Спосіб культивування вищого базидіального гриба pleurjtus ostreatus (fr.) kumm

МЯ С б С 12 N 1/14 12 N 1/38 12 N 9/02 с с СПОСІБ КУЛЬТИВУВАННЯ ВИЩОГО БАЗИДІАЛЬНОГО ГРИБА PLEUR0TU3 OSTREATUS (FR.) KUMM Винахід відноситься до мікробіологічної, гідролізної та комбікормової промисловості і може бути використаний у біологічних процесах одержання окислюючих ферментних систем, біохімічної трансформації вторинних рослинних ресурсіЕ, шляхом культивування на них вищих базидіальних грибів. При культивуванні базидіальних грибів, крім універсальних поживних середовищ, зокрема, таких як пивне сусло або картопляно-глюкозне середовище (Семенов СМ. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. - М.: ИоД-во Агрспромиздат, 1990. - 239 с), використовують спеціальні середовища, які містять у своєму складі мальц-arap з відваром дубової кори, глюкозо-глютаміновий агар, агар з вишневим відваром, відвар з ростків пшениці, вівсяний відвар, агар Мадесса, КОН-агар, агар Вишняківської, агар Планкетта та інші (Бухало А.С. Высшие сьедобные базидиомицеты в чистой культуре. Киев: Наук.думка, 1988. - 144 с). Проте, ці чи інші поживні середовища призначені, як правило, для виділення, збереження і вивчення морфології культур вищих базидіоміцетів. Для вирощування вищих базидіальних грибів - продуцентів окислюючих та інших ферментних систем, використовують спеціальні поживні середовища, які містять у своєму складі індуктори окремих ферменті? і відрізняються ьа своїм складом в залежності від конкретних біст^хпологічних цілей одержання кінцевого продукту (А.с. 1141754. ССОР. Питательная среда для г.ыращивания базидиомицетов / Дудка К. А. Вечер А.С., Соломко Е.Ф. и др. Заявка N 3575603 от 04.02.83, М.кл. С 12 N 1/14.; А.с. 1103551. СОТ. Способ получения комплекса лигнолитических ферментов /Семичаевский В.Д., Даниляк Н.И., Портнова Л.В Заявка N 3462784 от 02.07.82, М.кл. С 12 N 9/00.) Описані також способи культивування базидіоміцетів з використанням поживних середовищ, які містять v своєму складі жом цукрових буряків, гідрол - побічний продукт виробництва глюкози, а також мінеральні солі та воду. Використання такого поживного середовища пе ррдбачає, переважно, одержання окислюючих ферментних систем (А.с. 1499736.СССР. Питательная среда для глубинного культивирования съедобного гриба Pleurotus ostreatus (Fr. ) Kuinm. /Осовик А.Н. Гавриленко М.П. , Гридина Л.Е. и др. Заявка N 4300672 от 27.09.87, М.кл. А 01 N і/043). З метою одержання композицій ферментних систем які мають у , своєму складі високоактивні целюлази, монофенол-монооксигенази, для використання у гідролітичних процесах складних субстратів в харчовій промисловості або при переробці відходів лісової і деревооброб ної промисловості та сільського господарства, запропоновані способи культивування базидіоміцетів на поживних середовищах, з наявністю у своїй поживній композиції целюлози у РИГЛЯДІ відходів паперу або соломи, екстракту жому цукрових буряків і гідрол (А.с. 1068477. СССР. Способ получения комплекса ферментов / Семичаевский В.Д., Мельничук Г.Г., Трутнева И.А. Заявка N 3422521 от 17.07.82 М.кл. С 12 N 9/00. БИ N3 1984.). Відомо про спосіб культивування вищих базидіоміцетів з вико ристанням поживних середовищ, які містять в собі мінеральні солі і воду, а субстанцією джерела вуглецю є ліофілізований сік зеленої маси люцерни, технологічна регламентація якого передбачає підвищення активності монофенол-монооксигеназ та пероксидаз, при збереженні целюлазної активності (А.