Полімерний кон’югат камптотецину, фармацевтична композиція

УКРАЇНА (19) UA (11) 42706 (51) 7 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ Д ЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛ ЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ (13) C2 A61K47/48 ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) ПОЛІМЕРНИЙ КОН'ЮГАТ КАМПТОТЕЦИНУ, ФАРМАЦ ЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ , , (6) в которой R представляет собой водород или NН2 в положении 9 молекулы камптотецина, при этом С-20-гидроксигруппа камптотецина связана с концевой карбонильной группой пространственной группы [SPA], а * отмечена связь С-20 гидроксиль C2 (13) 42706 (11) , (2) в которой группа [SPA] является пространственной группой, имеющей соответствующие концевые амино- и карбонильные группы, которые разделены, по крайней мере, тремя атомами, и О-CРT представляет собой остаток камптотецина формулы 6: , (3) в которой Z представляет собой гидрокси или остаток формулы -NH-CH2-СН(ОН)-СH3. 2. Конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что пространственную группу [SPA] выбирают из: ALaGLy, Phe-GLy, Phe-Phe, Leu-Gly, Val-Ala, Phe-Ala, Leu-Phe, Leu-Ala, Phe-Leu-Gly, Phe-Phe-Leu, LeuLeu-Gly, Phe-Tyr-Ala, Phe-Gly-Phe, Phe-Phe-Gly и Phe-Leu-Gly-Phe. 3. Конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что пространственная группа [SPA] представляет собой группу формулы -НN-У-СО-, в которой У является С3-C6 линейной или разветвленной алкильной группой или Ala-Gly-NH-У-CO-, Phe-Gly-NH-У-CO, Phe-Phe-NH-У-CO-, Leu-Gly-NH-У-CO-, Val-Ala-NHУ-CO, Phe-Ala-NH-У-CO-, Leu-Phe-NH-У-CO, LeuAla-NH-У-CO-, Phe-Leu-Gly-NH-У-CO, Phe-Phe-LeuNH-У-CO-, Leu-Leu-Gly-NH-У-CO, Phe-Tyr-Ala-NHУ-CO, Phe-Gly-Phe-NH-У-CO-, Phe-Phe-Gly-NH-УCO или Phe-Leu-Gly-Phe-NH-У-CO-, в которой У имеет те же значения, которые указаны выше. 4. Конъюгат по любому из предшествующих п унктов, отличающийся тем, что О-СРТ представляет собой камптотециновый остаток формулы 6: в которой R представляет собой водород или NН2 в положении 9 молекулы камптотецина, a * отмечена связь С-20 гидроксильной группы камптотецина с концевой карбонильной группой пространственной группы [SPA]. 5. Конъюгат по одному любому из предшествующи х пунктов, отличающийся тем, что в нем присутствуе т от 1 до 10 мол. % звеньев формулы 2. UA , (1) (іі) от 1 до 40 мол. % 20-О-(N-метакрилоилглициламиноацил)-камптотециновых звеньев, представленных формулой 2: ной группы камптотецина с концевой карбонильной группой пространственной группы [SPA], и (ііі) от 0 до 10 мол. % N-метакрилоилглицина или N-(2-гидроксипропил)метакрилоилглицинамидных звеньев, представленных формулой 3: (19) (21) 95073111 (22) 21.09.1994 (24) 15.11.2001 (31) 9320781.9 (32) 08.10.1993 (33) GB (86) PCT/EP94/03154, 21.09.1994 (46) 15.11.2001, Бюл. № 10, 2001 р. (72) Анджелуччі Франческо, IT, Суарато Антоніо, IT (73) ФАРМАЦІЯ С.П.А., IT (56) WO 9314142 А, 22.07.1993. WO 9313804 А, 22.07.1993. US 4943579 А, 24.04.1990 (57) 1. Полимерный конъюгат камптотецина, который является растворимым и обладает противоопухолевой активностью, отличающийся тем, что состоит в основном из: (і) от 60 до 99 мол. % N-(2-гидроксипропил)метакрилоиламидных звеньев, представленных формулой 1: 42706 6. Конъюгат по одному из предшествующи х п унктов, отличающийся тем, что содержание камптотецина составляет от 1 до 10% (вес/вес). 7. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, содержащая ак тивный ингредиент и фармацевтический приемлемый разбавитель или носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента содержит эффективное количество полимерного конъюгата камптотецина по любому из пп. 1-6. Настоящее изобретение относится к водорастворимому полимерносвязанному камптотецину и производным полимерносвязанного камптотецина, наделенным противоопухолевой активностью, к способу их получения и к содержащим их лекарственным препаратам. Камптотецин представляет алкалоид, выделенный из листьев и коры Сamptotheca acuminata; известны также другие аналоги камптотецина, которые получены полусинтезом или полным синтезом из камптотецина: см. J. Amer. Chem. Soc. 94(10), 3631, 1972, J. Chem. Soc. D. (7), 404, (1970); патент США № 4981969 (Jan. I, 1991), патент США № 5049668 (Sep. 17, 1991). Камптотецин имеет пентациклическую структуру, состоящую из системы конденсированных колец, образующей хинолиновое кольцо (кольца А и В), пирролидиновое кольцо (кольцо С), пиридиновое кольцо (кольцо D) и a-гидрокси-dлактоновую составляющую (кольцо Е). Камптотецин и несколько его производных, замещенных в кольце А, проявляют антиопухолевую активность против множества плотных опухолевых линий, включая клеточные линии, невосприимчивые к химиотерапевтическим средствам (см.: J. Clin. Pharmacol. 