Спосіб зберігання бактерій виду escherichia coli

Реферат: Спосіб зберігання бактерій виду Escherichia coli включає приготування суспендуючого гліцеринового середовища, причому суспендуюче гліцеринове середовище розливають у стерильні епендорфи та стерилізують, готують препарат з розчину наноаквахелату селену (Se) -4 -5 у концентрації 10 та 10 , вносять препарат з розчину наноаквахелату селену (Se) в кількості 0,1 мл у приготовлене стерильне гліцеринове середовище, потім вносять мікробну завись у гліцеринове середовище в кількості 0,1 мл та зберігають культури при температурі -20 °C. UA 89523 U (12) UA 89523 U UA 89523 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медичної мікробіології і може використовуватися для тривалого зберігання штамів бактерій виду Escherichia coli. Відомі складні способи довготривалого збереження штамів мікроорганізмів із застосуванням методів кріоконсервації, ліофільного висушування та сорбційно-контактного зневоднення. Найбільш поширеним у практиці тривалого зберігання бактерій в колекціях науководослідних інститутів є метод ліофілізації, який полягає у видаленні води із заморожених суспензій бактерій шляхом сублімації при низькому тиску. Вирощену велику кількість біомаси 8 мікроорганізмів (не менше 10 КУО/мл) у період пізньої експоненціальної або ранньої стаціонарної фази змивають, суспендують у середовищі, що містить кріопротектори, розливають в ампули, які закривають ватними пробками, заморожують клітини при температурі -65 °C і висушують за допомогою приладу ліофільної сушки. Недоліком цього способу збереження штамів є необхідність відпрацювання показників режиму висушування, визначення інгредієнтів стабілізуючого середовища та постійного технологічного обслуговування упродовж всього процесу висушування. Крім цього під час ліофілізації в бактеріях виникають пошкодження, що викликає порушення репаративних процесів та призводить до загибелі частини бактерій [1, 2]. Метод сорбційно-контактного зневоднення включає приготування сорбційно-дисперсійного модуля, до складу якого входять: наповнювач-зневоднювач біомаси - гранульована іонообмінна смола марки КБ-4П-2, дезагрегант-диспергатор біомаси - гідрофобний аеросил марки AM-1-300 і посередник-зневоднювач - лактоза. Зазначені компоненти змішують у лабораторному шаровому барабані та додають суміш агарового змиву культури із захисним стабілізуючим середовищем. Отриману суху біомасу відділяють від шарів барабана, витримують 5 годин при температурі 4-6 °C і знову інтенсивно перемішують. Оптимально підібране співвідношення адсорбенту та адсорбтиву за рахунок повного перерозподілу вологи від біомаси на наповнювач забезпечує високу стійкість отриманого препарату, який зберігають при температурі (4±2) °С [3]. Застосування зазначеної технології забезпечує в незначній мірі вищий рівень збереження життєздатності бактерій в контактно зневоднених зразках порівняно з кількістю життєздатних мікробних клітин після ліофільного висушування. Недоліком вище вказаного способу є те, що для кожного таксономічного виду бактерій необхідно здійснювати індивідуальний підбір співвідношення адсорбенту з адсорбтивом. Відомий спосіб тривалого зберігання (до чотирьох років) плазмідних штамів Escherichia coli у м'ясо-пептонному бульйоні (МПБ) з додаванням кріопротекторів (10 % водні розчини диметилсульфоксиду (ДМСО), сахарози, гліцерину, поліетиленоксидів ПЕО-400) та заморожуванням до -196 °C шляхом занурення у рідкий азот. Спосіб включає приготування МПБ, в який вносили вище вказані кріопротектори. Вирощують культуру Е.