Спосіб подрібнення рослинної тканини для виділення днк

Винахід відноситься до біотехнології і може мати широке використання при проведенні паралельної оцінки селекційних форм на генотиповому та фенотиповому рівнях. В методологічній практиці молекулярної генетики виділення ДНК є ключовим моментом, що визначає якість та швидкість наступних видів аналізу, зокрема полімеразної ланцюгової реакції. Зазвичай, об'єктом виділення виступають етиольовані паростки, тканини яких досить м'які і не потребують надмірних зусиль для досягнення майже повної мацерації клітин і, як наслідок, виходу ДНК в розчин у достатній кількості. Крім того, у паростків на одиницю площі приходиться значно більша кількість клітин, що також підвищує вихід ДНК. Перетирання паростків здійснюють вручну за допомогою скляного пестика, у лізуючому буфері. Все більше сучасних досліджень, зокрема маркування агрономічно-цінних ознак, генів стійкості до хвороб, шкідників і т.п., грунтуються на вивченні фенотипової мінливості певних генотипів рослин у зв'язку з успадкуванням ДНК-маркерів. Такий підхід потребує генотипування методами ПЛР саме тих рослин, для яких був встановлений фенотип. Тому для виділення ДНК рослинну тканину відбирають в волі, зазвичай з листя, клітини якого, на відміну від паростків, мають менший вміст ДНК і більш стійки до перетирання. Найбільш близьким до поданого винаходу (прототипом) є спосіб (F. Guidet A powerful new technique to quickly prepare hundreds of plant extracts for PCR and RAPD analyses // Nucl. Ac. Res., 1994, -Vol.22, N9, -P.1772-1773), згідно якому рослинну тканину подрібнюють у епендорфах за допомогою пластикового наконечника об'ємом 1мл, тонкий кінець якого розрізаний і загнутий з одного боку у вигляді лопасті. Інший кінець закріплюється у вортексі. На великих обертах (декілька тисяч на хвилину), тканина краще розбивається ніж за умов ручного тертя. Недоліками цього способу являються: - матеріал, з якого зроблений наконечник, є досить м'яким і дозволяє лише поверхнево подрібнити рослинну тканину, що значно зменшує вихід ДНК; - обертовий рух лопасті призводить до розкидання рослинної тканини з епендорфу і розбризкування лізуючого буферу; - лопасть розташовується перпендикулярно осі епендорфа, що не дозволяє перетирати тканину, зосереджений у нижній частині пробірки; - такий гомогенізатор часто потрібно замінювати, оскільки він ламається, а також не зручний для стерилізації, що може призводити до засмічення зразків. З метою усунення вказаних недоліків, пропонується спосіб виділення ДНК за допомогою гомогенізатора, закріпленого у вортексі. В основу винаходу поставлено задачу в способі виділення ДНК шляхом автоматизованої гомогенізації рослинних тканин забезпечити підвищення виходу ДНК та скорочення термінів проведення стадії виділення. Поставлена задача вирішується в способі виділення ДНК з рослинної тканини з гомогенізатором із скляного пестика, зашліфованого з одного кінця. Відмінними від прототипу ознаками у винаході, що заявляється, є: - відносна міцність та жорсткість гомогенізатора; - діаметр скляного пестика дозволяє перетирати тканину, зосереджену на різних рівнях пробірки; - однорідна поверхня дозволяє промивати і стерилізувати гомогенізатор від залишків попереднього зразка та лізуючого буферу; - значно менші витрати часу на перетирання одного зразка; Спосіб забезпечує високу ретельність та можливість оцінки великої кількості зразків, не потребує наявності коштовного обладнання та реактивів. Це експресний спосіб, оскільки на перетирання одного зразка витрачається 1-2 хвилини. Спосіб здійснюється таким чином: 1. Вортекс закріплюється на штативі обертовою частиною донизу. 2. Скляний пестик закріплюють у зажим вортексу, в який попередньо вставлено резинову муфту, щоб запобігти розлому скла. 3. Заморожену рослинну тканину опускають у лізуючий буфер (0,5 необхідного об'єму), щоб запобігти його розбризкування. Решта додається після закінчення гомогенізації. Для надання абразивних якостей у буфер додається АІ(ОН)з. 4. Пробірку підносять до гомогенізатора і занурюють його у розчин з рослинною тканиною. Вортекс вмикається на 4-6тис. об./хв, і гомогенізатор шляхом тертя об стінки та дно пробірки подрібнює матеріал. Оскільки пробірка тримається в руках, виконавець може свідомо змінювати нажим, вугол, швидкість обертів та контролювати ступінь подрібнення матеріалу. 5. Далі виділення ДНК проводять за стандартною методикою. Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1 Виділяли ДНК з листя інбредних ліній кукурудзи. Вибірка складала 30 зразків. Гомогенізація цих зразків тривала близько години. Класичний спосіб дозволяв подрібнити таку кількість зразків за 2,5 години. Приклад 2 Здійснювали виділення ДНК з листя генотипів популяції кукурудзи (ГК26хМо17)F2. Вибірка складала 180 рослин. Кількість зразків на одну партію становила 18, за кількістю місць центрифуги. Час гомогенізації такої кількості зразків становив близько 40 хвилин. Попередні засоби дозволяли брати у один аналіз максимум половину зразків, з огляду на те, що термін інкубації для першого і останнього зразків був надто різний, що відображалося на якості виділеної ДНК. Загальний час гомогенізації становив близько шести годин, що, приблизно, втричі швидше за традиційний спосіб.