30, 770(1990); Cancer Chemother Phаrmacol. 28,192 (1991)). Камцтотецин, а также большинство его производных практически нерастворимы в наполнителях, подходящих для парентерального введения, из-за слабой основности атома азота хинона. Предлагалось несколько водорастворимых пролекарств для того, чтобы солюбилизировать камптотецин, например, производные 20-0-фосфата или 20-0-ациламино, которые можно протонировать посредством минеральных кислот, обеспечивая таким образом растворимость в воде: см. патент США № 4943579 (Jul. 24, 1990). Введение таких лекарственных средств связано с побочным токсическим действием, включая гематологическое и жедудочно-кишечное. Были предприняты многочисленные попытки для улучшения терапевтического индекса камптотецина путем модификации его структуры. Настоящее изобретение обеспечивает полимерные конъюгаты камптотецина, которые являются водорастворимыми и обладают противоопухолевой активностью. in vivo и пониженной токсичностью. Более конкретно, изобретение обеспечивает полимерный конъюгат, который обозначен здесь как А, и который состоит по существу из: (i) от 60 до 99 мол. % N-(2-гидроксипропил)метакрилоиламидных звеньев, представленных формулой 1: (ii) от 1 до 40 мол. % 20-0-(N-метакрилоиламиноацил)камптотециновых звеньев, представленных формулой 2: 2 в которой /А/ представляет пространственную группу, имеющую соответствующие концевые амино и карбонильные группы, которые разделены, по крайней мере, тремя атомами, и O-CPT представляет остаток камптотецина, при этом С-20 группа камптотецина связана с концевой карбонильной группой пространственной группы /А/; и (iii) от 0 до 10 мол. % N-метакрилоилглицина или N-(2-гидроксипропил)метакрилоилглицинамидных звеньев, представленных формулой 3: 3 в которой Z представляет гидрокси или остаток формулы –NH-CH2-CH(OH)-CH3. Изобретение также обеспечивает способ получения полимерного конъюгата, который определен выше, при этом способ включает взаимодействие производной 20-0-ациламино-камптотецина формулы 7: Н/А/-О-РТ 7 в которой /А/ и О-CРT являются такими, как они определены выше, с полимером, состоящим по существу из: (i) от 60 до 99 мол. % N-(2-гидроксипропил)метакрилоиламидных звеньев, представленных формулой 1: и 1 (iv) от 40 до 1 мол. % N-метилакрилоилглициновых звеньев, представленных формулой 4: 4 в которой R2 представляет (а) остаток активного сложного эфира или (в) гидрокси; и возможное замещение остаточных групп активного сложного эфира 1-амино-2-пропанолом. Полимерный конъюгат А содержит N-(2-гидроксипропил)метакрилоиламидные звенья, представленные формулой 1, в количестве 60 мол. % или выше, например, по крайней мере, 80 мол. % или, по крайней мере, 85 мол. %. Эти звенья могут присутствова ть в количестве от 91 до 98 мол. %. 1 2 42706 Конъюгат может содержать от 1 до 40 мол. % 200-(N-метакрилоилглициламиноацил)камптотециновых звеньев, представленных формулой 2, например, от 1 до 20 мол. % этих звеньев. Конъюгат может содержать от 1 до 8 мол. %, например, от 2 до 6 мол. % этих звеньев. Пространственная группа /А/ может иметь от трех до двенадцати, например, от шести до девяти атомов. Обычно группа является чувствительной к внутриклеточному гидролизу. Предпочтительно она является устойчивой к внеклеточному гидролизу. Пространственная группа может быть пептидной промежуточной группой, содержащей, например, от 1 до 4 или от 2 до 4 аминокислотных остатков. Промежуточная группа может, таким образом, быть дипептидом, трипептидом или тетрапептидом. Предпочтительно, пространственную группу /А/ выбирают из AIa-GІу, Phe-GIy, Рhe-Рhe, LeuGly, Val-AIa, Phe-AIa, Leu-Phe, Lеu-АІа, Phe-LeuGly, Phe-Phe-Leu, Leu-Leu-GIy, Рhе-Туr-Ala, PheGIy-Phe, Phe-Phe-GIy, и Phe-Leu-GIy-Phe. Альтернативно