соlі на скошеному м'ясо-пептонному агарі (МПА) протягом 18 годин при температурі 37 °C. Бактерії змивають з МПА середовищами консервації та вносять до кріопробірок об'ємом 1,8 мл. Зразки заморожують зануренням у рідкий азот. Відігрівання проводять на водяній бані при температурі 37 °C [4, 5,6]. Спосіб простий і перспективний, проте не для всіх регіональних мікробіологічних лабораторій доступний. Як контроль, крім дистильованої води, також доцільно використовувати культуру мікроорганізмів, внесену у вихідне консервуюче середовище (МПБ) без додавання кріопротекторів [6]. Відомий спосіб тривалого зберігання (до п'яти років) штамів бактерій у гліцериновому бульйоні шляхом заморожування при температурі -20 °C. Спосіб включає приготування 16 % гліцеринового бульйону, який розливають у стерильні кріопробірки. Вирощену добову культуру мікроорганізмів вносять у попередньо марковані пробірки з гліцериновим бульйоном, складають у кріобокси та без попереднього підрощування зберігають у морозильній камері при температурі -20 °C або -80 °C [10]. Спосіб простий, доступний, проте у процесі тривалого зберігання знижується рівень життєздатності бактерій, що призводить до зменшення кількості бактеріальної маси у процесі відновлення культури для науково-практичних потреб. В основу корисної моделі поставлено задачу створення способу зберігання бактерій виду Escherichia соlі, в якому шляхом здійснення нових дій, порядку здійснення дій та нових речовин забезпечується покращення перебігу обмінних та репаративних процесів штамів мікроорганізмів у процесі їх тривалого зберігання та забезпечується отримання значно більшої біомаси життєздатних мікроорганізмів у процесі періодичного відновлення життєздатності штамів без втрати і зміни їх біологічних властивостей. Для вирішення зазначеної задачі спосіб зберігання бактерій виду Escherichia coli включає приготування суспендуючого гліцеринового середовища. 1 UA 89523 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Новим в способі є те, що, що суспендуюче гліцеринове середовище розливають у стерильні епендорфи та стерилізують, готують препарат з розчину наноаквахелату селену (Se) у -4 -5 концентрації 10 та 10 , вносять препарат з розчину наноаквахелату селену (Se) в кількості 0,1 мл у приготовлене стерильне гліцеринове середовище, потім вносять мікробну завись у гліцеринове середовище в кількості 0,1 мл та зберігають культури при температурі -20 °C. Застосування нових дій, порядку здійснення дій та нових речовин забезпечує покращення перебігу обмінних та репаративних процесів штамів мікроорганізмів у процесі їх тривалого зберігання та дозволяє отримати значно більшу біомасу життєздатних мікроорганізмів у процесі періодичного відновлення життєздатності штамів без втрати і зміни їх біологічних властивостей, що має велике значення в практиці роботи мікробіологічних лабораторій медичних закладів та наукових установ. В способі застосовують наноаквахелат селену (Se) виробництва компанії "Наноматеріали і нанотехнології", м. Київ [7, 8, 9, 10]. Наноаквахелати металів являють собою розчин карбоксилованих наночастинок металів у деіонізованій воді із слабокислою реакцією (рН 7,0-6,5). Розчин, отриманий фізичним методом (ерозійно-вибуховим способом за методом Каплуненка-Косінова), за ефективністю і токсичністю значно відрізняється від розчинів металів, отриманих хімічним або електролізним способом, в яких іони металів діють токсично, і тому використовуються досить обмежено [7, 8, 9]. Метали в наноаквахелатній формі є значно активніші, ніж їх класичні молекулярні форми. Особливістю наноаквахелатів біогенних металів (міді (Сu), цинку (Zn), магнію (Mg), заліза (Fe), селену (Se)) є їх здатність виражено активувати фізіологічні і біохімічні процеси унаслідок прояву корпускулярних, хвильових, квантових та інших властивостей. Крім цього вони мають високу дифузійну рухливість, що також інтенсифікує перебіг процесів обміну речовин. Водні розчини карбоксилованих наночастинок біогенних металів вже промислово виробляються в Україні (ТУ У 24.1-35291116-004:2009). Таким чином, додавання розчинів наноаквахелатів металів у традиційне гліцеринове середовище [10, 11] покращує перебіг обмінних та репаративних процесів штамів мікроорганізмів у процесі їх тривалого