с. 132501. ССОР. Питательная среда для культивирования базидиальных грибов / Сытник К.М., Новиков Ю.Ф., Даниляк Н.И. и др. Заявка N 3971643 от 28.10.85, М.кл. С 12 N 1/14, С 12 N 9/00. БИ N 27, 1987.). 3 метою спрощення та здешевлення технологічного процесу одержання комплексу позаклітинних ферментних систем, переважно окислюючих, запропоновано поживне середовище і спосіб культивування базидіальних грибів, де чинником джерела вуглецю служить агрімус - відходи ьиробництва фурфуролу, які містять v своїй складі целолігнін і вільний фурфурол. В залежності від біотехнологічної мети для одержання переважно пероксидази або монофенол-монооксигенази. використовують різні концентрації агрімусу (А.с. 1084299. СССР. Способ получения комплекса внеклеточных ферментов /Семичаевский В.Д Даниляк Н.И., Трутнева И.А. Заявка N3520061 от 07.04.84, М.кл. С 12 N 9/02) 3 метою інтенсифікації процесів синтезу ферментів і спрощення способів культивування вищих базидіоміцетів відомо також про спосіб з використанням v поживних середовищах флаваноїдів, одержаних шляхом екстрагування соняшникового лушпиння, гречкової соломи або квітів сальвії. При цьому екстракт попередньо сорбують на твердих поживних носіях органічного походження (А.с. 1137758. СССР. Способ получения комплекса ферментов / Семичаевский В.Д., Даншіяк Н.И., Мельничук Г.Г. и др.Заявка П 3586762 от 05.05.83, М.кл. С 12 N9/00) Для зміни органічних компонентів поживних середовищ харчового і продовольчого призначення, запропоновано використовувати не вуглеводні джерела вуглецю в поживних середовищах, а аліфатичні спирти, н - алкани, органічні кислоти трикарбонового циклу (Sugimori T Оуата Y., Omichi Т. Studies on Basidiomycetes. Production of mycelium and fruit body from nonocarbohydrate organic substrates / I. Ferment. Technol.-1971.-49, N5.-P.435-446.). Відомий також спосіб культивування базидіальних грибів в якому було запропоновано додавати до поживного твердого або рідкого середовища автолізат сахароміцетових грибів (дріжджів), який виступає, в данному випадку, як стимулятор біосинтезу. [Прототип)(Возняковская Ю.М. Проблемы микоризы и ее практическое значение // Микробиология. - 1954.- 23. N;?. 0.204-208.). Поживні середовища, в котрі було внесено автолізат сахароміцетових грибів або проміжні екстракти, отримані з нього, володіють найбільшою універсальністю за охопленням видового складу мікроорганізмів, а також підвищеною метаболічною активністю. Проте, використання в біологічних процесах автолізату сахароміцетових грибів або його екстрактивних модифікацій обмежено у , практичному виконанні багатьма недоліками зокрема: біологічною , нестабільністю автолізату і 'його екстрактивних модифікацій; високою адаптивністю до контамінації; локальністю технологічного використання таких продуктів за місцем культивування сахароміцетів; недостатньою технологічною регламентованістю якості товарного продукту автолізату або його екстрактів. Причина, що перешкоджає інтенсифікації процесу біосинтезу екзоклітинних окислюючих ферментів, це те, що сахароміцетові гриби є стимулятором росту біомаси, проте не є індуктором окремих ферментних систем, зокрема оксидаз. В основу винаходу поставлено задачу удосконалення способу культивування вищого базидіального гриба Pieurotus ostreatus (Fr.) Kumm. шляхом використання запропонованих технологічних прийомів та параметрів процесу. Технічний результат, що виникає внаслідок використання винаходу, полягає в інтенсифікації процесу біосинтезу