Спосіб ідентифікації речовин, що мають потенційну гербіцидну або регулюючу ріст дію

1. Способ идентификации веществ, обладающих потенциальным гербицидным или рострегулирующим действием, проявляющимся в ингибировании или инактивации растительного процесса переноса, отличающийся тем, что а) сначала протеин-переносчик получают гетерологической экспрессией последовательности ДНК, кодирующей этот протеин-переносчик, в трансгенном организме или трансгенных клетках, затем б) этот рекомбинантный организм как единое целое или трансгенные клетки используют для исследования химического соединения на его ингибирующее действие в отношении указанного протеина-переносчика и в) соединение дополнительно исследуют на активность по отношению к организму или клетке, C2 (54) СПОСІБ ІДЕНТИФІКАЦІЇ РЕЧОВИН, ЩО МАЮТЬ ПОТЕНЦІЙНУ ГЕРБІЦИДНУ АБО РЕГУЛЮЮЧУ РІСТ ДІЮ 41386 Таким образом, существует необходимость в разработке просто и быстро осуществляемых на практике способов, чтобы можно было испытывать достаточное число веществ. Был разработан способ, с помощью которого можно идентифицировать химические соединения, которые специфически взаимодействуют с растительным протеином-переносчиком. Способ согласно изобретению состоит в том, что эти вещества сначала испытывают на ингибирование процесса переноса на трансгенном организме, предпочтительно одноклеточном организме, который функционально экспримирует растительный протеин-переносчик, или на трансгенных клетках, которые функционально экспримируют растительный протеин-переносчик. При этом вещества, идентифицированные как ингибиторы, испытывают затем на их действие на всем растении. Под понятием "протеин-переносчик" в рамках настоящего изобретения понимают протеины, которые ответственны за перенос веществ через мембраны в растительные клетки. Согласно способу по изобретению растительный протеин-переносчик интегрируют в испытуемую систему, что позволяет при помощи биохимических, микробиологических и физиологических измерительных методов качественно и количественно определять функцию мембранного переноса. Применение этой системы испытания позволяет осуществлять целенаправленное обнаружение активных веществ, которые могут взаимодействовать с протеинами-переносчиками растения. Взаимодействие веществ с протеином-переносчиком может вызывать ингибирование или инактивацию процесса переноса, кроме того, оно может само привести к переносу вещества. Так как процессы переноса играют основную роль в общем обмене веществ растений и часто имеют большое значение для роста растений, способ согласно изобретению позволяет целенаправленно и с высокой степенью вероятности идентифицировать вещества, которые оказывают влияние на рост растений. Взаимодействие может вызывать рострегулирующее или гербицидное действие, если обнаруженное вещество вызывает ингибирование естественного процесса переноса. В случае, если действующее вещество с ингибирующей активностью само подвергается переносу, оно может, являясь составной частью средств защиты растений, таких, как фунгициды, инсектициды, нематоциды и акарициды, в частности гербициды и регуляторы роста, повышать их подвижность в растениях и тем самым привести к обнаружению новых, более активных средств. Тест-система согласно изобретению может далее применяться для исследования растительных протеинов-переносчиков на молекулярном уровне. До настоящего времени не было описано ни одного способа идентификации веществ с гербицидным или рострегулирующим действием при помощи растительного протеина-переносчика. Также не описано ингибирование растительных процессов переноса в качестве механизма действия гербицидов. Далее, также неизвестно, представляют ли растительные протеины-переносчики вследствие занимаемого ими места в обмене веществ, например, при обеспечении соответст вующими веществами органа размножения, потенциальную представляющую интерес мишень ("target") для гербицидов или регуляторов роста. В случае способа согласно изобретению речь идет о биохимической системе испытания (тестсистеме), в которой первую стадию осуществляют предпочтительно на одноклеточных организмах или на клетках, содержащихся в клеточной культуре. Эта тест-система обладает преимуществом, заключающимся в том, что с ее помощью можно проводить идентификацию гербицидных и рострерулирующих веществ быстрее и проще по сравнению с известными способами. Далее, она позволяет при незначительных затратах времени испытывать множество веществ на их гербицидное или рострегулирующее действие. Далее, способ согласно изобретению обладает тем преимуществом, что с его помощью целенаправленно могут быть идентифицированы такие вещества, которые взаимодействуют с одним, определенным растительным протеином. Для того, чтобы избежать нежелательных воздействий на человека, животное и окружающую среду, протеин-мишень согласно способу выбирают таким образом, чтобы его функция была специфической для растений. В качестве