пространственная группа /А/ представляет группу формулы HN-У-CO, в которой У представляет C3-C6 линейный или разветвленный алкил, например, -(СН2)n-, в котором n равно 3, 4, 5 или 6. Альтернативно пространственная группа /А/ является группой формулы AIa-GIy-NН-У-СО, РhеGІу-NН-У-СО-, Рhе-Рhе-NН-У-СО-, Leu-GIу-NН-УСО, VаІ-АІа-NН-У-СО-, Phе-АІа-NН-У-СО, Leu-РhеNН-У-СО-, Lеu-AIa-NH-У-СО, Phе-Leu-Gly-NH-УСО-, Рhe-Рhe-Leu-NН-У-СО-, Leu-Leu-GIy-NН-УСО-, Phе-Туr-AIа-NН-У-СО-, Phe-GIy-Phe-NH-УСО-, Рhе-Рhе-GІу-NН-У-СО- или Phе-Leu-GIУ-РhеNН-У-СО-, где У имеет те же самые значения, которые указаны выше. Остаток камптотецина обозначен О-СРТ. Камптотецин может быть самим камптотецином или его аналогом, например, А-кольцевым аналогом. Такой А-кольцевой аналог представляет, таким образом, камптотецин, замещенный в А-кольце. Камптотецин может быть в природной S-форме или в R-форме или в смеси R- и S-формы (рацемическая смесь). Соответствующие остатки камптотецина O-CPT обозначены формулой 5: в которой R1 - является таким, как он определен выше. Предпочтительно звенья формулы 2 присутствуют в количестве от 1 до 10 мол. %, например, от 0,5 до 5 мол. %. Также предпочтительно, чтобы содержание камптотецина составляло от 1 до 10% (вес/вес), более предпочтительно от 4 до 8% (вес/вес) относительно полимерного конъюгата. Изобретение также обеспечивает производную 20-0-ациоаминокамптотецина формулы 7, которая определена выше. Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает способ получения производной 20-0-ациоаминокамптотецина, который включает конденсацию камптотецина с N-замещенной аминоацильной производной формулы 8: R3-/А/-Р, 8 в которой /А/ является такой, как она определена выше, и R3 представляет защитную гр уппу для амино, например, t-boc, CBZ, FMОС, три фенилсилил, дифенилметилен, или трифенилметил, и Р является остатком активного сложного эфира, например, р-нитрофенокси, пентафторфенокси или N-гидроксисукцинимидо, в присутствии активирующего агента, например, 4-диметиламинопиридина, для получения N-защищенного-20-0-(ациламино) соединения, представленного формулой 9: R3-/А/-/О-CРT/, 9 в которой R3, /А/ и /О-CРT/ являются такими, как они определены выше, и удаление N-защитной группы из полученного соединения. Получение соединений формулы 8 осуществляют в соотве тствии со стандартными методиками синтеза, которые хорошо известны из литературы. Подходящие N-защищенные аминоацильные производные формулы 8 включают N-тритил-Lфенил-аланил-L-лейцил-глицил-р-нитрофениловый эфир (8а) или N-тритил-глицил-L-лейцилглицил-р-нитрофениловый эфир (8в) или 6-Nтритилгексаноил-р-нитрофениловый эфир (8с). Некоторые производные формулы 8 и их получение описаны также в нашей находящейся на совместном рассмотрении Международной заявке на патент № РСТ/ЕР94/01100. Таким образом, можно допустить, например, взаимодействие камптотецина с молярным избытком, например, с 5-кратным молярным избытком или большим, главным образом 2 мол. эквивалентом, N-защищенной аминоацильной производной формулы 5 в безводном растворителе, например, безводном диметилформамиде или диметилсульфоксиде, в присутствии активирующего агента, например, 4-диметиламинопиридина. В этом способе замещенную аминокислоту вводят в положение С-20 молекулы камптотецина. Реакцию можно обычно осуществить в течение времени от 8 до 24 часов. Реакцию обычно проводят при температуре от 15 до 40°С. Следует отметить, что следуя таким реакционным условиям, 9-аминокамптотецин пространственно специфически взаимодействует в С-20гидроксиположении, что обусловлено слабой основностью 9-аминогруппы. Защитн ую гр уппу R3 для амино удаляют посредством соответствующего средства, устраняющего защиту, при этом получают производную 20-0-ациламино-камптотецина формулы 7. Сле 5 в которой R1 представляет, например, водород, гидрокси-, или амино-, или метилендиоксигруппу, связанную с двумя смежными атомами углерода в А-кольце. Предпочтительно, R1 представляет водород, 9-, 10-, 11- или 12-гидрокси-, 9- или 10нитро-, 9-или 10-aминo- или 10-, 11-метилендиокси. Более предпочтительными являются остатки камптотецина формулы 6: 6 3 42706 довательно, устранение защиты может быть достигнуто путем обработки уксусной кислотой, или путем восстановления. Следовательно, может