (%) 20-30; соли аммония 2,5-3,5 и фосфора 0,1, гидролизаты кожевенных отходов или получаемых 20 из них полуфабрикатов или продуктов в количестве, обеспечивающем содержание в питательной среде треонина и изолейцина в общей сумме 0,5-1,0 г/л. Через 70-72 ч выращивания в куль- 25 туральной жидкости накапливается 3950 г/л лизина (при конверсии сахара 32-35%). Химический состав кожевенных отходов (г на 100 г белка) приведен 30 в табл. 2. U31341 6 накапливается 41,5 г/л лизина. Накопрациях удобрительной муки представление лизина при других концентрациях лено в табл. 4. гидролизата мясокостной муки предП р и м е р З . В качестве продуставлено в табл, 4. цента лизина используют штамм BreviП р и м е р 6. Продуцент и условия bacterium sp.531. Приготовление посевприготовления посевного материала как ного материала и условия ферментации в примере 1. Посевной материал перекак в примере 1. В составе ферментационной среды вместо муки кормовой дают в количестве 5% в ферментационв качестве сырья используют 2,5% хро- 10 ную среду, %: мированные стружки (на сухую массу 28,0 Меласса стружки). Содержание треонина + изоNH 4 Cl 2,5 лейцина в среде 0,70 г/л (табл. 1, Кукурузный экстракт 1,0 образец 8 ) . Приготовление гидролизаСаСО, 2,0 та как в примере 1. Через 70 ч выраГидролизат гольевой щивания в культуральной жидкости мездры 2,0 (по накапливается 41,3 г/л лизина. Накопсухой ление лизина при других концентрациях массе) гидролизата хромированной стружки Содержание треонина + изолейцина представлено в табл, 4. в среде 0,7 г/л. 20 Условия ферментации как в примрИ р и м е р 4. Продуцент и условия ре 1. Через 70 ч выращивания в кульвыращивания посевного материала как туральной жидкости накапливается в примере 2. Ферментацию проводят 40,4 г/л лизина. на питательной среде следующего сосП р и м е р 7, Продуцент и условия тава, %: 25 приготовления посевного материала как Меласса 28,0 в примере 1. Посевной материал пере(NH 4 )iSO 4 2,0 дают в количестве 10% в ферментационК^НРО 4 0,1 ную среду следующего состава, %: СаСО: 2,0 Меласса 24,0 Гидролизат мездрового кормового 30 полуфабриката 4,0. NH 4 C1 1,0 Содержание треонина + изолейцина NH4H2P04 0,1 в среде 0,84 г/л. Гидролизат хромирован'Режим гидролиза мездрового полуной стружки 2,0 фабриката как в примере 1. Через 72 ч Кукурузный экстракт 1,0 выращивания в культуральной жидкости 35 Вода до 1 л накапливается 40,8 г/л лизина. НакопрН перед засевом 6,7-6,9 ление лизина при других концентрациях Содержание треонина + изолейцина гидролизата мездрового кормового пов среде 0,56 г/л /на техн. вес). луфабриката представлено в табл, 4. • Хромированную стружку (табл. 1, П р и м е р 5, Продуцент и условия образец 8) предварительно гидролизуют приготовления посевного материала как t7%-Hou HC1 при 9 5 Ц ° С в течение 10ч., в примере 1, Ферментацию проводят на Гидролизат нейтрализуют водным ампитательной среде, следующего состамиаком до рН 6,7-6,8. Мелассу стерива, %: лизуют отдельно от всех компонентов. 