Біополімер із мікроводорості спіруліни і спосіб його отримання

MEOf A6IK З?'€6 __ _ _ і БИОПОЛИМЕР РІЗ МИКРОВОДОРОСЛИ СПИРУЛИНЫ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Изобретение относится к биотехнологии, в частности, биологически активным веществам из микроводорослей и технологии их получения. Известен противовирусный препарат из водорослей, представляющий собой водорастворимые высокомолекулярные полисахарида (і) » Способ получения препарата заключается в экстракции измельченных водорослей горячей водой (-£ = 90-95°С) в течение 3 час, в отделении экстракта центрифугированием и вторичном экстрагировании осадка с помощью гидроокиси натрия при температуре 90-95°С в течение 3 часов, нейтрализации экстракта до рН = 7,0 с помощью соляной кислоты. Оба экстракта соединяют, упаривают в вакууме, обессоливают ультрафильтрашей, сушат распылением. Выход полисахарида по отношению к водорослям составляет 21%. Недостатком известного препарата является узкий спектр его действия и то, что способ получения препарата предусматривает применение щелочи на второй стадии экстракции, что требует применения коррозионностойкого оборудования, а также ее нейтрализации. При этом образуется значительное количество хлористого натрия, которое необходимо удалять при обессоливании. Применение ультрафильтрации для обессоливания также усложняет технологический процесс. Значительный недостаток способа - высокая температура и большая длительность процессов. В основу изобретения поставлена задача расширить спектр биологической активности получаемого вещества с увеличением его выхода и сократить продолжительность технологического процесса. Поставленная задача достигается тем что заявленный биополимер , содержит биологически активную белковую часть и минеральные элементы в определенных процентах» а способ получения биополимера, включающий измельчение сырья, экстрагирование в два этапа, отделение экстракта, У* злгщжв&ние, сушку, осуществляют так, что экстрагирование на двух этапах проводят водой при более низких температурах и в течение меньшего 2. времени на втором этапе перед экстрагированием осадок от первого экстрагирования кратковременно обрабатывают проклитическим ферментом, а в объединенные экстракты добавляют этиловый спирт в определенной конпентрапии для выделения биополимера. Наличие биологически активной белковой части и проведение процесса экстрагирования в более мягких условиях (меньшая температура и сокращенная длительность) позволяют расширить спектр биологической активности биополимера:помимо антивирусной активности он обладает также и антистрессоной активностью. Кратковременная обработка осадка от первой экстракции протеолитическим ферментом позволяет извлечь дополнительное количество биополи мера экстракцией водой без применения щелочи. Ниже приводятся примеры, обосновывающие условия проведения первой и второй стадии экстракции и выделения биополимера из объединенных эк страктов о Критерием оценки в основном служил выход биополимера, а в ряде случаев и его биологическая активность, которую характеризовали антиоксидантной активностью и определяли хемилюминесиентным методом (2) . Примеры 1-5 проведения 1-ой стадии экстракции К 100 г воздушно-сухой измельченной спирулины добавляют 1000 мл дистиллированной воды, прогревают при перемешивании в течение I часа при температурах соответственно 50, 55, 60, 65, 70°С, экстракты отделяют центрифугированием, упаривают в 3 раза, добавляют к экстракту этиловый спирт до достижения его концентрации BOfo, отделяют выпавший биополимер центрифугированием и сушат. Выход биополимера по отношению к спирулине в % составляет соответственно 15,5; 16,8; 16,9; 16,8; 16,9; антиоксидантная активность биополимера в условных единицах составляет соответственно 25; 24,0; 23,8; 19,6; 15,0. Примеры 6-9 проведения 1-ой стадии экстракции Выделение биополимера осуществляют как и в примерах 1-5, темпера 3. тура экстракции составляет 60°С, а продолжительность экстрагирования составляет соответственно 40, 50, 60, 70 мин. Выход биополимера составляет соответственно 15,0; 16,8; 17,0; 17,1$, а антиоксидантная активность 24,5; 24,0; 24,0; 23,0. Данные примеров 1-9 проведения 1-ой стадии экстракции приведены в табл. I. Таблица I Обоснование условий проведения 1-ой стадии экстракпии Температура ш экстракции, С0 примера Длительность экстракции, мин Выход биополимера, /0 Антиоксидантная активность, усл.