быть также использован гидрогенолиз. Конденсацию производной 20-0-ациламинокамптотецина формулы 7 с полимером, состоящим по существу из N-(2-гидpoкcипропил)метакрилоиламидных звеньев формулы 1 в количестве от 60 до 99 мол. % и N-метакрилоиламидных звеньев формулы 4 в количестве от 40 до 1 мол. % и возможно последующее замещение остаточных групп активного эфира осуществляют в условия х, способных сохранить природу связи между камптотецином и промежуточными группами /А/, а также свойства конъюгата. Полимеры состоящие по существу из N-(2гидроксипропил)-метакрилоиламидных звеньев формулы 1 в количестве от 60 до 99 мол. % и Nметакрилоилглициновых звеньев формулы 4 в количестве от 40 до 1 мол. %, получают путем сополимеризации N-(2-гидроксипропил)метакриламида с N-метакрилоилглицином или с производными активного N-метакрилоилглицинового эфира, которые описаны в Маkrоmol. Chem. 178, 2159 (1977). R2 может представлять фенилоксигруппу, которая замещена в фенильном кольце одной или несколькими группами, оттягивающими электроны. Примеры подходящих групп, оттягивающих электроны, включают нитро-(-NО2) и галоген. R2 является предпочтительно отщепляемой группой. почтительно при комнатной температуре в течение 15-ти часов; затем конъюгат можно осадить ацетоном, растворить в этаноле и переосадить ацетоном. Например, полимер, в котором R2 представляет (а) остаток активного эфира, обеспеченный при концентрации 14% (вес/об.) в безводном диметилсульфоксиде, обрабатывают производной 20-0-аминоацилкамптотецина формулы 7, в количестве 3% (вес/об.) при комнатной температуре в течение 15-ти часов. Затем добавляют 1-амино-2пропанол, 0,1% (вес/об.), и реакционную смесь поддерживают при комнатной температуре в течение 1 часа. Конъюгат можно осадить ацетоном, затем растворить абсолютным этанолом при концентрации 10% (вес/об.) и осадить опять ацетоном для получения нейтрального камптотецинового конъюгата согласно изобретению. В другом примере полимер, в котором R2 представляет (в) гидрокси, обеспеченный при концентрации 15% (вес/об.) в безводном диметилсульфоксиде, обрабатывают производной 20-0аминоацилкамптотецина формулы 7, 3% (вес/об.), в присутствии 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина, 1,3% (вес/об.) при комнатной температуре в течение 15-ти часов. Затем, чтобы вызвать осаждение, добавляют ацетон, осадок растворяют абсолютным этанолом при концентрации 10% (вес/об.) и опять производят осаждение путем добавления ацетона до получения полимерного конъюгата в соответствии с изобретением. Содержание активного лекарственного вещества, например, камптотецина или его А-кольцевого аналога, в полимерных конъюгатах изобретения определяют НРLС (жидкостной хроматографией высокого давления) или спектроскопическим анализом поглощательной способности. Полимерные конъюгаты камптотецина и его Акольцевые аналоги, описанные в настоящем изобретении, наделены улучшенной водорастворимостью и пониженной токсичностью. Конъюгаты проявляют хорошую водорастворимость, биосовместимость и выделяют камптотецин в плазму или после усвоения в клетки путем ферментативного расщепления. Биологическая активность Сополимер N-(2-гидpoкcипpoпил)мeтaкpиламидa, 20-0-/N-метакрилоилглицил/камптотецина и N-(2-лейцилглицил)камптотецина и N-(2-гидpoкcипpoпил)мeтaкpилoилглицинaмидa (А2) испытывали на голой мыши, которой сделали пересадку рака толстой кишки/НТ29 (табл. 1), и на преждевременно рожденной мыши с запущенной мышиной ретикулоклеточной саркомой М5076 (табл. 2 и 3) в сравнении со свободным камптотецином (СРТ). При сравнении с камптотецином для производной полимерносвязанного камптотецина А2 наблюдали во всех экспериментах более высокую ударную активность. Заслуживает внимания тот факт, что в эксперименте с раком толстой кишки /НТ29 обнаружили вылеченную мышь. Противоопухолевую активность испытывали при той же самой схеме лечения для А2 и СРТ. Следует отметить, что было найдено, что полимерносвязанный камптотецин А2 сильно растворим в воде и растворим в физиологическом в которой L является группой, оттягивающей электроны, например, -NO2 или галогеном, например, фтором или хлором, и m является целым числом от 1 до 5, типично от 1 до 3, предпочтительно 1 или 2. Предпочтительно R2 является р-нитрофеноксигруппой