протеинов-мишеней в способе согласно изобретению преимущественно применяют такие, которые ответственны в растениях за перенос веществ через мембраны (протеины-переносчики), предпочтительно такие протеины-переносчики, которые специфичны для растений. Предметом настоящего изобретения, таким образом, является способ идентификации веществ, обладающих потенциальным гербицидным или рострегулирующим действием, проявляющимся в ингибировании или инактивации растительного процесса переноса, который отличается тем, что химическое соединение испытывают на растительном протеине-переносчике на ингибирование процесса переноса и при этом активное соединение анализируют на его гербицидную или рострегулирующую активность в отношении растений, или что а) сначала протеин-переносчик получают гетерологической экспрессией последовательности ДНК, кодирующей этот протеин-переносчик, в трансгенном организме или трансгенных клетках, затем б) этот рекомбинантный организм как единое целое или трансгенные клетки используют для исследования химического соединения на его ингибирующее действие в отношении указанного протеина-переносчика и в) соединение дополнительно исследуют на активность по отношению к организму или клетке, который или которые не продуцируют соответствующий переносчик, чтобы исключить возможность того, что соединение действует в качестве ингибитора также на другие механизмы этого организма или клетки, и в заключение г) активное по отношению к переносчику соединение анализируют на его гербицидную или рострегулирующую активность в отношении растений. В целом в способе согласно изобретению можно применять все встречающиеся в растениях протеины-переносчики, соотв. последовательно 2 41386 сти ДНК, которые кодируют этот протеин-переносчик. Различные протеины-переносчики, ответственные за перенос веществ через мембраны, уже идентифицированы в растениях, частично в распоряжении имеются также последовательности ДНК, которые кодируют подобные протеиныпереносчики. Так, например, переносчики сахарозы можно обнаруживать непосредственно на неповрежденных растениях, соотв. на выделенной ткани листьев. Поглощение сахарозы зависит при этом от рН (Giaquinta, Nature 267: 360-370, 1977; Annu. Rev. Plant Physiol. 34: 347-387, 1983; Delrot и Bonnemain, Plant Physiol. 67: 560-564, 1981; Delrot, Plant Physiol. 67: 560-564, 1981). При этом высокоактивными ингибиторами переносчика являются пхлормеркурбензилсульфокислота и диэтилпиркарбонат (Bush, 1989, Plant Physiol. 89: 1318-1323). Последовательности кДНК, которые кодируют растительные переносчики сахарозы, уже описаны, например, для картофеля (р62, соотв. StSUT1) и шпината (S21, соотв. SoSUT1) (WO 94/00574; Riesmeier и др., 1993, Plant Cell 5: 1591-1598; Riesmeier и др., 1992, EMBO J. 11: 4705-4713), для Arabidopsis thaliana (гены suc1 и suc2; банк генов EMBL, депозитарный номер Х75365), для Plantago major (банк генов EMBL, депозитарный номер Х75764), для L. esculentum (банк генов EMBL, депозитарный номер Х82275) и для Nicotiana tabacum (банк генов EMBL, депозитарный номер Х82276 и Х82277). В случае переносчика сахарозы удалось осуществить клонирование последовательностей кДНК, которые кодируют эти переносчики, из шпината и картофеля путем развития искусственной комплементарной системы в Saccharomyces cerevisiae (Riesmeier и др., EMBO J. 11: 4705-4713, 1992; Riesmeier и др. 1993, Plant Cell 5: 1591-1598). Переносчики аминокислот также уже были идентифицированы в растениях. Родственные высшим растениям земные водоросли Chlorella обладают по меньшей мере тремя различными регулируемыми системами переноса аминокислот (Sauer и Tanner, Plant. Physiol. 79: 760-764, 1985). При этом речь идет об активном переносе, который энергетизируется генерированным НÅАТРазой градиентом протонов. Для более высших растений косвенно путем исследования состава ксилемы и флоэмы было сделано заключение о существовании пассивного переноса (облегченная диффузия) (Riens и др. Plant Physiol. 97: 227233; 1991). В противоположность этому происходит селективное поступление аминокислот во флоэму, соотв. ксилему семядолей клещевины, соответствующих корней, и против градиента концентраций (Schobert и Komor, Planta 177:342-349; Planta 181: 85-90, 1990). Существование по меньшей мере четырех независимых НÅ-сопереносчиков может быть подтверждено на выделенных везикулах в различных видах растений (Li и Bush, Plant Physiol, 94: 268-277, 1991). Путем комплементации аминокислотного переносчика-мутанта дрожжей удалось выделить и охарактеризовать гены уреид- и аминокислотной пермеазы из Arabidopsis thaliana, например, кДНК-последовательности, которые кодируют переносчики аминокислот ААР1 и ААР2 (Frommer и др. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5944-5948; Kwart и др., 1993, Planta J. 4: 993-1002; WO 94/01559). С помощью комплементарного метода с применением мутанта дрожжей shr3, который более не в состоянии направлять эндогенные аминокислотные переносчики к клеточной мембране (Ljungdahl и др. 1992, Cell 71: 463-478), удалось выделить ряд других последовательностей ДНК, которые кодируют растительные аминокислотные переносчики, например, последовательности кДНК, которые кодируют аминокислотные переносчики ААРЗ (банк генов EMBL, депозитарный № Х77499), ААР4 (банк генов EMBL, депозитарный № Х77500), ААР5 (банк генов EMBL, депозитарный № Х77501), ААТ1 (банк генов EMBL, депозитарный № Х71787) и NTR1 (банк генов EMBL, депозитарный № Х77503) из Arabidopsis thaliana. Далее, известны последовательности кДНК, кодирующие растительные переносчики аммония, например, кДНК, кодирующая переносчик аммония АМТ1 из Arabidopsis thaliana (Ninnemann и др., 1994, EMBO J. 13: 3464-3471; заявка на патент Германии Р4337597.9; банк генов EMBL, депозитарный № Х75879). В настоящее время уже имеется много публикаций, в которых наряду с вышеприведенными примерами описано клонирование генов, не проходящих через мембрану протеинов-переносчиков. В принципе существует множество различных путей клонирования генов мембранных протеинов. При выделении из эритроцитов гена переносчика глюкозы удалось, например, идентифицировать клоны кДНК после очистки протеина (Mueckler и др., Science 229: 941-945, 1985). Намного сложнее, однако, очистка такого рода, когда необходимо использовать другие методы, например, гомологическую экспрессию в ооцитах (Hediger и др., Nature 330: 379-381, 1987). Растительные гены НÅ-АТРазы плазмалеммы были клонированы посредством гомологии в гены животных и грибов. Растительные гены переносчика глюкозы могут быть выделены из Chlorella путем дифференцированного скрининга кДНК (Sauer и др. EMBO J. 8: 3045-3050, 1990). Клон кДНК из Clorella был использован в качестве гетерологической пробы, для того, чтобы клонировать многие гены переносчика глюкозы из высших растений (Sauer и др. 1990). Хлоропластный триозофосфаттранслокатор (ТРТ) радиоактивно метили ингибитором DIDS, меченый протеин очищали и секвинировали. Синтетические олигонуклеотиды, представляющие собой производные частичных пептидных последовательностей, использовали в качестве проб для выделения кДНК, кодирующей ТРТ (Flügge и др., EMBO J. 8: 39-46, 1989). Уже известные последовательности ДНК, которые кодируют растительные протеины-переносчики, можно в свою очередь применять для идентификации и выделения из растений других последовательностей ДНК, которые кодируют протеины-переносчики, используя общепринятые в молекулярной биологии методы. В способе по изобретению предпочтительно применяют гены, кодирующие протеины-переносчики, которые играют важную роль для роста растений. Ингибирование соответствующего протеина-переносчика должно было бы поэтому привес 3 41386 ти к нежелательному воздействию на рост. При условии, что в наличии имеются последовательности ДНК, кодирующие соответствующий протеин-переносчик, то это можно подтвердить, например, с помощью экспрессии или антисмыслового ингибирования соответствующего гена в трансгенных растениях (Willmitzer, Trends Genet. 4: 1318, 1988). Методика получения такого рода трансгенных растений известна специалисту в данной области техники. Так, на примере экспрессии антисмысловой РНК, которая кодирует триозофосфат-транслокатор, можно показать, что уже незначительное снижение экспрессии протеина приводит к резкому замедлению роста растения (Riesmeier и др., Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6160-6164, 1993). Аналогичным образом для переносчика сахарозы может быть подтверждено, что снижение активности приводит к сильному замедлению роста у растений картофеля. Кроме того, у упомянутых растений повреждаются листья, и у растений образуется мало клубней или они вообще не образуются (Riesmeier и др., 1994, EMBO J. 13: 1-7). Поскольку оказывается сильное отрицательное влияние на образование органов размножения, можно ожидать, что соответствующий гербицид будет не только замедлять рост растений, но и препятствовать их размножению. То же самое следует ожидать в случае переносчика аммония и аминокислоты, так как в обмене веществ они выполняют важную функцию по переносу азота. На основании описанной выше важной функции в предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения предусмотрено применение протеина-переносчика для аминокислот, сахарозы и аммония в качестве протеинов-мишеней для обнаружения потенциальных специфических к растениям активных веществ, в частности применение конкретных вышеуказанных протеиновпереносчиков. Приемлемые гены, кодирующие протеиныпереносчики, с помощью общепринятых молекулярногенетических методов таким образом вносят в организм или клетки, что обеспечивается экспрессия функциональноспособного протеинапереносчика. Под указанным в описании стадии а) способа организмом подразумевается предпочтительно одноклеточный организм. Одноклеточный организм выбирают таким образом, чтобы его клетки легко можно было