45 Меласса 28,0 Ферментацию проводят в лабораторном NH 4 C1 1,5 ферментере объемом 30 л при интенсив'(NH 4 ) 2 HPO 4 • 0,1 ной аэрации (1 объем воздуха на 1 объСаСО^ 2,0 ем среды в 1 мин) и постоянно рабо- г Гидролизат мясокостной муки 1,6 тающей мешалке (350 об/мин). В ходе 50 процесса рН поддерживают в пределах (по сухой массе), Содерлание треонина + изолейцина 7,0-7,5, используя в качестве рНв среде 0,75 г/л. стабилизатора и одновременно источГидролизат мясокостной муки ника минерального азота водный амми(табл, 1, образец 10) готовят с исак. Подачу аммиака осуществляют по пользованием 10% НС1 при 102 С в те- 55 сигналу датчика рН в автоматическом чение 8 ч. Нейтрализацию проводят режиме. Часть компонентов питательаммиаком до рН 6,7-6,8, Через 70 ч ной среды добавляют в "коде процесса выращивания в культуральной жидкости в виде трехфазовой подпитки (через 1431341 20, 24 и 28 ч ) , Состав подпитки (%): меласса АО; NH 4 Cl 4,0; гидролизах хромированной стружки 2,0; кукурузный экстракт 1,0. Объем 1 порции добавки с 1,4 л. Через 60 ч выращивания в культуральной жидкости накапливается 50,4 г/л лизина. Конверсия сахара в лизин 33,4%. 1Q После окончания процесса' 5 л культуральной жидкости подкисляют соляной кислотой до рН 2,0-3,5 и стабилизируют метабисульфитом (0,1%), затем упаривают вместе с биомассой под ва- J5 куумом (остаточное давление 0,10,2 ати) в роторном испарителе при 70 С в 4 раза. Полученный жидкий концентрат (ЖКП) содержит 190 г/л лизина. 500 мл ЖКЛ высушивают на распыли-20 тельной сушилке типа "Ангидро" при температуре теплоносителя на^входе 190210°С, на выходе 105 С. Полученный готовый препарат ККЛ имеет следующий состав (%): лизин 20,2; белок 28,2; 25 Cr^Oj 0,015; вода 8,3. Часть оставшейся культуральной жидкости в объеме 1 л используют для получения кристаллического лизина по ранее известному способу: культуральную жидкость для зо осаждения всех взвесей предварительно обрабатывают окисью кальция (4 г) при 60 С, Затем культуральную жид_кость подкисляют фосфорной кислотой до рН 4,8-5,6, выдерживают 30 мин при35 60 С и фильтруют. Полученный фильтрат (рН 5,6) пропускают через колонку со смолой КУ-2-8 в NH -форме для сорбции лизина. Элюцию с колонки проводят 5л-ным раствором аммиака. Элюат до упаривают до содержания сухих веществ 55, пропускают для осветления через активированный уголь и после добав 8 ления НС1 и этанола кристаллизуют при 3-5 С. Вілпавшие кристаллы отделяют на фильтре и высушивают. Получено 40,6 г кристаллического лизина, содержание основного вещества 95%, Таким образом, белоксодержащие кожевенные отходы и полуфабрикаты, продукты, получаемые из них, а также отходы мясо- и птицеперерабатывающих комбинатов могут с успехом заменять при производстве лизина БВК, Использование новых субстратов позволяет расширить сырьевую базу для производ*ства лизина и снизить себестоимость продукта. Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Способ получения L-лизина, предусматривающий выращивание микроорганизма - продуцента из рода Brevibacterium или Corynebacteriun в условиях аэрации в питателілюй среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и ростовые факторы, до максимального накопления целевого продукта с последующим его выделением, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью удешевления способа, в качестве источника ростовых факторов используют гидролизат коллагенили кератинсодержащих отходов кожевенного, мясо- или птицеперерабатывающего производства или продуктов Из этих отходов, полученный путем кислотного гидролиза при 92-122°С в течение 1,5-10 ч при гидромодуле 1,7-5,9 г/г, при этом гидролизат вводят в среду из расчета содержания в ней суммы треонина и изолейцина в количестве 0,5-1 . 0 г/л. , 1431341 Т а 0 л н ц а 1 Образец Сырье Хичкческий состав (Z не массу) Способ получрнкя влага j белок j азот | треонин + + изолейцнн Мук* кормовая ГУ РСФСР 17-12- Термогидролнз коженеяных отхоe 11-84