или 2,4-дихлорфеноксигруппой. Предпочтительно реакцию между полимером, в котором R2 представляет (а) остаток активного эфира, и соединением формулы 7 для получения полимерного конъюгата изобретения осуществляют в безводном полярном органическом растворителе, например, диметилформамиде или диметилсульфоксиде. Реакцию можно обычно осуществлять в течение времени от 8 до 24 часов. Реакцию проводят при температуре от 15 до 30°С, предпочтительно при комнатной температуре в течение 15-ти часов; затем можно осуществи ть аминолиз остаточного активного эфира в присутствии 1-амино-2-пропанола при комнатной температуре в течение времени от 0,5 до 1 часа. Этот конъюгат соответственно осаждают ацетоном, растворенным в этаноле, и переосаждают ацетоном. В другом методе, для того чтобы получить полимерный конъюгат изобретения, реакцию между полимером, в котором R2 представляет гидроксигруппу (в), и соединением формулы 7 осуществляют в безводном полярном растворителе, например, диметилформамиде или диметилсульфоксиде в присутствии конденсирующего ве щества, например, 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина. Реакцию обычно можно осуществлять в течение времени от 8 до 24 часов. Реакцию обычно проводят при температуре от 15 до 30°С, пред 4 42706 растворе и его вводили внутривенно, тогда как СРТ растворяли в смеси воды и Тween 80. Получение лекарства и его введение Соединение А2 непосредственно перед использованием растворили в дистиллированной воде и концентрацию проверили спектрофотометрически при 370 нанометрах (ЕI% 57,18). Камптотецин (СРТ) растворили в дистиллированной воде 10% раствором Tween’a. Лечение осуществляли внутривенно в количестве 10 мл/кг массы тела, а контрольную мышь подвергли обработке дистиллированной водой. Опухоли Рак толстой кишки пересадили подкожно швейцарской голой мыши, используя 15-20 мг опухолевых клеток. Мышиную ретикулоклеточную саркому М5076 поддерживали путем последовательных внутримышечных пассажей и подкожной пересадки (5´105 клеток/мышь) сходной мыши C57BI/6. Все животные были от Charles River CaIco, Como, Италия. Использовали 10 обычных мышей/группа и 8 мышей с атимией. Обычные мыши весили от 20 до 22 г и их поддерживали при стандартных лабораторных условиях. Мышин ую колонию при определенном режиме испытывали на отсутствие антител согласно пе речня патогенных микроорганизмов, включая гепатит, Sendai вирус и MycopIasma Pulmonis. Оценка противоопухолевой активности и токсичности Развитие опухоли определяли посредством штангенциркуля, и вес опухоли подсчитывали согласно Gеran et aI. (см.: Саncer Chem. Rep. Part 3,3(2) ed. 3, ррі-103, 1972). Противоопухолевую активность выражали в виде процентного содержания угнетения роста опухоли (% T/I), используя следующую формулу: (средний вес опухоли подвергнутой лечению мыши ) 100 ´ 100 ( средний вес опухоли контрольной мыши ) Среднее увеличение времени жизни (Т/С%) вычисляли, используя следующую формулу: ( среднее время жизни подвергнутой лечению мыши ) ´ 100 ( среднее время жизни контрольной мыши ) Вылеченными мышами были мыши без опухоли в конце эксперимента. Токсичность оценивали на основе уменьшения массы тела и макроскопических данных аутопсии, главным образом с точки зрения уменьшения размера селезенки и печени. Таблица 1 Противоопухолевая активность соединения А2 в сравнении с камптотецином (СРТ) против рака толстой кишки НТ/29 Соединение доза(1) мг/кг А2 CPT 7,5 7,5 ингибирование опухоли 96 83 схема лечения iv q4d´6 iv q4d´6 ТОХ(2) 0/18 0/10 Вылеченные мыши(3) 3/18 0/10 (1) выражено в виде эквивалента CРT (2) количество смертных случаев от токсичности/общее количество/мышей (3) мыши, не имеющие опухоли через 90 дней после имплантации опухоли. Таблица 2 Противоопухолевая активность соединения А2 в сравнении с камптотецином (СРТ) против ранней мышиной ретикулоклеточной саркомы М5076 Соединение доза(1) мг/кг А2 CPT 7,5 7,5 ингибирование(3) опухоли 100 100 схема лечения 1,6,9 1,6,9 Т/С % Токсичн.(2) 171 165 0/10 0/10 (1) выражено в виде эквивалента СРT. (2) количество смертных случаев от токсичности/общее количество мышей. (3)% угнетения роста опухоли оценивали через одну неделю после последней терапии. 