екзоклітинних окислюючих ферментних систем, зокрема оксидаз, та підвищенні ступеню ферментативної делігнїфікації рослинних субстратів культурами вищих базидіальних грибів. Споживчі властивості, які зв'язані з технічним результатом по -4 лягають в тому, що запропонований спосіб дозволяє високоефективно використовувати лля культивування вищих базидіальних грибів вторинні рослинні ресурси. Досягається технічний результат тим, що в способі культивування вищого базидіального гриба Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm., що передбачає внесення в рі яке або тверде вуглеводне середовище по ЖИЕНИХ речовин, посівного матеріалу та стимулятора біосинтезу як , стимулятор біосинтезу використовують фракцію головну етилового спирту (ФГЕО), яку надають одночасно з посівним матеріалом в кількості 0,04-0,05& від водної фази середовища. Фракція головна етилового спирту, яка міститься в спирті-сирці, є побічним продуктом основного виробництва етанолу і представляє собою спиртовий розчин головних домішок. Фракцію голону етилового спирту одержують внаслідок перегонки-ректифікації продуктів бродіння сахароміцетів, що відповідає (ТУ 18-401-97) і характеризується таким компонентним складом: Етиловий спирт, об.% - 94-95; метиловий спирт, об.? - 0.01-0.04; альдегіди (масова концентрація), г/л - 26,5-27,5; кислоти і масова концентрація ), г/л - 0,1-0,3; ефіри імасова концентрація), г/л - 6,8-7,2: вищі спирти (масова концентрація), г/л - 0,9-1,0. Відомо, що л і гні н не є індуктором окислюючих ферментів проте , його вихідні мономери з групи коричних спиртів або аналогічні про дукти можуть стимулювати утворення оксидаз (Kirk Т.К., Fenn P. Formation and action of the і igriolytic system in basidiomyces ' ' иг О^І! І ^_ Л ( ГІ і ' C L D l'.iiUiby _ со. і~,. . і_'аіиі_»і . и Г і І У . Г і . , І dub. г. Of Уи ) . Таким чином, об'ективним механ і змом і ндукці ї ферментних систем , зокрема оксидаз, фракцією головною етилового спирту є наявність у и складі компонентних радикалів і структурних груп, близьких компонентам деполімеризованого лігніну. Враховуючи фізико-хімічні властивості компонентного складу фракції головної етилового спирту , тобто її леткість і температурну лабільність, останню, до поживних середовищ додають після стери лізації, разом з посівним матеріалом. Експериментальним шляхом встановлено, що оптимальною є кількість фракції головної етилового спирту 0,04-0,05% від водної фази середовища. Заявлений спосіб здійснюють таким чином, тобто, культивування вищого базидіального гриба Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm. на рідкому або твердому вуглеводному середовищі, що передбачає внесення в середовище поживних речовин, посівного матеріалу та стимулятора росту, де чинником останнього служить фракція головна етилового спирту, яку ьносять одночасно о посівним матеріалом в кількості 0,04 0,05% від водної фази рідкого або твердого середовища. Запропонований спосіб ілюструється прикладами. Приклад N !_ Рідке поживне середовище - екстракт виноградних вичавок (EBB) готують шляхом кил'ячіння протягом 20 хвилин сухих виноградних вичавок з водою у співвідношенні 1:3, з розрахунку 1,0-1,5% відновлюючих цукрів в екстракті, доводять рН до 5,5-5,6 розчином КОН, розливають по 50 мл Б колби Ерленмейера ємкістю 0,5 л 1 стерилізують гостэсю трою протягом 30 хгилин при 0.1 МПа. В колби, охолоджені до кімнатної температури стерильно вносять піпеткою фракцію головну етилсг.