зберігання та дозволяє отримати значно більшу біомасу життєздатних мікроорганізмів у процесі періодичного відновлення життєздатності штамів без втрати і зміни їх біологічних властивостей, що має велике значення в практиці роботи мікробіологічних лабораторій медичних закладів та наукових установ. Приклад здійснення способу: Готують 16 % гліцериновий бульйон наступним чином: 6,25 г поживного бульйону, 42 г (не мл) гліцерину, 208 мл дистильованої води акуратно перемішують, розливають по 1 мл у стерильні кріопробірки типу епендорф, стерилізують 10 хвилин при температурі 115 °C. З наноаквахелатного розчину селену (Se) у концентрації селену 200 мг/л та фізіологічного -1 розчину готують препарат в діапазоні концентрацій від 10 до 10'. До епендорфів з гліцериновим середовищем вносили препарат розчину наноаквахелату селену зазначених концентрацій у кількості 0,1 мл. Для порівняльної характеристики ефективності зберігання музейного штаму були виготовлені аналогічним способом інші зразки препаратів наноаквахелатів (виробництва тієї ж компанії "Наноматеріали і нанотехнології"), які містили наночастинки міді (Сu) в концентрації 1000 мг/л, цинку (Zn) - 2000 мг/л, заліза (Fe) - 1000 мг/л, магнію (Mg) - 3000 мг/л, марганцю (Mn) -1 -5 - 2000 мг/л, германію (Ge) - 1000 мг/л в концентрації від 10 до 10 , та були внесені до епендорфів з гліцериновим середовищем в кількості 0,1 мл. Музейний еталонний штам Escherichia coli ATCC 25922, вирощений на середовищі МюллерХінтон при температурі 37 °C протягом 18 годин, змивали фізіологічним розчином. За допомого приладу денситометру DENSIMAT (виробництва bioMerieux, Франція) встановлювали густину мікробної зависі 10 КУО/мл та вносили у попередньо марковані епендорфи з приготовленим гліцериновим середовищем з додаванням наноаквахелату селену у кількості 0,1 мл. Зберігали культури при температурі -20 °C протягом року. Дослідження біохімічних властивостей еталонної культури (дослідного та контрольного зразків) здійснювали з використанням автоматичного баканалізатора VITEK 2 - compact 15 (виробництва bioMerieux, Франція). Визначення ефективності способу. Через 3, 7 та 11 місяців після заморожування проводили висів культури еталонного штаму за допомогою стерильної пастерівської піпетки та шпателя на поживні середовища Ендо та Мюллер-Хінтон, які інкубували в термостаті при 37 °C протягом 24 годин. На другу добу проводили облік та оцінку росту життєздатних мікроорганізмів на поверхні поживного середовища. 2 UA 89523 U Як контроль проводили висів та облік росту зазначеного еталонного штаму із гліцеринового середовища без додавання розчину наноаквахелату. Результати досліджень наведені в таблицях 1 та 2. Таблиця 1 Вплив стабілізуючих середовищ на життєздатність еталонного штаму Е. соlі АТСС 25922 (n=3) Концентрація препаратур Життєздатність (М±m у КУО)* через 3, 7 та 11 місяців зберігання у гліцериновому середовищі з додаванням наноаквахелатів 140±6,8 320±10,3 ** 0 20±2,6 40±3,7 160±7,3 100±5,8 180±7,7 0 6±1,4 0 20±2,6 0 150±7,1 130±6,6 200±8,2 210±8,4 290±9,8 ** 170±7,5 280±9,7 ** 110±6,1 220±8,6 ** 110±6,1 260±9,3 ** 0 2±0,8 0 30±3,2 0 180±7,7 100±5,8 170±7,5 100±5,8 250±9,1 ** 120±6,3 270±9,5 ** 0 1±0,6 20±2,6 0 220±8,6 80±5,2 60±4,5 180±7,7 250±9,1 ** 0 -5 120±6,3 250±9,1 ** 220±8,6 10 130±6,6 230±8,8 280±9,7 ** 0 -4 160±7,3 120±6,3 220±8,6 ** 500±12,9 ** 170±7,5 230±8,8 ** 110±6,1 10 220±8,6 0 -3 Ge 160±7,3 10 Mn 0 -2 Mg 110±6,1 10 Fe 0 -1 Zn 240±8,9 10 Сu 0 210±8,4 150±7,1 330±10,5 250±9,1 ** ** 200±8,2 80±5,2 310±10,2 200±8,2 ** ** 0 1±0,6 150±7,1 140±6,8 250±9,1 300±10,0 ** ** 2±0,8 7±1,5 Контроль (через 3, 7 та 11 Se місяців) 160±7,3 200±8,2 140±6,8 150±7,1 0 30±3,2 50±4,1 190±8,0 350±10,8 ** 140±6,8 200±8,2 ** 80±5,2 ** 110±6.1 210±8,4 ** 150±7,1 ** 160±7,3 210±8,4 ** 180±7,7 ** 180±7,7 280±9,7 ** 160±73 ** 100±5,8 250±9,1 ** 3±1,0 Примітка: *КУО - колонієутворююча одиниця на середовищі Ендо; р