5 42706 Таблица 3 Противоопухолевая активность соединения А2 в сравнении с камптотецином (CРT) против прогрессирующей мышиной ратикулоклеточной саркомы М5076. Схема применения внутривенной терапии на 16, 20, 24, 28, 31 и 35 день Соединение доза(1) мг/кг А2 10,0 15,0 7,5 CPT ингибир.(3) опухоли 80 95 72 Т/С % Токсичность (2) 174 183 173 0/10 0/10 0/10 (1) выражено в виде эквивалента СРТ (2) количество смертных случаев от токсичности/общее количество мышей. (3) % угнетения роста опухоли оценивали на 34-ый день. Токсичность Токсичность сополимера N-(2-гидроксипропил)метакриламида, 20-0-/N-метакрилоилглицинаL-фенилаланил-L-лейцилглицил/камптотецина и N-(2-гидpoкcипpoпил)мeтaкpилoилглицинамида (А2) оценивали на здоровых мышах C57BI/F, подвергнуты х внутривенному лечению, в сравнении с камптотецином (СРТ). Значения LD10(1) и LD50(2) для мышей C57BI/F были следующими: Соединение А2 СРТ LD10 мг/кг 129 16,9 творения в воде для инъекции или физиологического раствора. Последующие примеры иллюстрируют изобретение без ограничения его. По всему описанию аминокислотные остатки показаны трехбуквенным кодом, в соответствии с Eur. J. Biochem. 138, 9-37, 1984. Устойчивость полимерных конъюгатов в мышиной плазме или плазме крови человека оценивали следующим образом: к 1 мл мышиной плазмы или плазмы крови человека добавили различные концентрации полимерного конъюгата изобретения А и в соответствующие периоды времени (24, 48, 72, 96 часов) собрали 100 мл пробы и хранили при -70°С до дальнейшей обработки. Каждую пробу экстрагировали путем добавления 100 мл 0,25 М фосфорной кислоты, 500 мл СН3СN и 700 мл этилацетата и энергичного встряхивания в течении 20 минут при 4°С. После этого пробу центрифугировали при 15000´г в течение 10 минут и всплывшее наверх отделили. К остатку добавили 300 мл СН 3СN и 500 мл центрифугировали при 15000´г в течение 10 минут. Всплывшее наверх отделили. Органические фазы объединили и выпарили, используя высоковакуумную центрифугу. Пробу извлекли путем добавления 500 мл МеОН/воды рН 2 (70/30 по объему) и инжектировали в аппаратуру для жидкостной хроматографии высокого давления для определения общего процентного содержания лекарства. Система HPLС Колонна mВоndарак С10 (Waters) 3,9´300 мм Скорость по1,5 мл/мин тока Детектор спектрофотометрическая флюоресценция 650-40 (Perkin Elmer); эмиссия 434 нм (щель 5); возбуждение 370 нм (щель 5) Инжекция 10m л Подвижная 51,5% МеОН; 47,5% воды, фаза 1% фосфорной кислоты. Пример 1 6-N-тритилгексаноил-п-нитрофениловый эфир (8с) (C6H5)3С-NH(CH2)5CO-OC 6H4pNO2 6-Аминокапроновую кислоту (6,5 г, 50 миллимолей), суспендированную в смеси сухо го хлороформа (75 мл) и сухого ацетонитрила (15 мл) добавили к триметилсилихлориду (6,3 мл, 50 мили LD50 мг/кг 151 43,4 (1) LD10: доза, включающая 10% мертвых мышей (2) LD50: доза, включающая 50% мертвых мышей Низкая токсичность производной полимерносвязанного камптотецина А2 дает возможность применять повышенные дозы продукта и достигнуть эквивалентных или улучшенных результатов по сравнению с таковыми с камптотецином. Полимерносвязанные камптотецины обладают противоопухолевой активностью. Они ингибируют топоизомеразу 1. Они пригодны для лечения лейкемии и в особенности опухолей толстой и прямой кишки. Следовательно, можно лечить человека или животного способом, включающим введение им терапевтически эффективного количества полимерного конъюгата изобретения. Таким образом можно улучши ть состояние человека или животного. Диапазон принимаемой дозы зависит от способа применения лекарственного средства, от возраста, веса и состояния пациента, подвергнутого лечению. Полимерные конъюгаты обычно вводят парентеральным путем, например, внутримышечно, внутривенно или в виде шарика. Подходящий диапазон дозы составляет от 1 до 1000 мг камптотецина на М2 площади поверхности тела, например, от 10 до 50 мг/м 2. Полимерные конъюгаты вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем могут образовать лекарственные препараты. Обычно полимерные конъюгаты создают для парентерального введения, например, путем рас 6 42706 молей) и держали под флегмой в течение 2 часов при сильном перемешивании. После этого смесь охладили и добавили один за другим триэтиламин (13,7 мл, 100 милимолей) и тритилхлорид (14 г, 50 милимолей), растворенный в сухом хлороформе (100 мл). Смесь