ед. I 50 60 15,5 25,0 г 3 4 5 55 60 65 70 60 60 60 60 16,8 17,0 16,8 16,9 24,0 23,8 19,6 15,0 б 7 8 9 60 60 60 60 40 50 60 70 15,0 16,8 17,0 17,1 24,5 24,0 24,0 23,0 Результаты таблипы I показывают, что экстракцию биополимера на 1-ой стадии необходимо проводить при температуре 55-60°С, при меньшей температуре экстракции уменьшается выход биополимера, увеличение температуры экстракпии приводит к уменьшению его антиоксицантной активности. Оптимальное время экстракиии - 50-60 мин, сокращение .длительности экстракпии приводит к уменьшению выхода биополимера, при более длительной экстракции падает его антиоксидантная активность. Примеры 10-16 проведения 2-ой стадии экстракции К осадку, полученному после 1-ой стадии экстракции, добавляют 2000 мл дистиллированной вода, содержащей протосубтилин Г-20Х в коли 4. чествах по отношению к весу осадка соответственно составляющих 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,1; 0,15%, массу прогревают при температуре 57°С в течение 10 мин, затем доводят смесь до кипения, охлаждают до 60°С и продолжают при этой температуре экстракцию в течение 50 мин, отделяют экстракт центрифугированием, упаривают в 3 раза, добавляют к экстракту этиловый спирт до достижения его концентрации 80%, отделяют выпавший биополимер иентрифугированием и сушат. Выход биополимера составляет соответственно 3,0; 3,2; 4,6; 6,5; 6,9; 7,0; 5,8%. Примеры 1723 проведения 2-ой стадии экстракиии Обработку осадка в присутствии 2000 мл воды осуществляют 0,1% протосубтилина Г-20Х при температуре 57°С в течение соответственно 5; 6,; 7; 8; 9; 10; 15 мин. Далее процесс ведут как в примерах 10-16. Выход биополимера составляет соответственно 3,5; 4,2; 4,9; 6,5; 6,7; 7,0; 6,0. Примеры 24-28 проведения 2-ой стадии экстракции Обработку осадка осуществляют 0,1% протосубтилина Г-20Х в присутствии 2000 мл дистиллированной воды при температуре 57°С в течение 10 мин. Далее процесс ведут как в примерах 10-16, экстрагируя биополимер в течение 50 мин при температурах соответственно 50; 55; 60; 65; 70°С. Выход биополимера составляет соответственно 5,8; 6,5; 6,7; 6,8; 6,9%. Примеры 29-34 проведения 2-ой стадии экстракиии Выделение биополимера осуществляют как в примерах 24-28, изменяя время экстракции биополимера соответственно 35; 40; 45; 50; 55; бОмин. Выход биополимера составляет соответственно 4,6; 5,2; 6,5; 6,7; 6,6; О, Г/о. Данные примеров 10-34 сведены в табл. 2. Анализ данных табл. 2 позволяет сделать следующие выводы: I) оптимальная концентрация протосубтилина Г-20Х при обработке осадка составляет 0,08-0,1%, меньшие и большие концентрации фермента приводят к уменьшению выхода биополимера; Таблица 2 Обоснование условий проведения 2-ой стадии экстракций Массовая * приме- доля Г-20Х, % ра I г 12 13 14 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 15 16 17 Длительность, мин обработки экстракции БП Г-20Х 4 5 6 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 50 50 50 50 50 60 60 60 60 60 3,0 3,2 4,6 6,5 6,9 0,1 0,15 0,1 1 0 1 0 5 50 50 50 60 60 60 7,0 5,8 3,5 18 19 20 21 22 23 24 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 ОД 6 7 8 9 1 0 1 5 1 0 50 50 50 50 50 50 50 60 60 60 60 60 60 50 4,2 4,9 6,5 6,7 7,0 6,0 5,8 25 26 27 28 29 01 , 01 , 01 , 01 , 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 50 50 50 50 35 55 60 65 70 60 6,5 6,7 6,8 6,8 4,6 30 31 32 33 34 01 , 01 , 01 , 01 , 01 , 1 0 1 0 1 0 1 0 40 45 50 55 60 60 60 60 60 60 5,2 6,5 6,7 6,6 6,7 ю и од 3 Температура Выход биополимера. экстракции биополимера, % 1 0 є. 2) .длительность обработки ферментом составляет 8-Ю мин, менее и более .длительная обработка ферментом приводит к уменьшению выхода био полимера; 3) оптимальная длительность экстракции биополимера составляет 4550 мин,при сокращении .длительности экстракции уменьшается выход биопо лимера, увеличение длительности экстракции нецелесообразно, т.