культивировать и чтобы они были пригодны для экспрессии протеина-переносчика. Особенно пригодны для данной цели такие микроорганизмы, как бактерии, грибы или дрожжи. Однако можно применять также отдельные клетки организма. Пригодными для применения в способе согласно изобретению являются, например, также растительные клетки, содержащиеся в клеточной культуре, или культуры каллюса, равно, как и животные клетки в клеточной культуре, в частности также ооциты, предпочтительно ооциты Xenopus. Полученные введением растительного гена протеина-переносчика трансгенные клетки, соотв. полученный рекомбинантный организм как таковые могут представлять собой в этом случае составную часть тест-системы, либо их можно применять для выделения мем бран или очищенного протеина-переносчика. Эти рекомбинантные организмы (бактерии, грибы и дрожжи) и трансгенные клетки также является предметом изобретения. Ген, кодирующий протеин-переносчик, может быть кроме того внесен в определенный мутант организма, который не способен к росту без функции соответствующего протеина-переносчика (Riesmeier и др., 1994, EMBO J. 11: 4705-4713, 1992). Применение такого мутанта имеет особое преимущество, заключающееся в том, что благодаря этому рост рекомбинантного организма в соответствующей среде может служить мерой для функции переносчика и за счет этого можно качественно описать влияние исследуемых веществ на транспорт через мембрану. Испытание на рост отличается особой простотой и быстрой производительностью в отношении тестируемых веществ. Предпочтительно поэтому применение приемлемых мутантов, которые описаны, например, для переносчика сахарозы (SUSY7, см. Riesmeier и др., EMBO J. 11: 4705-4713, 1992), для переносчика аминокислоты (дрожжевые мутанты 22574d и JT16; см. Frommer и др., Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5944-5948, 1993; дрожжевой мутант shr3; cм. Ljungdahl и др., 1992, Cell 71: 463-478) и для переносчика аммония (Ninnemann и др., 1994, EMBO J. 13: 3464-3471). Согласно изобретению указанный организм, соотв. клетки трансформируются соответствующим геном-переносчиком. Рекомбинантный организм, соотв. трансгенные клетки можно затем размножать в любом количестве общеизвестными микробиологическими методами, и поэтому они имеются в наличии в неограниченном количестве для использования в тест-системе. Для испытания веществ на их гербицидные и/или рострегулирующие свойства предпочтительно исходить из многостадийной методики: сначала рекомбинантные организмы, соотв. трансгенные клетки выращивают в среде, причем соответствующий субстрат для выращивания выбирают таким образом, чтобы он проникал в клетки только с помощью исследуемого переносчика и, кроме того, не мог быть функционально заменен никаким другим субстратом среды. Например, в случае переносчика сахарозы последняя является единственным источником углерода в среде, в случае переносчика аминокислоты в среде присутствует аминокислота, которая служит для клеток единственным источником углерода или азота, и в случае переносчика аммония последний присутствует в среде в качестве единственного источника азота. Исследуемые вещества добавляют в среду во время фазы роста и рост клеток определяют по общепринятой методике. Для подтверждения взаимодействия вещества с мембранным переносчиком и исключения других активностей, являющихся причинами замедления роста, вещество должно отвечать следующим условиям: 1) рекомбинантные клетки после добавления вещества должны расти с явно более медленной скоростью, чем без добавления вещества; 2) у тех же самых организмов после добавления вещества не должна замедляться скорость роста, если в среде содержится другой субстрат для рос 4 41386 та, который функционально может заменить собственный субстрат переносчика в клетках и сам не попадает в клетки с помощью соответствующего переносчика. Дрожжевые клетки могут, например, расти альтернативно с сахарозой или с аминокислотой в качестве источника углерода. В качестве источника азота дрожжи альтернативно могут использовать аминокислоту или ионы аммония. Если вещество удовлетворяет указанным условиям, то его можно дальше исследовать в биохимическом тесте. В этом тесте измеряют прохождение через мембрану природного субстрата или ингибирующего вещества. При этом можно использовать целые дрожжевые клетки или выделенные везикулы мембраны. Прохождение через мембрану субстрата переносчика или ингибирующего вещества может быть подтверждено тем, что субстрат или вещество выделяют из отделенных клеток или везикул мембраны и анализируют общепринятыми аналитическими методами. Как правило, субстрат или вещество добавляют в радиоактивно меченной форме и затем анализируют их радиоактивное излучение. Путем варьирования концентраций субстрата и ингибирующего вещества с помощью общепринятых биохимических способов может быть определен тип ингибирования. Затем за счет этого можно определить, транспортируется ли само