выдерживали при комнатной температуре всю ночь, затем добавили метанол (10 мл) и реакционную смесь концентрировали под пониженным давлением. Остаток промыли холодным 5% водным раствором лимонной кислоты (200 мл) и экстрагировали этилацетатом (200 мл). Органическую фазу отделили и экстрагировали холодным 1 N водным раствором гидроксида натрия (200 мл). Водную фазу отделили, охладили льдом, уксусной кислотой довели рН до 5 и экстрагировали этилацетатом (2´100 мл). Органический растворитель удалили под пониженным давлением для получения 6-N-тритилкапроновой кислоты (16 г) после кристаллизации из этилацетата. Это вещество растворили в безводном тетрагидрофуране (150 мл) и обработали р-нитрофенолом (5,6 г, 400 милимолей) и дициклогексилкарбодиимидом (8,4 г, 40 милимолей) при 0°С в течение 1 часа при перемешивании, затем всю ночь при 8°С. После этого реакционную смесь отфильтровали, охладили при 0°С в течение 2-х часов и фильтровали опять. В конечном счете органический растворитель удалили под пониженным давлением и остаток кристаллизовали этиловым эфиром для получения названного соединения 8с (16,4 г). Осуществили ТLС (тонкослойную хроматографию) на пластинах Kieselgel F245 (Меrсk) и элюировали сиcтему этиловым эфиром/н-гексаном (1:1 по объему) Rf=0,6; FD-MS: m/z/M+H/+495 Н1ЯМР (90 Mh z, CDCI3): 1,1-1,9 (m, 6Н), 2-2,5 (m, 4Н), 5,7-5,9 (m, 2Н, NН-СООН), 7,2-7,7 (m, 15H). Пример 2 20-0-(6-аминогексаноил)камптотецин (7с) Камптотецин (6а, R1=H, 0,7 г, 2 милимоля) растворили в сухом диметилсульфоксиде (100 мл) и добавили к 6-N-тритилгексаноил-п-нитрофениловому эфир у (8с, 2 г, 4 милимоля), полученному, как описано в примере 1, и 4-диметиламинопиридину (0,24 г, 2 милимоля). Реакционную смесь поддерживали при комнатной температуре в течение 48 часов, затем разбавили хлороформом (400 мл) и промыли водой (3´100 мл). Органическую фаз у отделили, сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали до маленького объема под пониженным давлением. Необработанный продукт подвергли мгновенной хроматографии на колонке с кремниевой кислотой при элюировании хлороформом до получения 20-0-(6-N-тритилгексаноил)камптотецина (0,6 г). Осуществили TLC (тонкослойную хроматографию) на пластинах Kieselgel F245 (Меrсk) при элюировании системы хлороформом/метанолом (95:5 по объему) Rf=0,4. N-защищенную производную обработали 95% трифторуксусной кислоты (10 мл) при комнатной температуре в течение 50 минут. После удаления кислоты под пониженным давлением названное соединение 7с собрали этиловым эфиром. Выход составил 0,4 г. Осуществили тонкослойную хроматографию на пластинах Kieselgel F245 (Меrсk) при элюиpoвaнии системы метиленхлоридом/метанолом/уксусной кислотой/ водой (80:20:7:3). Rf=0,6 FD-MS: m/z /M+H/+ 462. Пример 3 20-0-(L-фенилаланил-L-лейцилглицил)камптотецин (7в) 7b N-тритил-L-фенилаланил-L-лейцилглицил-пнитрофениловый эфир (8а, 1,4 г, 2 милимоля), полученный, как было ранее описано в заявке Великобритании № 9309663.4, камптотецин (6а, R1=H, 0,35 г, 1 милимоль) и 4-диметиламинопиридин (0,12 г, 1 милимоль) растворили сухим диметилсульфоксидом (50 мл) и перемешали при комнатной температуре в течение 20 часов. После этого реакционную смесь разбавили хлороформом (400 мл) и промыли водой (3´100 мл). Органическую фаз у отделили, сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали до маленького объема под пониженным давлением. Необработанный продукт подвергли мгновенной хроматографии на колонке с кремниевой кислотой при элюировании смесью хлороформа и метанола (99,5/0,5 по объему). Собрали фракции, содержащие N-защищенную производную названного соединения, концентрировали до остаточного влагосодержания, растворили в 75% водном растворе уксусной кислоты (30 мл) и поддерживали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь обработали твердым кислым углекислым натрием до рН 7 и экстрагировали хлороформом (400 мл). После удаления органического растворителя названное соединение 7в выкристаллизовали из этилового эфира. Выход составил 0,16 г. Осуществили тонкослойную хроматографию на пластинах Kieselgel F245 (Меrсk) при элюировании системы хлороформом/метанолом (9:1 по объему). Rf=0,35 PD-MS: m/z /M+H/+ 667 1 Н-ЯМР (400 MHz, CDCI3) d: 0,81 (g, J=6,5 Hz, 3Н, d-Leu), 0,82(g, J=6,6 