к. не приводит к существенному увеличению выхода биополимера; 4) температура экстракции биополимера составляет 55-60°С, умень шение температуры экстракции приводит к уменьшению выхода биополимера, при увеличении температуры экстракции не наблюдается увеличение выхода биополимера. Примеры 35-39 получения биополимера спирулины К 100 г воздушно-сухой измельченной спирулины добавляют 1000 мл дистиллированной воды, прогревают при перемешивании в течение 60 мин при температуре 6О°С. Первый экстракт отделяют центрифугированием. К осадку после центрифугирования добавляют 2000 мл дистиллированной воды, содержащей 0,1% протосубтилина Г-20Х, прогревают при перемешивании при температуре 57°С в течение 10 мин, затем доводят смесь до кипения, охлаждают до 60°С и продолжают при этой температуре экстракцию в течение 50 мин, отделяют второй экстракт центрифугированием^ объединяют первый и второй экстракты, упаривают их в 3 раза и добавляют^спирт до его конечной концентрации соответственно 70; 75; 80; 85; 87%. Выпавший биополимер отделяют центрифугированием и сушат. Выход биополимера составляет соответственно 10,0; 15,0; 23,7; 24,3; 24,2%. Из данных примеров 35-39 можно сделать вывод, что оптимальная концентрация спирта, обеспечивающая наиболее полное осаждение биополимера и его максимальный выход, составляет 80-85%. При меньшей концентрации спирта идет неполное осаждение, при большей - выход биополимера не увеличивается. В оптимальных условиях выход биополимера составляет 24%, что на Ї. Ї Ъ% превышает выход препарата в способе-прототипе. Для биологически активных веществ такое увеличение выхода является существенным. В табл. 3 приведены данные по составу и антиоксидантной активности биополимера спирулины. Таблица 3 Состав и свойства биополимера спирулины Массовая доля, % АОА, усл.ед, оп Белок Углеводы I 2 3 4 5 6 7 49,8 45,0 51,5 23,6 25,2 25,0 25,0 24,5 25,0 29,5 15,7 30,0 60,0 24,1 14,5 24,5 60,0 19,0 19,3 24,0 54,8 29,9 14,0 30,0 0 95,0 5,0 10,0 Минеральные элементы Содержание белка в биополимере варьирует от 45 до 60%, минеральных элементов от 14 до 25%, углеводов от 19 до 29,9. При удалении белка из биополимера методом Севага (3) наблюдается резкое падение антиоксидантной активности. Это указывает на биологическую активность белковой части биополимера, что может быть объяснено ее полноценным аминокисло0 тным составом и значительным содержанием серусодержащих аминокислот, в том числе и таурина, обладающих антиоксидантної активностью (4 ). Данные по аминокислотному составу белковой части биополимера приведены в табл. 4. Антистрессорная и антивирусная активность биополимера спирулины была исследована на кафедре молекулярной и прикладной биофизики Харьковского госуниверситета. Таблига 4 Аминокислотный состав белковой части биополимера Аминокислота Лизин Гистидин Аргинин Таурин Аспарагиновая кислота Треонин Серии Глутаминовая кислота Глицин Алании Цистин Балин Метионин Изолейцин Лейцин Тирозин Фенилаланин Массовая доля, % к белку 2, 9 0,7 10,2 0,4 16,2 5,6 5,2 14,3 8,7 5,6 0,4 4,5 0,3 4,4 9,5 3,4 5,8 Особенно заметное влияние биополимер оказывает на репродуктивную функцию организма, подвергшегося стрессовому воздействию, а также он характеризуется антивирусной активностью в отношении вируса герпеса, Результаты исследований изложены в прилагаемом заключении. Таким образом, существенными отличительными признаками заявляемого биополимера являются: - наличие биологически активной белковой части; - антистрессорная активность биополимера. '9. Существенными отличительными признаками заявляемого способа являются: - экстрагирование на двух этапах проводят водой с температурой 55-60° в течение 45-60 мин; - перед экстрагированием на втором этапе осадок от первого экст рагирования обрабатывают в течение определенного времени протеолитическим ферментом, взятым в определенном количестве; - обработка объединенных экстрактов этиловым спиртом в определен ной концентрации. Преимущество заявляемого биополимера заключается в возможности использования его не только в борьбе с вирусными инфекциями, но и .для ликвидации последствий стрессовых воздействий на живой организм. Преимущества заявляемого способа: - исключение щелочи из технологического процесса; - сокращение продолжительности процесса; - увеличение выхода биополимера. Источники информации: I. Патент США № 5089481. "Противовирусные препараты, содержащие полисахариды в качестве активных ингредиентов", 1992 г., МКИ A6IK. Z, Шевченко ИОН., Калинченко И.С0 "Изучить антиоксидантные свойства черноморской продукции животного происхождения", отчет НИР, Киев, 1992 г,, с. 27. 3. Дудкин Н.С. и др. Гемицеллюлозы, Рига "Зинатне", 1991 г. 4. Савицкий И.В., Биологическая химия, Киев, 1982, с. 470.