вещество с помощью переносчика. Если вещество удовлетворяет вышеуказанным условиям, то его можно посредством дополнительных биохимических исследований или без них испытывать непосредственно на целом растении или соответствующих частях растений на его гербицидное действие или на его подвижность в растении. Для этого можно использовать общепринятые гербологические и физиологические методы. Идентифицируемые предложенным в изобретении способом вещества, обладающие гербицидным и/или рострегулирующим действием на растения, а также их композиции с другими гербицидами, регуляторами роста, нематоцидами, инсектицидами, акарицидами, фунгицидами и обычно применяемыми в сельском хозяйстве вспомогательными веществами также являются предметом изобретения. Идентифицируемые предложенным в изобретении способом гербицидные и/или рострегулирующие активные вещества можно применять в качестве средств защиты растений индивидуально или в сочетании с другими гербицидами, регуляторами роста, нематоцидами, инсектицидами, акарицидами, фунгицидами и обычно применяемыми в сельском хозяйстве вспомогательными веществами. С помощью способа по изобретению можно также идентифицировать вещества, которые сами переносятся протеином-переносчиком (переносчиком) через растительную клеточную мембрану. Эти вещества также являются предметом изобретения. Благодаря этому способ может служить для идентификации таких химических структур, которые особенно хорошо транспортируются в растении. Это свойство хорошей подвижности особенно необходимо для таких средств защиты растений, как гербициды и инсектициды. Способ по изобретению можно использовать далее в качестве тест-системы для идентификации транспортируемых химических структур. Так как переносчики сахарозы и аминокислоты являются основными транспортными системами для органической молекулы в мембранах, то дрожжевую систему, например, можно использовать в качестве простого теста для исследования подвижности органических соединений в растении. При этом предпочтительно исходить из многостадийной методики: сначала в тесте на рост можно исследовать поглощение чужеродных веществ. Основываясь на этом, затем для более точного исследования можно использовать непосредственные измерения переноса на интактных дрожжах или выделенных мембранах. В качестве контроля в распоряжении всегда имеются дрожжи, которые не содержат переносчика. Наряду с дрожжами для этой цели можно применять также другие организмы, в частности одноклеточные организмы, и прежде всего также клеточные культуры животных и растительных клеток. В случае специфического отрицательного воздействия переноса должен наблюдаться пониженный рост в трансгенных дрожжах. Исследуя переносчики, можно прийти к более лучшему пониманию того, какие свойства веществ являются необходимыми для транспортируемости. Для целого ряда веществ, которые до настоящего времени из-за отсутствия способности к переносу были не активны как пестициды, стало бы возможным таким образом химически изменить молекулы, чтобы они приобрели эти свойства соответствующих соединений и тем самым лучше достигали места действия. Также стало бы возможным таким образом изменить переносчики посредством молекулярнобиологических методов или мутации, чтобы они лучше транспортировали через мембрану пестициды, такие, как инсектициды и гербициды. Измененные гены протеина-переносчика можно было бы снова внести в растения. Применение подобных протеинов-переносчиков, которые транспортируют пестициды через растительные клеточные мембраны, также является предметом настоящего изобретения. Кроме того, предметом изобретения являются пестициды, в частности гербициды и регуляторы роста, которые могут ингибировать растительную транспортную систему, причем растительной транспортной системой (переносчиками) является, например, переносчик сахарозы, аммония или аминокислоты. Систему наряду с обнаружением веществ можно также использовать для исследования других важных проблем, например, для определения структурного построения подобных протеинов и каким образом происходит распознавание субстратов, соотв. каким образом взаимосвязаны структура и функция и каким образом вообще происходит распределение веществ в организме. Методика, которая привела к выделению и определению признаков описанных переносчиков, может быть также использована для выделения других протеинов (например, переносчиков ионов или 5 41386 протеинов-переносчиков из животных систем) и для их исследования аналогичным образом. Нижеследующие примеры по применению приведены для более подробной иллюстрации предмета настоящего изобретения и не ограничивают его объем. В них описано применение растительных переносчиков сахарозы, аминокислоты, соотв. аммония для идентификации веществ, которые действуют на эти переносчики в качестве ингибиторов. Примеры по применению Пример 1 Идентификация ингибиторов растительных переносчиков аминокислоты Для идентификации ингибиторов растительных переносчиков аминокислоты проводили исследования по переносу на дрожжевом мутанте 22674d (Jauniaux и Grenso, Eur. J. Biochem. 