ого спирту і засіьають культурою вешенки - Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm. ИЕК-1019. Контролем в цьому досліді було поживне середовище без фракції головної етилового спирту. Результати досліду наведені в табл.і. Таблиця 1 І Монофенол-монооксидазна активність, мкм-хв"1-мл"1 Біомаса, г/л Умови досліду 'ривалість культивування, доба 1. Контроль: EBB 2. Дослід: EBB + 0,02% ФГЕС 3. Дослід: EBB + 0,05% ФГЕС 4. Дослід: EBB + 0,2% ФГЕС 5.8 0,136 I 6, 7 1,56 2,76| 0,08 4,51 2,16 3,34! ,6 | 5,6 0,03 __ 0, 0/-о 6,5| 1,98 3,25! 0,112 0,560 5,5 6,5! 1,79 3,26 0,032 0,224 З викладених в табл.і результатів досліду виникає, що внесена v поживне середовище фракція головна етилового спирту призводить до значного збільшення активності позаклітинної монофенол-монооксидази оБ культуральній рідині. Відсутність суттєвих L'MiH pH і приросту біомаси v контрольному середовищі і при внесенні у поживне середовище фракції головної ^тилового спирту, свідчить про індуктивний характер її дії на синтез монпфенол монооксидаз. Оптимальною концентрацією фракції головної етилового спирту у поживному середовищі при цьому є 0,04-0,05% від об'єму рідкого поживного середовища. Приклад N 2 Універсальність д і ї фракції головної етилового спирту на біо синтез монофенол-монооксидази перевірена на "багатому" органічному і мінеральному сер^довищач з лігноцелюлозним джерелом вуглеідо. Першим поживним середовищем було пивне СУСЛО 5° СР. Для другого поживного середовища використовували так зване середовище Наркранс, яке складається з таких сполук, г/л: N4H2PO4 ?,0; КН2РО4 - 0,6; KcHPOj - 0,4; MgS04 -0,5, до якого додавали роздроблене соняшникове лушпиння в кількості ЇХ. Стерилізацію, внесення фракції головної етилового спирту і по сів чистої культури ПРОВОДИЛИ гтідно умов, викладених у прикладі N1. Результати досліду приведені в табл.2. Таблиця 2 Біомаса, г/л РН Монофенол-монооксидазна активність, мкм-хв"1 мл~Умови досліду Тривалість культивування, доба З 1 Контроль: . пивне сусло 2 Лослід: пивне . сусло+0,04% ФГЄС 6.3 6,4 4,25 14,23 І 0.280 0,373 6,2 6.5 4,76 12,90 | 0,373 1,120 0,46 0,71 0,041 0,067 0,39 0,82 0,211 о, 3. Контроль: середовище Наркранс ] 5,3 6,4 4. Дослід: середовище Наркранс + 0.04% ФГЕС 6,05 -7 Отримані експериментальні дані свідчать про універсальність дії фракції головної етилового спирту в ролі індуктора оксидаз ве шенки звичайної (Pleurotus estreat us (Fr.) Kumm., ИБК-1О19), Приклад N З Вивчали біологічну дію етилового спирту, який складає значно велику кількість фракції головної етилового спирту - 94-95%, для чого вирощували культуру вешенки на екстракті виноградних вичавок з фрацією головной етилового спирту. У дослідному варіанті вносили рівний об'єм спирту ректифікату, тобто спирту, в якому, практично, відсутня фракція головна етилового спирту. Результати досліду викладені в табл.З. Таблиця З Біомаса, г/л рН I Монофенол-монооксигеназная активність, МКМ-ХБ-1'МЛ"1 Умови досліду Тривалість культивування, доба 1. Контроль: EBB + 0,05% ФГЕС 2. Дослід: 6,5 ФГЕС + 0,05% етанола, 96 об.