Hz, 3Н, d'-Leu), 0,98 (т, J=7,6 Hz, 3Н, СН3-СН2), 1,25 (м, 1Н, b-Leu), 1,39 (м, 1Н, -Leu), 1,56 (м, 1Н, b'-Leu), 1,98 (gg, J=6,4 Hz, J=13,5 Н z, 1Н, b-Рhе), 2,1-2,4 (м, 2Н, СН2CH3), 2,48 (g, J=7,0 Hz, 1H, NН-Рhе), 2,77 (gg, J=4,7 Hz, J=13,5 Hz, 1Н, b'-Phe), 3,41 (м, 1Н, aPhе), 4,0-4,3 (м, 3H, a-GIу+a'-GIy+a-Leu), 5,20-5,27 (gg, J=19,9 Hz, 2Н, 5-СН2), 5,41-5,68 (gg, J=17,3 Hz, 2H, 17-CH2), 6,35 (т, J=5,3 Hz, 1H, NН-GIу), 6,76 (g, J=7,6 Hz, 1Н, NH-Leu), 6,8-7,3 (м, 21Н, 4x(C6H5)+ 14-H). Пример 4 9-амино-20-0-(L-фенилаланил-L-лейцилглицил)камтотецин (7с) 7с 7 42706 N-тритил-L-фенилаланил-L-лейцилглицин-пнитрофениловый эфир (8а, 1,14 г, 2 милимоля), 9аминокамтотецин (6в, R=NH2, 0,363 г, 1 милимоль), 4-диметиламинопиридин (0,12 г, 1 милимоль) провзаимодействовали в сухом диметилсульфоксиде (20 мл) при комнатной температуре, как описано в примере 3, до получения названного соединения 7с (0,31 г). Осуществили тонкослойную хроматографию на пластинах Kieselgel F245 (Меrсk), систему элюировали хлороформом/метанолом (9:1 по объему) Rf=0,2 FD-MS: m/z /M+H/+ 682, 1Н-ЯМР (400 MHz, CDCI3) d: 0,82(g, J=6,5 Hz, 6Н, d-Leu+d'-Leu), 1,00 (т, J=7,6 Hz, 3Н, СН2СН), 1,25 (м, 1Н, b-Leu), 1,41 (м, 1H, -Leu), 1,59 (м, 1Н, b-Leu), 1,99 (gg, J=6,2 Hz, J=33,5 Hz, 1Н, b-Phe), 2,1-2,4 (м, 2Н, СН2СН3), 2,47 (g, J=6,5 Нz, 1Н, Nh-Рhе), 2,79 (gg, J=4,7 Hz, J=13,5 Hz, 1H, b-Phе), 3,43 (м, 1Н, a-Phе), 4,04-4,3 (м, 5Н, 9-NН2+a-Leu+a-GIу+a'-GIу), 5,04-5,15 (gg, J=19,9 Hz, 2Н, СH2), 5,39-5,66 (gg, J=17,0 Hz, 2H, 17-CH2), 6,44 (т, J=5,3 Нz, 1H, NH-GIy), 6,81 (g, J=7,7 Hz, 1H, NH-Leu) 6,85 (м, 3Н, 10-H+ 7,04-7,4 (м, 19H, 3x(C6H5)+ ном (50 Мл) до получения названного конъюгата AI (0,14 г), содержащего 5% (вес/вес) камптотецина. После инкубации плазмы конъюгат AI выделил через 120 часов 10% камптотецина. Пример 6 Сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида, 20-0-/N-метакрилоилглицил-L-фениланилL-лейцилглицил/камптотецина и N-(2-гидроксипропил)метакрилоилглицинамида (А2: х=96, у=2,2, z=1,8) -), -+14-H), 7,51 (м, Сополимер N-(2-гидpoкcипропил)мeтилaкpиламида и N-метакрилоилглицин-п-нитрофенилового эфира (0,15 г, содержащий 2,7´103 эквивалентов п-нитрофенилового эфира) и 20-0-(глицил-Lлейцил-L-фенилаланил)камптотецин (7в, 20 мг), полученный, как описано в примере 3, провзаимодействовали в сухом диметилсульфоксиде (1 мл), затем с 1-амино-2-пропанолом, как описано в примере 6, до получения названного конъюгата А2 (0,14 г), содержащего 4,8% вес. камптотецина. После инкубации плазмы конъюгат А2 через 60 часов выделил 100% камптотецина. Пример 7 Сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида, 9-амино-20-0-N-метакрилоилглицил-L-фенилаланил-L-лейцилглицил/камптотецина и N-(2гидроксипропил)метакрилоилглицинамида (А3: х=96, у=3, z=1). 1Н, 11H). Пример 5 Сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида, 20-0-/N-метакрилоилглицил-(6-аминогексаноил/камптотецина и N-(2-гидроксипропил)метакрилоилглицинамида (АІ: х=96, у=3, z=1) Сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида и N-метакрилоилглицин-п-нитрофенилового эфира (0,15 г), полученного, как описано в МаkromoI. Сhem., 178, 2159 (1977), и содержащего 2,7´103 эквивалентов п-нитрофенилового эфира, провзаимодействовал с 20-0-(6-аминогексаноил)камптотецином (7с, 18 мг), полученным, как описано в примере 2, в сухом диметилсульфоксиде (1 мл) при комнатной температуре в течение 18 часов, затем с 1-амино-2-пропанолом (2 мл) в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого реакционную смесь обработали ацетоном (70 мл). Осадок собрали, опять растворили в безводном этаноле (5 мл) и повторно осадили ацето Названный конъюгат получили путем взаимодействия сополимера N-(2-гидроксипропил)метакриламида и N-метакрилоилглицин-п-нитрофенилового эфира (0,15 г, содержащий 2,7´103 эквива 8 42706 лентов п-нитрофенилового эфира) и 9-амино-20-0(Глицил-L-лейцил-L-фенилаланил)камптотецина (7с, 20 мг, полученного, как описано в примере 4, в сухом диметилсульфоксиде (1 мл), затем с 1амино-2-пропанолом, как описано в примере 5. Выход продукта, содержащего 6,3% вес/вес 9аминокамптотецина, составил 0,14 г. После инкубации плазмы конъюгат A3 через 50 часов выделил 100% камптотецина. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 9