190: 30-44, 1990), несущем мутацию в гене пермеазы аминокислоты, соотв. на дрожжевом мутанте JT16 (Tanata и Fink, Gene 38: 205-214, 1985), который не в состоянии поглощать гистидин. Эти мутанты трансформировали с кДНК-последовательностями, которые кодируют растительные переносчики аминокислоты и приводят к экспрессии функциональных переносчиков в дрожжевых клетках. В случае кДНК-последовательностей речь идет о кДНК-последовательностях, которые кодируют переносчик аминокислоты ААР1, соотв. ААР2 из Arabidopsis thaliana (Frommer и др., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5944-5948; Kwart и др., 1993, Plant J. 4: 993-1002). Для анализа клетки этих мутантов выращивали при 28°С в минимальной среде (NAAG+5 ммоль/л пролина) и собирали в логарифмической фазе (оптическая плотность ОП600=0,6). Клетки подвергали центрифугированию в течение 10 минут при 4000 об/мин при температуре 4°С в центрифуге и дважды промывали AUB-буфером (модифицированный ААВ-буфер, Ljungdahl и др.). Концентрацию клеток устанавливали на значение ОП600=25 в AUB-буфере. Использованные среды и буферы: NAAG-среда: - 1,7 г/л дрожжей-азотистого осно-вания, эмульсия типа "вода в масле" (в/м) аминокислоты и сульфат аммония SDGlu-среда: - 10 г/л глюкозы - 20 г/л агарозы - 6,7 г/л дрожжей-азотистого основания, в/м аминокислоты SDsuc-среда: - 20 г/л глюкозы - 20 г/л агарозы - 6,7 г/л дрожжей-азотистого основания, в/м аминокислоты - 20 г/л сахарозы AUB-буфер: - 10 ммоль/л MES - 2 ммоля/л хлорида магния - 0,6 ммоля/л сорбитола По 100 мкл клеточной суспензии смешивали с 100 мкл 1 ммоля/л раствора L-пролина (L-[14C]пролин с радиоактивностью 18,5 кБк) и различными концентрациями соответствующих исследуемых веществ. Через 20, 60, 120 и 180 секунд отбирали аликвоты по 50 мкл, разбавляли в 4 мл ледяного AUB-буфера и отфильтровывали через фильтр из стекловолокна. Чтобы удалить неспецифически связанный L-[14C]-пролин, клетки два жды промывали по 4 мл ледяной воды. Затем задержанную в стеклянном фильтре радиоактивность измеряли сцинтилляционным счетчиком. Радиоактивность отражает поглощенное клетками количество радиоактивно меченного пролина. В качестве контроля определяли, во-первых, поглощение радиоактивно меченного пролина без добавления потенциального ингибитора. Далее, в качестве контроля применяли соответственно клетки мутантов 22574d или JT16, которые не были трансформированы кДНК-последовательностями, кодирующими растительные переносчики аминокислоты. Результаты этих измерений на мутантах 22457d-ААР2, которые экспримируют переносчик аминокислоты ААР2 из Arabisopsis thaliana, приведены в следующей таблице. Испытуемое вещество КЦХФ ДНФ ДЭПК Азетидин-2карбоксилат D-пролин 10 мкМ 0,1 мМ 1 мМ Активность по отношению к контролю [%] 15,6±2,1 7,6±1,6 3,1±1,2 10 мМ 62 10 мМ 90 Концентрация КЦХФ - карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон ДНФ - 2,4-динитрофенол, ДЭПК - диэтилпирокарбонат Для исследований трансформировали клети дрожжей штамма 22457d с кДНК-последовательностью, которая кодирует переносчик аминокислоты ААР2, и определяли поглощение радиоактивно меченного пролина в присутствии различных веществ. Указаны различные испытуемые вещества, их концентрация, а также активность переносчика, представленная в виде процентной активности от контроля, в который не добавляли потенциальные ингибиторы. Вещества, которые обнаруживают специфически ингибирующее действие на переносчик аминокислоты ААР2, испытывали на целых растениях на их гербицидное, соотв. рострегулирующее действие. Пример 2 Идентификация ингибиторов переносчика сахарозы из Spinacia oleracea Для идентификации веществ, которые обладают ингибирующим действием на переносчик сахарозы из шпината, использовали клетки дрожжей штамма SUSY7 (Riesmeier и др., 1992, EMBO J. 11: 4705-4713). Клетки этого штамма трансформировали кДНК-последовательностью, которая кодирует переносчик сахарозы S21 (SoSUT1) из шпината и обеспечивает экспрессию функционального переносчика в клетках. Дрожжевые клетки выращивали в минимальной среде (SD + 2% (вес/объем) сахарозы, рН 3,8) при 28°С и собирали в логарифмической фазе (ОП600=0,6). Клетки подвергали центрифугированию в течение 10 минут при 4000 об/мин и дважды промывали SD-средой. По сырому весу клеток определяли концентрацию клеток в SD-среде, составлявшую с=50 г/л, и фракции отбирали аликвотами по 200 мкл. Перед собственно реакцией клетки инку 6 41386 ингибиторов переносчика сахарозы некоторые действуют как гербициды на растения, например, ПХМБС. Пример 3 Идентифицирование ингибиторов переносчика сахарозы из Solanum tuberosum Для идентификации веществ, которые обладают ингибирующим действием на переносчик сахарозы из картофеля, использовали дрожжевые клетки штамма SUSY7 (Riesmeier и др., 1992, EMBO J. 11: 