% | 6,5 7,1 6,7 |1,16 |1,08 3,02 2,90 0,037 0, 0,56 0,073 Як виникає з одержаних результатів, етиловий спирт не наділений стимулюючими властивостями процесів біосинтезу окислюючих фер ментних систем міцелію вишенки. Все це свідчить про наявність фізіологічної активності у фракції головної етилового спирту і її су купного компонентного складу. Приклад N 4 Оскільки фракція головна етилового спирту складається з летких речовин з температурою кипіння 37-75°С і містить у своєму складі реакційно здатні групи сполук, вивчали оптимальний спосіб внесення Фракції головно"! етилового спирту в залежності від стадії підготовки середовища і росту біомаси. Культивування проводили на екстракті виноградних вичавок згідно пропису за прикладом N 1. Результати досліду представлені в табл.4. Таблиця 4 |Монофенол-моноВіомаса, г/л Іоксигеназна активність, РН Умови культивування МКМ'ХВ"1-МЛ"1 Тривалість культивування, доба і__ З 3. Внесення ФГЕС до автоклав у ванн я EBB 7,2 + 0,05% ФГЕС Внесення ФГЕС після автоклавування EBB + 0,05% ФГЕС Внесення ФГЕС в 6,5 період фази експоненціального росту на 3-ю добу культивування 6,45 7,7 2,8 0,072 0,034 7,1 о по и*о, 0,56 0,037 070 7,8 | 1,36 З,0І| 0,033 0,3і Одержані результати свідчать про те, що внесення фракції головної етилового спирту до автоклавування поживного середовища призволить до втрати її індуктивних властивостей В той же час, . внесення фракції головної етилового спирту в культуру вешенки на стадії експоненціального росту не перевищує рівня активності монофенол-монооксигенази, виявленого при внесенні грації головної етилового спирта після автоклавування,тому найбільш технологічним є внесення фракції головної ^тилового спирту до середовища одночасно з посівним матеріалом. Приклад N 5 Як це видно з табл. 1-4, внесення фракції головної етилового спирту в кількості 0,05% до рідких поживних середовищ для глибинного культивування вищих базидіоміцетів призводить до суттєвої інтенсифікації процесів ферментоутворення. З метою розширення діапазону біотехнологічних можливостей використання фракції головної етилового спирту проведена перевірка ефективності її використання в умовах твердофазної ферментації. Виноградні вичаьки (ВВ) вносили в колби Ерленмейера, заливали Бодопроводною водою v співвідношенні 1:3 від ваги виноградних Бичавок, стерилізували гострою парою ЗО хвилин при 0,1 МПа, охолоджували до кімнатної температури і засівали чистою культурою Pleurotus Cot г cat ur- (Fr.) Кит. ИЕК-1010, яка слугувала контролем. У дослідному варіанті одночасно з посівом культури вносили фракцію головну етилового спирту з розрахунку 0,05% від водної фази субстрату. Культивування проводили при 27°С протягом 10-ти діб. Після висушування взірців до постійної ваги визначали втрату ваги основних полімерних компонентів виноградних вичавок (табл. 5.). Таблиця 5 Умови досліду| Один. виміРУ 1 ВВ, компонентний склад 2 ВВ, конт. роль 3 ВВ +0,05% . ФГЕС Примітка Лігніні Еконоі мічний коеф-т (ЕК) 7 Z мг/г % мг/г 12 67 1 6 8 7 - втрати ,4 — ,5 »* ' 10,47 ,68 ,5 31,8 ваги взірців Полісахариди, які легко гідролізуються (ЛГ) лг+вг Полісахариди, які гідролізуються важко (ВГ) 15,9 12,7 19,8 31,5 25,8 41,0 10,0 12,7 14,3 18,2 1 1 ОО Р, 29,8 44,2 40.1 59,2 ; за рахунок виділення С0; Г10% - ЕК економічний коефіцієнт - % перетворення субс трату в біомасу. -1 0 Результати експерименту свідчать про те, ідо при твердофазному культивуванні рослинних субстратів фракція головна етилового спирту зберігає свої індивідуальні властивості по відношенню до системи окислюючих ферментів. Це призводить до підвищення ступеня делігніфікації клітинних стінок виноградних вичавок і полегшує доступ гід ролітичних систем до полісахаридів , які легко або важко гідролізуються. Таким чином, як видно з наведених прикладів застосування , фракці'ї головної етилового спирту як індуктора оксидаз в заявлених умовах є ефективним як для рідкого середовища, так і в умовах твердофазної ферментації.