4705-4713). Клетки этого штамма трансформировали кДНК-последовательностью, которая кодирует переносчик сахарозы Р62 (StSUT1) из картофеля (WO 9499547, Riesmeier и др., 1993, Plant Cell 5: 1591-1598) и обеспечивает экспрессию функционального переносчика в клетках. Полученный штамм дрожжей был назван SUSY-7-P62 (StSUT1). Клетки дрожжей выращивали в минимальной среде (SD + 2% (вес/объем) сахарозы, рН 3,8) при 28°С и собирали в логарифмической фазе (ОП600=0,6). Клетки подвергали центрифугированию в течение 10 минут при 4000 об/мин и дважды промывали SD-средой. По сырому весу клеток устанавливали концентрацию клеток в SD-среде, составлявшую с=50 г/л, и фракции отбирали аликвотами по 200 мкл. Перед собственно реакцией клетки инкубировали 5 минут в 10 мМ глюкозе и с помощью MES-буфера устанавливали рН=3,8. Реакцию инициировали добавлением 200 мкл 0,2 ммолей/л раствора [14С]сахарозы (3 мКи/ммоль) в SD-среде (рН 3,8). Через 20, 60, 120, 180 и 240 секунд отбирали соответственно по 70 мкл суспензии и вносили пипеткой в 4 мл ледяной воды для прекращения реакции. Клетки отфильтровывали через фильтр из стекловолокна и дважды промывали ледяной водой. Затем определяли радиоактивность на фильтрах сцинтилляционным счетчиком. Испытуемые вещества добавляли за 30 секунд до добавления сахарозы. В качестве контроля определяли, во-первых, поглощение радиоактивно меченной сахарозы без добавления потенциального ингибитора. Далее, контролем служили клетки штамма SUSY7, которые не трансформировали кДНК-последовательностями, кодирующими переносчик сахарозы из картофеля. Результаты этих измерений представлены в следующей таблице. бировали 5 минут в 10 мМ глюкозе и с помощью MES-буфера устанавливали на рН=3,8. Реакцию инициировали добавлением 200 мкл 0,2 ммолей/л раствора [14С]-сахарозы (3 мКи/ммоль) в SD-среде (рН 3,8). Через 20, 60, 120, 180 и 240 секунд отбирали соответственно по 70 мкл суспензии и вносили пипеткой в 4 мл ледяной воды для прекращения реакции. Клетки отфильтровывали через фильтр из стекловолокна и дважды промывали ледяной водой. Затем определяли радиоактивность на фильтрах сцинтилляционным счетчиком. Исследуемые вещества добавляли за 30 секунд перед добавлением сахарозы. В качестве контроля, во-первых, определяли поглощение радиоактивно меченной сахарозы без добавления потенциального ингибитора. Далее, контролем служили клетки штамма SUSY7, которые не трансформировали кДНК-последовательностями, кодирующими переносчик сахарозы из шпината. Результаты этих измерений представлены в следующей таблице. Активность по Испытуемое вещеКонцентрация отношению к ство контролю [%] КЦХФ 10 мкМ 10 ПХМБС 0,1 мМ 21 ДЭПК 0,5 мМ 6 Палатиноза 2 мМ 85,0 Манноза 2 мМ 86,5 Тагатоза 2 мМ 104,7 Мелецитоза 2 мМ 97,2 Раффиноза 2 мМ 110,3 Галактоза 2 мМ 97,7 Целлобиоза 2 мМ 99,4 Мелибиоза 2 мМ 92,3 Альтроза 2 мМ 80,6 2 мМ 81,8 a-Лактоза 2 мМ 94,9 b-Лактоза 2 мМ 8,0 a-Фенилглюкоза NH2 HO 1,0 ммоль/л HO 0 OH NH 2 N N N N 1,0 ммоль/л Испытуемое вещеКонцентрация ство 0 КЦХФ ПХМБС 2,4-ДНФ ДЭПК N-этиламалеимид Палатиноза Тагатоза Раффиноза b-Лактоза a-Фенилглюкоза OH ПХМБС - п-хлормеркурбензилсульфокислота Указаны различные испытуемые вещества, их концентрация, а также активность переносчика, представленная в виде процентной активности от контроля, в который не добавляли потенциальные ингибиторы. Вещества, которые обнаруживают специфически ингибирующее действие на переносчик сахарозы S21 (SoSUT1), испытывали на целых растениях на их гербицидное, соотв. рострегулирующее действие. Из идентифицированных 10 мкМ 0,1 мМ 0,1 мМ 0,5 мМ 1 мМ 2 мМ 2 мМ 2 мМ 2 мМ 2 мМ Активность по отношению к контролю [%] 9 20 3 6 22 102 103 110 91 7 Указаны различные испытуемые вещества, их концентрация, а также активность переносчика, представленная в виде процентной активности от контроля, в который не добавляли потенциальные 7 41386 ингибиторы. Вещества, которые обнаруживают специфически ингибирующее действие на переносчики сахарозы Р62 (StSUT1), испытывали на целых растениях на их гербицидное, соотв. рострегулирующее действие. Из идентифицированных ингибиторов переносчика сахарозы некоторые действовали на растения как гербициды, например, ПХМБС. Пример 4 Определение специфичности субстрата переносчика сахарозы Исследования специфичности субстрата и определение значения Кm проводили в штамме дрожжей SUSY7-pP62 (StSUT1) (Riesmeier и др., 1993, Plant Cell 5: 1591-1598), который экспримирует переносчик сахарозы из Solanum tuberosum. При этом работали аналогично примеру 3, за исключением того, что изменяли концентрацию субстрата и не добавляли потенциальные ингибиторы. Для контроля фоновой активности определяли поглощение [14C]-сахарозы штаммом дрожжей SUSY7, который не экспримирует переносчик. Этот штамм по истечение времени измерения не обнаруживал измеримого поглощения [14С]сахарозы. Результаты опыта: Кm для сахарозы 1 мМ Кm для мальтозы 10 мМ Пример 5 Активирование переносчика сахарозы Транспорт сахарозы переносчиком сахарозы Р62 (StSUT1) из Solanum tuberosum может быть усилен путем предварительного энергетизирования дрожжевых клеток инкубацией в глюкозе, стахиозе и аденине. Такое же повышение активности переноса достигается снижением значения рН до 3,8 при измерении. Измерение переноса для определения активности проводили аналогично примеру 3, однако в данном случае клетки перед собственно измерением инкубировали не 5 минут в 10 мМ глюкозе, а 5 минут в растворах глюкозы, стахиозы, соотв. аденина различной концентрации. Контролем служили дрожжевые клетки, которые перед измерением не инкубировали в растворах этих веществ. В следующей таблице показана активность транспорта сахарозы при различных концентрациях глюкозы, стахиозы, соотв. аденина по сравнению с контролем. Глюкоза Стахиоза Аденин Пример 6 Идентификация ингибиторов растительных переносчиков аммония Измерения переноса для идентификации ингибиторов растительного переносчика аммония проводили со структурным аналогом метиламина, так как радиоактивно меченный аммоний не является коммерчески доступным. Для исследований использовали дрожжи штамма S26972с (Dubois и Grenson, Mol. Gen. Genet. 175: 67-76, 1979), который несет мутацию в NH4+ -пермеаза-генах МЕР1 и МЕР2. Дрожжевые клетки трансформировали стандартными методами с помощью последовательностей кДНК, которые кодируют переносчик аммония из растений и обеспечивают экспрессию функционального переносчика в дрожжевых клетках. При этом речь идет о переносчике АМТ1 из Arabidopsis thaliana (Ninnemann и др., 1994, EMBO J. 13: 3464-3471). Клетки выращивали в среде NAAG (2% глюкозы, "1,7 г/л дрожжей-азотистого основания, в/м аминокислоты и сульфат аммония" (фирма Difco), обогащенная 500 мкг/мл L-пролина) при 28°С и собирали в логарифмической фазе (ОП600=0,6). Затем клетки центрифугировали 10 минут при 4000 об/мин и 4°С в соответствующей центрифуге, дважды промывали 20 мМ натрийфосфатным буфером, рН 7, и в этом же буфере растворяли до ОП600=8. Суспензию клеток отбирали фракциями в виде аликвот по 200 мкл. За 5 минут до собственно измерения дрожжи активировали добавлением 100 мМ глюкозы и инкубировали при 30°С. Для инициирования реакции 100 мкл клеточной суспензии добавляли к 100 мкл реакционной смеси (20 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7; [14С]-метиламин (NEN) с радиоактивностью 18,5 кБр; 100 мкМ метиламин; испытуемое вещество в зависимости от эксперимента). Соответственно через 10, 60, 120 и 180 секунд после начала реакции отбирали аликвоты по 50 мкл, добавляли в 4 мл ледяного раствора 5 мМ метиламина и фильтровали через фильтр из стекловолокна. Затем после промывки фильтра дополнительно 8 мл раствора метиламина определяли радиоактивность на фильтрах сцинтилляционным счетчиком. Ингибиторы добавляли за 60 секунд до добавления глюкозы. В качестве контроля определяли, вопервых, поглощение радиоактивно меченного метиламина без добавления потенциального ингибитора. Далее, в качестве контроля проводили те же испытания по переносу на дрожжевых клетках штамма S26972с, которые не трансформировали. Результаты этих исследований приведены в следующей таблице. Активность по отношению к контролю с1 [0,2 ммоля/л] с2 [2 ммоля/л] 89±5 90±3 144±9 101±8 141±5 225±6 Испытуемое вещество Нет Метиламин Диметиламин Триметиламин Этиламин КСl RbCl CsCI NH4Cl Стахиоза при незначительных концентрациях стимулирует транспорт сахарозы, при высоких концентрациях (с>0,4 ммоля/л) этот эффект становится обратным, и стахиоза начинает уменьшать поглощение. Для аденина существует линейная зависимость между концентрацией аденина и увеличением скорости переноса сахарозы. Путем сравнительных исследований можно показать, какие домены являются важными для сродства переносчика к сахарозе. 8 Концентрация / 500 мкМ 500 мкМ 500 мкМ 500 мкМ 500 мкМ 500 мкМ 500 мкМ 500 мкМ Активность по отношению к контролю [%] 100 40 89 89 93 98 96 98 10 41386 Продолжение таблицы Испытуемое вещество Концентрация Циклогексимид Антимицин А ДЦКД 2,4-ДНФ КЦХФ 10 мкг/мл 10 мкг/мл 200 мкМ 100 мкМ 10 мкМ ров переносчиков аммония некоторые действуют на растения как гербициды, например, метиламин. Пример 7 Определение специфичности субстрата переносчика аммония АМТ1 из Arabidopsis thaliana Исследования специфичности субстрата и определение значения Кm проводили с дрожжевым штаммом S26972с (Dubois и Grenson, Mol. Gen. Genet. 175: 67-76, 1979), который экспримирует переносчик аммония АМТ1. При этом работали аналогично примеру 6, за исключением того, что варьировали концентрацию субстрата-метиламина. Для контроля фоновой активности определяли поглощение [14С]-метиламина дрожжевым штаммом, который не экспримирует указанный переносчик. Для определения сродства системы переноса для аммония определяли ингибирование переноса метиламина различными концентрациями аммония (константа ингибирования Кi). Кm для метиламина 65 мкМ Кi для аммония